PLoS ONE: Struktur-aktivitet relationer af syntetisk 2-Phenylnaphthalenes med hydroxylgrupperne, som hæmmer spredning og inducere apoptose i MCF-7 Cancer Cells

Abstrakt

I denne undersøgelse seks 2-phenylnaphthalenes med hydroxylgrupper blev syntetiseret i høje udbytter ved demethylering af de tilsvarende methoxy-2-phenylnaphthalenes, og en 2-phenylnaphthalen med en aminogruppe blev opnået ved hydrogenering. Alle de 2-phenylnaphthalen derivater blev bedømt for cytotoksicitet, og struktur-aktivitetsforhold (SAR) mod human brystcancer (MCF-7) celler blev også bestemt. SAR Resultaterne viste, at cytotoksicitet blev markant fremmet af hydroxylgruppen ved C-7-stillingen i naphthalenringen. Indførelsen af ​​hydroxylgrupper ved C-6-stillingen i naphthalenringen og C-4′-stillingen i phenylringen temmelig forbedret cytotoksicitet, men indførelsen af ​​en hydroxylgruppe ved C-3 stillingen i phenylringen faldet en smule cytotoksicitet. Samlet, 6,7-dihydroxy-2- (4′-hydroxyphenyl) naphthalen (PNAP-6h) udviste den bedste cytotoksicitet, med en IC

50-værdi på 4,8 uM imod MCF-7-cellelinje, og viste lav toksicitet mod normale humane mammae epitelceller (MCF-10A). PNAP-6h førte til celle standsning på S-fasen, formentlig på grund af stigende niveauer af p21 og p27 og mindsker niveauet af cyclin D1, CDK4, cyclin E og CDK2. Desuden PNAP-6h faldt CDK1 og cyclin B1 udtryk, mest sandsynligt fører til G

2 /M anholdelse, og inducerede morfologiske ændringer, såsom nuklear svind, nuklear fragmentering, og nuklear hypercondensation, som observeret af Hoechst 33342 farvning. PNAP-6h induceret apoptose, sandsynligvis ved at fremme Fas-ekspression, forøgede PARP-aktivitet, caspase-7, caspase-8 og caspase-9-ekspression, Bax /Bcl-2-forhold, og phosphoryleringen af ​​p38, og reducerede phosphorylering af ERK. Denne undersøgelse giver den første demonstration af cytotoksicitet PNAPs mod MCF-7 celler og belyser den mekanisme bag PNAP-induceret cytotoksicitet

Henvisning:. Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang TH (2015) Struktur Aktivitet Relationship af syntetisk 2-Phenylnaphthalenes med hydroxylgrupperne, som hæmmer spredning og inducere apoptose i MCF-7 cancerceller. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10,1371 /journal.pone.0141184

Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institut for Biokemi og Bioteknologi, TAIWAN

Modtaget: 13 juli, 2015; Accepteret: 6 oktober 2015; Udgivet: 22 okt 2015

Copyright: © 2015 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: forfatterne vil gerne takke Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (mEST 103-2320-B-039-027-; MOST 103-2113-. M-039-003- og mEST 103-2738-M-039-001-), Kina Medical University (CMU103-N-05), og dels, at tilskuddet fra den kinesiske medicin Research center, China Medical University (ministeriet Undervisningsministeriet, Sigt efter Top University Plan) om økonomisk støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Brystkræft er den mest almindelige årsag til kræft død hos kvinder; derfor, at finde en ny og effektiv anticancermiddel er bydende nødvendigt. Naphthalenderivater vise kraftig anti-arytmi, anti-tumor, og antioxidant aktivitet [1]. Farmakologisk, 2-phenylnaphthalenes (PNAPs) har lignende rumlige og konformationelle krav til genistein (en isoflavone) og udviser en lang række biologiske og biomedicinske virkninger [2]. Kemisk, 1-substitueret naphthalen, ikke 2-substitueret naphthalen, opnås ved den elektrofil aromatisk substitution af naphthalen. Så vidt vi ved, undersøgelser af forholdet mellem struktur og cytotoksicitet af multi-substituerede PNAPs er sjældne. I denne undersøgelse syntetiserede vi usubstitueret PNAP-1, syv methoxy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), seks tilsvarende hydroxy-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h), og en amino-PNAP (PNAP-8h) og undersøgte deres anticancer struktur-aktivitet-relationer og virkningsmekanismer i MCF-7-cellelinje.

Flere undersøgelser har vist, at genistein og forbindelser med phenyl-1-benzopyran-4-on rygrad hæmmer væksten af cancerceller via cellecyklusstandsning og induktion af apoptose [3-5]. Cyclin-cyclin-afhængig kinase (CDK) komplekser er de vigtigste regulatorer af cellecyklus, hvilket er en meget kompleks og stramt reguleret proces [6,7]. G

1 /S faseovergang er reguleret ved aktivering af cyklin D1-CDK4 /6 komplekset og cyklin E-CDK2 kompleks [8,9], mens G

2 /M faseovergang er reguleret af aktivering af cyclin B1-CDK1 kompleks [10,11]. Deregulering af cellecyklussen forårsager en mangel på differentiering og afvigende vækst.

Apoptose er en evolutionær proces, der fører til programmeret celledød [12]. Processen med apoptose indbefatter morfologiske ændringer (fx celleskrumpning, membranblæredannelse, chromatinkondensering, og nuklear fragmentering) og biokemiske forandringer (fx DNA nedbrydning, protein spaltning, og proteintværbinding) [13,14]. Mange anticancermidler inducere celledød ved at aktivere caspaser, der indgår i en fælles apoptosecyklus [15,16]. Ydre og indre veje, der regulerer caspase-afhængig apoptose, er blevet identificeret [17]. I ydre vej, Fas, et dødsfald receptor, fører til dannelsen af ​​en død-fremkaldende FADD-caspase-8 signalering kompleks [18]. Den indre vej styres af Bcl-2-familien af ​​proteiner. For det første er de Bax /Bcl-2 forholdet stiger, og denne stigning efterfulgt af frigivelse af cytochrom c, hvilket fører til aktivering af caspase-9 og caspase-3 [19]. Den MAPK-vejen er kendt for dens regulering af celleoverlevelse og apoptose. Den MAPK familie består af tre store kinaser: ERK, p38, og JNK [20]. ERK præferentielt aktiveres af vækstfaktorer, der fører til cellevækst og overlevelse. p38 og JNK er fortrinsvis aktiveret ved cytokinstimulering og oxidativt stress, hvilket resulterer i celledifferentiering og apoptose [21,22]. Det er uklart om den intrinsiske /ydre vej eller MAPK-vejen aktiveres i PNAP-medieret apoptose. I denne undersøgelse vurderede vi cytotoksiciteten af ​​en række PNAPs mod MCF-7-celler og belyst den mekanisme der ligger til grund PNAP-induceret cytotoksicitet.

Materialer og metoder Salg

Kemi

den anvendte metode til at syntetisere de femten PNAP derivater er vist i figur 1. 2-phenylnaphthalen (PNAP-1) og syv methoxy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) blev syntetiseret fra kommercielt tilgængelig phenylacetonitriler og benzaldehyder ifølge tidligere beskrevne metoder [23]. Seks tilsvarende hydroxy-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7H) blev opnået ved demethylering af PNAP-2-PNAP-7 i fremragende udbytter (91% til 100%). En amino-PNAP (PNAP-8h) blev opnået ved hydrogenering af PNAP-8 i et udbytte på 86%. Den

1 H og

13C NMR spektre af PNAP-2h-PNAP-8h er tilgængelige i Støtte Information (figur A-G i S1 File). Alle de PNAPs blev opløst i DMSO til en koncentration på 50 mM til fremstilling stamopløsninger, som blev opbevaret ved -20 ° C.

De otte 2-phenylnaphthalenes (PNAP-1-PNAP-8) blev let opnået fra phenylacetonitriler og benzaldehyder gennem seks trin. Efterfølgende blev de seks hydroxy-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7h) opnået ved demethylering af den tilsvarende methoxy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Desværre forsøg på demethylering af PNAP-8 under de samme betingelser førte til komplekse blandinger. En anden hydrofile amino-PNAP (PNAP-8h) blev produceret af reduktion af nitro-PNAP (PNAP-8).

Generel fremgangsmåde for udarbejdelse af hydroxy-PNAPs.

BBR

3 i CH

2Cl

2 ved en koncentration på 1 M (5 ml, 5 mmol) blev langsomt tilsat til en opløsning af methoxy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) i CH

2Cl

2 (20 ml) ved 0 ° C. Blandingen fik lov at varme op til stuetemperatur og blev omrørt i 1 time. Den resulterende opløsning blev hældt i H

2O (50 ml). H

2O fase blev ekstraheret med EtOAc (3 x 50 ml), og de kombinerede ekstrakter blev vasket med H

2O (3 x 50 ml), tørret med vandfrit magnesiumsulfat

4, og filtreret. Filtratet blev koncentreret, og resten blev oprenset ved søjlekromatografi over silicagel og elueret med EtOAc til opnåelse hydroxy-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7H). De fuldstændige spektrale data for disse forbindelser er beskrevet som følger

6-hydroxy-2-phenylnaphthalen (PNAP-2h)

Udbytte 91%..; hvidt fast stof, smp 176-177 ° C (lit. [24], smp 169-170 ° C).

1H NMR (500 MHz, CDC

3)

δ

5,12 (1H, br s), 7,12 (1H, dd,

J

= 8,8, 2,4 Hz), 7,17 (1H, s), 7,36 (2H, t,

J

= 7,4 Hz), 7,47 (1H, t,

J

= 7,4 Hz), 7,69-7,71 (3H, m ), 7,75 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,80 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,97 (1H, s);

13C NMR (125 MHz, CDC

3)

δ

109,3, 118,2, 125,7, 126,3, 126,9, 127,1, 127,2 (2 x C), 128,8 (2 x C), 129,2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5; IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 cm

-1; ESIMS

m /z

(rel int) 219 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o: 219,08044; fundet:.. 219,08036 [M-H]

–

6,7-Dihydroxy- 2-phenylnaphthalen (PNAP-3h)

Udbytte 98%; hvidt fast stof, smp 205-207 ° C.

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

7,12 (1H, s), 7,20 (1H, s), 7,32 (1H, t,

J

= 7,5 Hz), 7,45 (2H, t,

J

= 7,5 Hz), 7,50 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,65 ( 1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,72 (2H, d,

J

= 7,5 Hz), 7,86 (1H, s), 9,57 (2H, br s);

13C NMR (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 × C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 x C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4; IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 cm

-1; ESIMS

m /z

(rel int) 235 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o

2: 235,0754; fundet:.. 235.0755 [M-H]

–

2- (4′-hydroxyphenyl) naphthalen (PNAP-4h)

Udbytte 100%; hvidt fast stof, smp 166-167 ° C (lit. [25], smp 167-169 ° C).

1H NMR (500 MHz, CDC

3)

δ

4,89 (1H, br s), 6,95 (2H, d,

J

= 8,6 Hz), 7.44- 7,50 (2H, m), 7,61 (2H, d,

J

= 8,6 Hz), 7,70 (1H, dd,

J

= 8,5, 1,7 Hz), 7,84-7,90 (3H , m), 7,97 (1H, s);

13C NMR (125 MHz, CDC

3)

δ

115,7 (2 x C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 x C), 132,3, 133,7, 133,9, 138,1, 155,1; IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512 1180 cm

1; ESIMS

m /z

(rel int) 219 (41, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o: 219,08044; fundet:.. 219,08043 [M-H]

–

6-hydroxy-2- (4′-hydroxyphenyl) naphthalen (PNAP-5h)

Udbytte 93%; hvidt fast stof, smp 127-128 ° C (lit. [26], smp 258-262 ° C).

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,86 (2H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,01 ( 1H, dd,

J

= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1H, s), 7,56 (2H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,63 (1H, dd,

J

= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1H, d,

J

= 8,6 Hz), 7,78 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,94 (1H, s), 9,51 (1H, br s), 9,70 (1H, br s);

13C NMR (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

108,6, 115,9 (2 × C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 × C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0; IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512 1265, 1204 cm

1; ESIMS

m /z

(rel int) 235 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o

2: 235,0754; fundet:.. 235.0751 [M-H]

–

6,7-hydroxy-2- (4′-hydroxyphenyl) naphthalen (PNAP-6h)

Udbytte 98%; hvidt fast stof, smp 280-282 ° C.

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,84 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,08 ( 1H, s), 7,13 (1H, s), 7,42 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,53 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,58 ( 1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,73 (1H, s), 9,46 (3H, br s);

13C NMR (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 109,9, 115,8 (2 × C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 × C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8; IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm

-1; ESIMS

m /z

(rel int) 251 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o

3: 251,07027; fundet:. 251,07032 [MH]

–

6,7-hydroxy-2- (3 ‘, 4’-dihydroxyphenyl) naphthalen (PNAP-7h)

Udbytte 100%. ; hvidt fast stof, smp 230 ° C (dekomp.).

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,80 (1 H, d,

J

= 8,2 Hz), 6,98 ( 1H, dd,

J

= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1H, s), 7,09 (1H, d,

J

= 2,0 Hz), 7,13 (1H, s), 7,37 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,57 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,68 (1H, s), 8,94 (2H, br s) , 9,46 (2H, br s);

13C NMR (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3; IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 cm

-1; ESIMS

m /z

(rel int) 267 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

beregnet for C

16H

11o

4: 267,0652; fundet:.. 267.0647 [MH]

–

2- (4′-Aminopheny) -6,7-dimethoxynaphthalen (PNAP-8h)

PNAP-8 (77 mg, 0,25 mmol) blev underkastet hydrogenering (50 psi) under anvendelse af 10% Pd /C som katalysator i tetrahydrofuran (THF, 10 ml) og EtOH (1 ml) ved stuetemperatur i 12 timer. Reaktionsblandingen blev filtreret, og filtratet blev opkoncentreret. Resten blev oprenset ved søjlekromatografi over silicagel og elueret med EtOAc, hvilket gav PNAP-8h. Udbytte 86%; bleggult fast stof, smp 190-191 ° C.

1H NMR (500 MHz, CDC

3)

δ

3,74 (2H, br s), 4,01 (6H, s), 6,79 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,12 (1H, s), 7,15 (1H, s), 7,52 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,56 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,71 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,82 (1H, s);

13C NMR (125 MHz, CDC

3)

δ

55,9 (2 x C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 x C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 × C), 129,6, 131,8, 137,0, 145,6, 149,2, 149,7; IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 cm

-1; ESIMS

m /z

(rel int) 280 (100, [M + H]

+); HRESIMS

m /z

beregnet for C

18H

17NO

2: 251,07027; fundet: 251,07032 [M + H]

+

Cell kultur

MCF-7 celler blev opnået fra laboratoriet af Dr. Yang-Chang Wu (Farmaceutiske Højskole, Kina Medical. University, Taiwan), og MCF-10A-celler blev opnået fra laboratoriet af Dr. Wei-Chien Huang (Graduate Institute of Cancer Biology, Kina Medical University, Taiwan). MCF-7-celler blev holdt i DMEM /F12-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. MCF-10A-celler blev holdt i DMEM /F12-medium indeholdende 1,05 mM CaCI

2, 100 mg /ml choleratoxin, 5% hesteserum, 10 ug /ml insulin, 500 ng /ml hydrocortison og 1% penicillin-streptomycin. Disse celler blev dyrket i cellekultur inkubatorer, som blev fastsat til temperaturer på 37 ° C og tilsat 5% CO

2.

Cellelevedygtighed assay

MCF-7-celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

3 celler per brønd i plader med 96 brønde, inkuberet natten over og derefter behandlet med forskellige koncentrationer (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 uM) af femten PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 og PNAP-2h-PNAP-8h). Desuden blev MCF-10A-celler udpladet i en densitet på 5 x 10

3 celler per brønd i plader med 96 brønde, inkuberet natten over og derefter behandlet med forskellige koncentrationer (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, og 100 uM) af tre PNAPs (PNAP-3h, -6, og -7H). Efter 48 timers behandling blev 10 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer ved 37 ° C. Mediet blev derefter fjernet helt, og 50 pi DMSO blev tilsat for at opløseliggøre MTT formazankrystaller. Absorbansen ved en bølgelængde på 550 nm blev derefter målt under anvendelse af en MQX200R mikropladelæser (BioTek, VT, USA).

Cellecyklusanalyse

MCF-7-celler blev podet ved en densitet på 3 × 10

5 celler per brønd i seks-brønds plader, inkuberet natten over og derefter behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre forskellige koncentrationer (5, 10, og 25 uM). Efter 48 timers behandling blev cellerne trypsiniseret, vasket en gang med PBS og fikseret i 70% ethanol i 1 time ved -20 ° C. De fikserede celler blev vasket med iskold PBS, suspenderet i 0,5 ml PBS indeholdende 0,2 mg /ml RNase og 0,1% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur, og farvet med 20 pg /ml propidiumiodid. De farvede celler blev analyseret under anvendelse af et FACScan flowcytometer (Becton Dickinson, CA, USA). Den fluorescens udsendt fra propidiumiodid-DNA-komplekset blev estimeret fra et minimum på 10.000 celler per prøve og analyseret ved anvendelse af Cell Quest alias software (BD Biosciences, USA).

Western blot-analyse

MCF-7-celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

5 celler per brønd i seks-brønds plader, inkuberet natten over og derefter behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre forskellige koncentrationer (5, 10 og 25 uM) i 48 timer. Cellerne blev vasket med PBS og lyseret i iskold RIPA-buffer i 30 min. Supernatanten blev opsamlet og centrifugeret ved 15.000 rpm og 4 ° C i 30 minutter. Proteinkoncentrationen blev målt gennem en Bio-Rad-assay under anvendelse af en MQX200R mikropladelæser (BioTek, VT, USA). Cellelysaterne blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og overført elektroforetisk på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Efter adskillige vaske blev membranerne blokeret med 5% skummetmælk i TBST (Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet natten over ved 4 ° C med forskellige primære antistoffer mod cyclin D1, CDK4, cyklin E, CDK2, p21, p27, cyklin B1, CDK1, kløvet caspase-7, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bid, Fas, p-p38, p38, p-JNK , JNK, p-ERK, eller ERK (1: 1000 fortynding). Membranerne blev derefter vasket tre gange med TBST og probet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof (1: 2000) i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske i TBST, blev det bundne antistof visualiseret ved anvendelse af ECL Western Blotting Reagent (PerkinElmer, Boston, MA, USA), og den kemiluminescens blev påvist under anvendelse Fuji Medical X-ray film (Tokyo, Japan).

cellemorfologi undersøgelser

cellerne blev udpladet i 12-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler /brønd, inkuberet natten over og derefter behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre forskellige koncentrationer (5, 10 og 25 uM) i 48 timer. Cellerne blev vasket en gang med PBS, og en delmængde af celler blev farvet med Hoechst 33342 (10 ug /ml i 15 min). De morfologiske ændringer blev derefter observeret ved lysmikroskopi ved 100 × forstørrelse og fluorescens mikroskopi ved 200 × forstørrelse.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middel ± SEM fra tre replikate eksperimenter . Forskellene mellem grupperne blev sammenlignet ved variansanalyse (ANOVA) og post-hoc Tukey Ærligt signifikant forskel (HSD) test ved SPSS 12.0 software til Windows (USA). P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater og Diskussion

Effekt af PNAPs på MCF-7-cellelinje levedygtighed og undersøgelse af deres struktur-aktivitet relationer

Til undersøge virkningerne af de 2-phenylnaphthalenes PNAP-1-PNAP-8, deres demethylering derivater PNAP-2h-PNAP-7h, og amino-PNAP (PNAP-8h) på celleoverlevelse, MCF-7 celler blev behandlet med forskellige doser af hver forbindelse (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 uM) i 48 timer. Hastighederne for levedygtighed bestemtes via MTT-assayet, og resultaterne er vist i tabel 1. Først PNAP-1 viste ingen signifikant aktivitet i MCF-7 celler, og PNAP-2-PNAP-8, som indeholder methoxygrupper, forårsaget udfældning i cellen medier i koncentrationer på over 5 um (tabel 1). Derfor blev den mere hydrofile PNAP derivater PNAP-2h-PNAP-8h designet og syntetiseret. Faktisk blev ingen udfældning observeret for PNAP-2h-PNAP-8h, sandsynligvis på grund af dannelsen af ​​intermolekylære hydrogenbindinger mellem vand og hydroxyl (eller amino) grupper på 2-phenylnaphthalenes. Tre af derivaterne (PNAP-3h, -6, og -7H) udviste signifikant dosisafhængig toksicitet mod MCF-7-celler, med IC

50 værdier på 17,9, 4,8 og 31,8 uM (tabel 1), mens IC

50 værdier opnået mod MCF-10A-celler var 71,0, 50,9 og 55,1 uM hhv. Resultaterne indikerer, at PNAP-3h og -6H har forbedret og selektiv cytotoksicitet mod MCF-7-celler og viser lav toksicitet mod MCF-10A-celler.

De ovenfor beskrevne resultater viste, at PNAP-5h, som har hydroxylgrupper ved C-6-stillingen i naphthalenringen og ved C-4 stillingen i phenylringen, udviste bedre cytotoksicitet end PNAP-1, -2H, og -4H i vores test. Dette fænomen viser, at indførelsen af ​​hydroxylgrupper ved C-6-stillingen i naphthalenringen og C-4′-stillingen i phenylringen øger cytotoksicitet. Interessant nok de to 2-phenylnaphthalenes PNAP-3h og -6H, som indeholder en hydroxylgruppe ved C-7-stillingen i naphthalenringen, udviste bedre cytotoksiske aktiviteter mod MCF-7-cellelinje (sammenlign PNAP-3h at -2H og sammenligne PNAP-6h at 5H). Disse resultater antyder, at cytotoksicitet markant fremmes ved tilstedeværelsen af ​​en hydroxylgruppe ved C-7-stillingen i naphthalenringen. Desuden skal det bemærkes, at PNAP-6h udviste den bedste aktivitet mod MCF-7-cellelinje (IC

50 = 4,8 uM). Dette resultat indikerede også, at indførelsen af ​​en hydroxylgruppe ved C-4 stillingen i phenylringen ville forbedre de aktiviteter mod MCF-7-cellelinje. I modsætning hertil tilstedeværelsen af ​​en hydroxylgruppe ved C-3 stillingen i phenylringen i PNAP-7h kan mærkbart mindske cytotoksicitet (sammenlign PNAP-6h og 7H). Desuden er sammenligningen af ​​de cytotoksiske aktiviteter af PNAP-6h og PNAP-8h antyder, at tilstedeværelsen af ​​en hydroxylgruppe, der tjener som en H-binding donor, på naphthalenringen giver bedre aktiviteter end tilstedeværelsen af ​​en methoxygruppe, der tjener som et H-binding acceptor. Baseret på cellen levedygtighed og SAR resultater, vi yderligere undersøgt de potentielle årsager til faldet i cellelevedygtigheden fremkaldt af PNAP-3h og -6H og belyst den underliggende mekanisme.

Effekt af PNAPs på de morfologiske karakteristika af MCF -7 celler

først blev effekten af ​​PNAP-1, 3H og -6H på cellulær morfologi observeret af fase-kontrast mikroskopi. MCF-7-celler behandlet med enten en bærerkontrol (0,05% DMSO) eller 5 til 25 uM PNAP-1 udviste tætte cellepopulationer under et fasekontrastmikroskop (fig 2A-2D). MCF-7-celler var regelmæssig form og størrelse, med excentriske kerner og en relativt lille mængde cytoplasma. Celledensiteten og struktur af celler behandlet i 48 timer med 5 til 25 uM PNAP-3h og -6H viste åbenlyse ændringer (Fig 2E-2J). Cellerne blev afrundet og indskrumpet og mistede kontakten med tilstødende celler. Desuden er de apoptotiske celler ikke længere klæbet til substratet, hvilket får dem til at løsne sig fra dyrkningsplader og flyde i dyrkningsmediet. Således PNAP-3h og -6H førte til et fald i de levedygtige MCF-7 celletal i en koncentrationsafhængig måde, som vist i tabel 1.

MCF-7 celler blev behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre koncentrationer (5, 10, og 25 uM) i 48 timer og derefter, (A-J) morfologien blev observeret ved lysmikroskopi (100 x). Cellerne blev farvet med Hoechst 33342, og derefter, (K-T) morfologien blev observeret ved fluorescensmikroskopi (200 ×). (A /K) kontrol; (B /L) 5 uM PNAP-1; (C /M) 10 uM PNAP-1; (D /N) 25 uM PNAP-1; (E /O) 5 uM PNAP-3h; (F /P) 10 uM PNAP-3h; (G /Q) 25 uM PNAP-3h; (H /R) 5 uM PNAP-6h; (I /S) 10 uM PNAP-6h; og (J /T) 25 uM PNAP-6h.

Vi har også observeret det nukleare morfologi MCF-7-celler udsat for Hoechst 33342 fluorescerende farvning efter behandling i 48 timer med tre koncentrationer (5, 10 og 25 uM), i PNAP-1, -3H, og -6H (fig 2L-2T). Kernerne af køretøjet kontrol cellerne viste en intakt oval form og blev udstillet en svag blå fluorescens (figur 2K). Men cellerne behandlet med PNAP-3h (25 uM) og PNAP-6h (5, 10, og 25 uM) udviste typiske apoptotiske funktioner, såsom nuklear krympning, nuklear fragmentering, og nuklear hypercondensation (fig 2Q-2T). Baseret på disse mikroskopiobservationer, foreslår vi, at den observerede cytotoksicitet kan delvis medieret gennem PNAP-3H- og 6H-induceret apoptose.

Virkning af PNAPs på MCF-7 cellecyklus fasefordeling

Fordi celleproliferation reguleres af cellecyklussen, blev virkningen af ​​PNAP-1, -3H og -6H på cellecyklusprogression i MCF-7-cellelinje undersøgt ved flowcytometri og western blot-analyser. Resultaterne af flowcytometrisk analyse viste, at behandling med PNAP-6h i 48 timer forøgede sub-G

1 populationen (figur 3A). Den sub-G

1 top, som bestod af celler med reduceret DNA-indhold, repræsenteret tilstedeværelsen af ​​apoptotiske celler [27,28]. Derudover PNAP-6h-induceret celle standsning på G

2 /M-fase opnået ved lavere koncentrationer (5 og 10 um) blev ledsaget af et fald i procentdelen af ​​celler findes på Go /G1-fasen. PNAP-5h og -6H forårsaget S fasen anholdelse ved en højere koncentration (25 uM), førte til et lavere antal replikerende celler og undertrykt celledeling. Imidlertid viste PNAP-1-behandlede celler, ingen signifikant ændring i cellecyklusfordeling forhold til køretøjets kontrolceller.

MCF-7 celler blev behandlet med PNAP-1, -3H, og 6H med tre koncentrationer (5, 10 og 25 uM) i 48 timer, og derefter, (A) blev cellerne fikseret og farvet med propidiumiodid at analysere DNA-indholdet ved flowcytometri. (B, C) Cell cycle-associerede proteiner (cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2, p21, p27, cyclin B1, og CDK1) blev påvist og analyseret ved western blot. Udtrykket blev kvantificeret med edb Gel-Pro Analyzer billedanalyse system. Dataene er udtrykt som middel ± SEM fra tre uafhængige assays. * P 0,05 og ** P 0,01 er signifikant forskellige fra kontrollen

Baseret på disse observationer af cellecyklus distribution af MCF-7-celler, analyserede vi ændringerne i overflod af cellen. regulerende proteiner. Cyclin-cdk-komplekser er de vigtigste regulatorer af cellecyklusprogression [7], og aktiviteten af ​​cyclin /CDK-komplekser er negativt reguleret af CDK-inhibitorer, såsom p21 og p27 [29]. PNAP-3h (ved 25 uM) og PNAP-6h førte til celle standsning på S-fasen, mest sandsynligt på grund af forøgede niveauer af p21 og p27 og et lavt cyclin D1, CDK4, cyclin E og CDK2, som bestemt ved den Western blot analyse (fig 3B og 3C). Desuden PNAP-6h inducerede en hæmning af CDK1-aktivitet og en formindskelse i cyclin B1 ekspression, sandsynligvis fører til G

2 /M arrest. Derfor foreslår vi, at hæmning af cellernes levedygtighed ved PNAP-3h og -6H kan være delvist medieret gennem cellecyklusstop og apoptose.

PNAPs aktiverer caspase vej og øge ekspressionen af ​​relative apoptotiske proteiner

Baseret på ovenstående resultater, fandt vi, at PNAPs kan forhindre proliferation, inducere apoptose, og nedsætte cellernes levedygtighed i MCF-7-cellelinje. Det er velkendt, at mange anticancerlægemidler medierer apoptose ved at aktivere caspaser [16]. For at demonstrere, at PNAP-induceret apoptose i MCF-7-celler forekommer via caspaseaktivering, undersøgte vi ekspressionen af ​​vigtige regulatoriske proteiner associeret med caspase veje i MCF-7-celler ved udsættelse for 5 til 25 uM PNAP-1, -3H, og -6H. Trods den manglende caspase-3 i MCF-7-celler, caspase-7, en apoptose bøddel, kan fungere som en erstatning [30]. Caspase-7 er i stand til at spalte specifikke tetrapeptid substrater (fx PARP), og PARP-spaltning er en væsentlig kendetegn for apoptose [31]. Eksponeringen af ​​MCF-7-celler til tre koncentrationer (5, 10, og 25 uM) af PNAP-3h og -6H i 48 timer steg signifikant niveauerne af spaltet caspase-7 og PARP og øget aktivitet af spaltet caspase-7 og PARP på en dosis-afhængig måde (figur 4A). Endvidere kunne apoptose stimuleres via ydre og indre veje. Caspase-8 er generelt betragtes en apoptose aktivator i ydre vej, og caspase-9 spiller en vigtig rolle i den indre vej [32]. Disse data viser, at ekspressionen af ​​spaltede caspase-8 og caspase-9 i MCF-7-celler steg efter behandling med PNAP-3h og -6H på en dosis-afhængig måde. Endvidere spaltet caspase-8 og caspase-9 blev delvist inhiberet af caspase-8-specifik inhibitor Z-IETD-FMK og caspase-9-specifik inhibitor Z-LEHD-FMK. Derudover er de to inhibitorer også inhiberede delvist caspase-7-spaltning i PNAP derivat-induceret apoptose (fig 5A og 5B) og delvist vendt PNAP-6-induceret formindskelse i cellelevedygtighed, som observeret ved mikroskopi og MTT-assayet (fig 5C) . Disse resultater tyder på, at caspase-7-, caspase-8-, og caspase-9-medierede pathways kan være delvist involveret i reguleringen af ​​PNAP-induceret apoptose.

(A) MCF-7 celler blev behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre koncentrationer (5, 10, og 25 uM) i 48 timer, og ekspressionen af ​​spaltet caspase-7, -8, -9 og PARP blev bestemt ved western blotting. (C) MCF-7 celler blev behandlet med 25 pM PNAP-1, -3H, og -6H ved tre koncentrationer (5, 10, og 25 uM) i 48 h, hvorefter Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bax /Bcl-2, bud og Fas niveauer blev derefter detekteret ved western blot. (B, D) Udtrykket blev kvantificeret ved hjælp af et edb-Gel-Pro Analyzer billedanalyse system. Dataene er udtrykt som middel ± SEM fra tre uafhængige assays. * P 0,05 og ** P 0,01 er signifikant forskellige fra kontrollen

MCF-7-celler blev inkuberet i nærvær eller fravær af (A) caspase-8 inhibitor z-IETD-. FMK eller (B) caspase-9-inhibitor z-LEHD-FMK i 1,5 time inden tilsætning af PNAP-6h. Western blot analyser blev udført med antistoffer mod caspase-7, -8 og -9, og actin. (C) MCF-7 celler blev behandlet med PNAP-6h i nærvær eller fravær af caspase-8 inhibitor eller caspase-9-inhibitor, og morfologien blev derefter observeret ved lysmikroskopi.

aktivering af caspase-8 er det første skridt i den kaskade af apoptotiske begivenheder fremkaldt af Fas stimulation [33], og aktiveringen af ​​caspase-9 reguleres af Bcl-2 familiemedlemmer [34-36]. Men behandling af MCF-7-celler med 25 pM PNAP derivater udøvede en beskeden effekt på ekspressionen af ​​Bcl-xl, Bax og byde proteiner ved tre tidspunkter (12, 24, og 48 h) (Fig 4C og 4D) .