PLoS ONE: N-cadherinekspression er forbundet med erhvervelse af EMT fænotype og med Enhanced Invasion i Erlotinib-Resistant Lung Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

epidermal vækst-faktor receptor tyrosin kinase hæmmere har været effektive i ikke-små patienter celle lungekræft. Men erhvervet resistens i sidste ende udvikler sig i de fleste patienter til trods for en indledende positiv respons. Nye beviser tyder på, at der er en molekylær forbindelse mellem erhvervet resistens og epitel-mesenkymale overgang (EMT). N-cadherin er involveret i EMT og i metastase af cancerceller. Her har vi analyseret N-cadherin ekspression og funktion i erlotinib-resistent lungekræft-cellelinjer.

Metoder

H1650 cellelinjer blev anvendt til at fastslå delområde resistent over for erlotinib (H1650ER). Derefter induktion af EMT blev analyseret ved anvendelse immunfarvning og western blots i H1650ER celler. N-cadherin-ekspression i de resistente celler blev undersøgt under anvendelse af FACS og western blot. Desuden blev en invasion assay udført for at karakterisere de resistente celler. Virkningerne af N-cadherin på celleproliferation og invasion blev analyseret. Associeringen af ​​N-cadherin ekspression med EMT fænotype blev undersøgt under anvendelse af immunhistokemiske analyse af 13 arkiveret, lungeadenocarcinom væv, før og efter behandling med erlotinib. Salg

Resultater Salg

H1650ER celler, N- cadherin ekspression blev opreguleret, parallelt med den reducerede ekspression af e-cadherin. Den markante histologiske forandringer og udvikling af en spindel-lignende morfologi antyder, at H1650ER celler undergik en EMT, ledsaget af et fald i E-cadherin og en stigning i vimentin. Der blev observeret en ændring i EMT status mellem præ-og post-behandling i 11 ud af 13 tilfælde (79%). I biopsier af resistente cancere, N-cadherin ekspression forhøjet i 10 ud af 13 tilfælde. Induktion af EMT var konsistent med aggressive egenskaber. Hæmning af N-cadherinekspression af siRNA blev testet for at reducere spredning og invasion af H1650ER celler

in vitro

.

Konklusioner

Vores data giver belæg for, at induktion af EMT bidrager til erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er i lungekræft. Det tyder på, at N-cadherin er en potentiel molekylært mål i behandlingen af ​​NSCLC

Henvisning:. Zhang X, Liu G, Kang Y, Dong Z, Qian Q, Ma X (2013) N-cadherin-ekspression Forbundet med Køb af EMT fænotype og med Enhanced invasion i Erlotinib-Resistant Lung Cancer cellelinier. PLoS ONE 8 (3): e57692. doi: 10,1371 /journal.pone.0057692

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italien

Modtaget: Juli 22, 2012; Accepteret: 28 Januar 2013; Udgivet: 8 marts 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kontrakt tilskud sponsor: Science Research Project i Henan-provinsen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige årsag til død på grund af maligne carcinomer, og brugen af ​​traditionelle kemoterapeutiske lægemidler mod lungekræft er kun moderat effektive [1] – [3]. Nylige fremskridt ved hjælp tyrosinkinaseinhibitorer som specifikt blokerer den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) har givet en markant fordel for undergrupper af patienter, hvis tumorer huser specifikke genetiske abnormiteter [4] – [7]. Disse lægemidler har ført til imponerende forbedringer i progressionsfri overlevelse (PFS) sammenlignet med kemoterapi. Imidlertid lægemiddelresistens vinder opstår gennem forskellige mekanismer [8] – [12]. Denne erhvervet resistens er blevet tilskrevet to mekanismer. Én foreslåede mekanisme er fremkomsten af ​​en ondartet klon med en sekundær mutation i EGFR-kinase domæne (T790M), som ophæver den inhibitoriske aktivitet af den TKI’er [13] – [14]. En anden 15 til 20% underkastes amplifikation af MET-receptoren tyrosinkinase, som aktiverer nedstrøms intracellulære signalering uafhængigt af EGFR [15] – [16]. Derudover spirende tyder på, at købet af EMT fænotype er relateret til erhvervet resistens over for EGFR tyrosinkinasehæmmere (TKI’er) [17] – [20]. EMT er kendetegnet ved den kombinerede tab af epitelcelle junction proteiner, såsom E-cadherin, og forstærkningen af ​​mesenchymale markører, såsom vimentin. I EMT-processen, epitelceller mister deres funktioner, få mesenchymale egenskaber, og bliver motile og invasive [21].

N-cadherin, en mesenchymal cadherin forbundet med EMT, er afgørende i cancer progression i forhold til både metastase og kemoterapi modstand. E-cadherin og N-cadherin aksjer mange strukturelle og funktionelle egenskaber. Begge molekyler etablere calciumafhængig homofil celle-celle-adhæsion med deres ekstracellulære domæner og er forbundet med catenins ved deres intracellulære domæner [22]. Et træk ved EMT er reduktionen af ​​celle-celle sammenvoksninger, især reduktionen af ​​E-cadherin, som er kritisk for opretholdelse af fænotype.

Denne undersøgelse vurderes, om induktion af EMT var relateret til erhvervet resistens observeret under erlotinib behandling og at fastlægge den rolle, N-cadherin hos patienter med NSCLC før og efter erlotinib behandling.

Materialer og metoder

cellelinier

den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinie H1650 blev opnået fra Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og blev dyrket i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 ° C, i et DMEM-opløsning indeholdende 10% FBS, penicillin og streptomycin. Den erlotinib-resistent cellelinje (H1650ER) blev oprettet ved at eksponere parentale celler til stigende koncentrationer af erlotinib, op til 10 uM, i flere måneder. De resistente celler blev kontinuerligt opretholdt i et medium indeholdende 10 uM af erlotinib før hvert forsøg.

Reagenser og antistoffer

Mouse anti-E-cadherin antistof (sc-21791) og monoklonalt anti- vimentin antistof (sc-53.464), Mouse anti-β-actin-antistof (sc-47.778), kanin-anti-N-cadherin antistof (sc-59987), fluoresceinisothiocyanat-konjugeret gede-anti-muse-antistof (sc-53.800), og PE-konjugeret gede-anti-muse-antistof (sc-53.464) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Akt (# 9272), S473 p-Akt (# 4060), EGFR (# 2239), og p-42/44 MAPK (# 4695) blev alle anskaffet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). EGFR [pY1068] (CB11007889) og kanin-anti-Erk antistof (CB1241938) blev købt fra Affinity bioreagenser (Golden, CO.).

Cell Proliferation Assay

celleproliferationsassays blev målt ved hjælp af celletælling Kit-8 assay (CCK-8; Dojindo Laboratories, Santa Clara, CA), som anvender bioreduktionen af ​​2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H tetrazolium natrium (WST-8) til orange formazan at måle cellernes levedygtighed. Kort beskrevet blev 100 pi H1650 og H1650ER celler, ved 2 × 10

4 /ml, blev inkuberet med forskellige koncentrationer af erlotinib i 96-brønds dyrkningsplader i 48 timer. Dernæst blev dyrkningsmediet i de 96 brønde erstattet med frisk medium indeholdende 5% CCK-8 reagens; efter en time blev absorbansen ved 450 nm målt, og værdierne blev korrigeret ved at subtrahere absorbansen af ​​kontrolbrønde, der ikke indeholdt celler.

Immunhistokemi

Væv fra 13 tilfælde af lunge adenocarcinom, fra både før og efter erlotinib behandling, blev indsamlet mellem januar 2008 og juli 2011 i Henan provincal Folkets Hospital, og indlejret i paraffin. Tumorvæv slides blev de-paraffinized og dehydreret hjælp Slide Brite (Sasco Chemical Group, Inc.). Antigen genfinding blev udført under anvendelse 0,05 M glycin-HCI-buffer, pH 3,5, indeholdende 0,01% (vægt /volumen) EDTA, ved 95 ° C i 20 minutter og farvet med et antistof mod human E-cadherin, vimentin og N-cadherin, som er de samme som for de i vitro assays ,. Evalueringen af ​​immunfarvning af disse sektioner blev gjort blind for to trænede patologer, som var uvidende om den kliniske baggrund af prøverne. Intensiteten af ​​E-cadherin, vimentin og N-cadherin blev scoret og placeret i fire kategorier efter farvning: 0 til 0%; 1 for 1-33%; 2 for 34-66%; og 3 for 67-100%. Alle de 13 humane væv er involveret i vores undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-deklarationen 1964 og alle efterfølgende revisioner. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Henan provins folks hospital, blev skriftligt informeret samtykke indhentet fra alle fag.

Små interfererende RNA (siRNA) Transfektion

Små interfererende RNA (siRNA) specifikt for N-cadherin blev købt fra Invitrogen. Det til den N-cadherin interfererende RNA’er (siRNA) sekvens var 5′-CUAACAGGGAGUCAUAUGGUGGAGC-TdT-3 ‘. For at minimere ikke-specifikke effekter af interfererende RNA’er, ikke-targeting kontrol siRNA, også indkøbt fra Invitrogen, blev anvendt som negativ kontrol. SiRNA transfektionsreagens (Invitrogen) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Eksperimentet blev gentaget mindst tre gange, uafhængigt af hinanden.

Matrigel Invasion Assay

Celler blev behandlet med N-cadherin-specifikke siRNA’er i 48 timer til knockdown N-cadherin ekspression. Invasion blev observeret ved anvendelse af trans-brønd kultur indsætter med en 6,5 mm diameter og 8 um porefiltre (Greiner Bio-One SAS, Courtaboeuf, Frankrig). Derefter 3 × 10

4-celler i 100 pi RPMI-medium, med 1% FCS blev podet i det øvre rum, og 600 pi RPMI, 10% FCS blev tilsat til det nederste kammer. Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer ved 37 ° C. Efter fjernelse celler på den øvre side af Transwell blev celler på undersiden farvet med 0,1% krystalviolet-opløsning (Becton Dickinson) og blev lyseret med 10% eddikesyre til kvantificering ved densitometrisk måling ved 550 nm. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

Western blot-analyse

Proteiner fra cellelysaterne, der blev fremstillet ved anvendelse RIPA puffer [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1 % natriumdodecylsulfat og 1% Nadeoxycholate (pH 7,4)] suppleret med proteaseinhibitorer (1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug /ml pepstatin A, 10 ug /ml aprotinin og 5 ug /ml leupeptin), blev påvist ved SDS-PAGE og derefter elektrooverført til Immobilon membraner (Invitrogen); disse membraner blev efterfølgende probet med specifikke antistoffer. De sekundære antistoffer anvendes peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer og membranen blev fremkaldt under anvendelse af en ECL-kit (Thermo). Dette eksperiment blev gentaget mindst tre gange, uafhængigt af hinanden.

klongenicitetsassayet

H1650 og H1650ER celler blev behandlet med 0,05% trypsin og udpladet i 6-brønds plader med 1 x 10

4 celler per brønd i 0,35% agarose i DMEM-medium lag oven på 0,7% agarose i det samme medium. Kolonidannelse blev observeret efter 2-3 uger i kultur. Efter farvning med 0,005% krystalviolet blev kolonier talt under et mikroskop. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Antallet af celler blev talt, og gennemsnittet for at bestemme kloningseffektivitet.

Fluorescerende Immuncytokemi

celler dyrket på dækglas blev vasket tre gange med PBS. De blev fikseret i 10 minutter med kold methanol og vasket tre gange med PBS. Dækglassene blev derefter blokeret i en opløsning af PBS, 10% bovint serum, og 0,1% Tween 20 i 1 time. Cellerne blev inkuberet med primært antistof til enten E-cadherin eller vimentin ved 2 ug /ml i 1 time, hvorefter cellerne blev vasket to gange med PBS og inkuberet med sekundære antistoffer fortyndet i PBS, 5 eller 10% bovinserum, og 0,1% Tween 20. efter inkubering på dækglas i 1 time ved 37 ° C dækglassene blev vasket som beskrevet ovenfor og monteret på objektglas i medium indeholdende DAPI. Salg

flowcytometrianalyse

cancerceller dissocieret anvendelse af 0,05% trypsin; de blev vasket med PBS og 100 pi alikvoter af 10

5-celler i PBS blev anbragt i 96-brønds V-bundede plader og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med IgG. Celler blev vasket to gange med PBS. Efter vask med PBS, var bundet antistof detekteret ved hjælp gede anti-human-PE eller gede anti-human-CY3, og analyseret ved FACS (LSRII, Becton Dickinson).

Statistisk analyse

SPSS 13.0 statistisk pakke (SPSS Inc., Chicago, IL) blev anvendt til dataanalyser. Betydningen af ​​forskellen mellem de kovariater blev bestemt ved to-halet v2 test. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

1. Erhvervelsen af ​​Erlotinib Modstand i H1650 cellelinier Udstillet Variabel signalvej Aktivering

erlotinib-resistent lungekræft cellelinje H1650 (H1650ER), der oprindeligt stammer fra forældrenes H1650 cellelinie, demonstrerede en øget afhængighed af EGFR signalering for vækst, som tidligere beskrevet [23]. Ved dyrkning denne cellelinie i nærvær af en konstant høj koncentration af erlotinib over en periode på flere måneder, har vi været i stand til at isolere cellelinier stand til at vokse ved erlotinib koncentrationer op til 10 uM. Langsomme stigninger i vækst fandt sted, hvilket indikerer, at en cellelinie resistent over for erlotinib var blevet udviklet. Kurverne vækst er vist i fig. 1A.

(A) Erlotinib-resistente celler (H1650ER) blev oprettet ved langvarig udsættelse for stigende koncentrationer af erlotinib. H1650 parentale celler og H1650ER blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 103 celler i 100 pi per brønd, dyrket natten over og behandles med forskellige koncentrationer af erlotinib i 72 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. De overlevende fraktioner blev bestemt ved CCK-8 assay. Absorbans blev målt ved 450 nm. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og S.D.s blev beregnet. *, P 0,01. (B) H1650 parentale og H1650ER celler blev dyrket i 3 dage med eller uden erlotinib behandling (10 pmol /l). Hel-cellelysater blev fremstillet og analyseret ved Western blot med de angivne antistoffer.

Efterfølgende undersøgte vi resistensmekanisme over for EGFR-TKI erlotinib. Anvendelse af Western blots, vi probet lysater fra både parentale H1650 og H1650ER celler behandlet i 6 timer med erlotinib. Erlotinib behandling effektivt blokeret EGFR og Akt fosforylering i forældrenes H1650 celler, men ikke i H1650ER celler. I disse resistente celler, p-Akt var opreguleret og blev vurderet som en kandidat til involvering i mekanismen af ​​erhvervet resistens. I modsætning til den vedvarende Akt phosphorylering, blev Erk phosphorylering nedreguleres ved erlotinib behandling i de resistente celler. Disse resultater foreslog, at erlotinib-resistente celler vedtaget en ny mekanisme til aktivering af PI3K /Akt-vejen (fig. 1B).

2. N-cadherin Overekspression inducerer Epithelial-mesenkymale Transition (EMT) i Erlotinib-resistente H1650ER Celler

For at identificere markører for erlotinib modstand, vi sammenlignet genekspression i parrede forældre- og resistente cellelinier. N-cadherin ekspression blev stærkt forøget i H1650ER cellelinjer, som vi bekræftet ved FACS og western blot. (Fig. 2A, B). Derefter blev morfologiske forskelle mellem den parentale H1650 og de resistente H1650ER cellelinier let observeret (fig. 2C). På molekylært niveau, blev disse slående morfologiske træk forbundet med en øget ekspression af mesenchymale proteinet vimentin og en nedsat ekspression af epitel markør E-cadherin (fig. 2D, E). Tilsammen udgør disse resultater viser, at erhvervelsen af ​​erlotinib modstand inducerede molekylære ændringer, der var i overensstemmelse med EMT.

(A) opreguleret udtryk for N-cadherin blev påvist ved FACS-analyse. (B) Cellelysater fra H1650 og H1650ER celler blev detekteret ved Western blot; lysaterne blev også bedømt for niveauet af N-cadherin-protein. (C) Den H1650 stamcellerne og de resistente H1650ER cellerne blev vurderet for morfologiske ændringer, som i overensstemmelse med en EMT. Scale barer: 25 um. (D) Reduceret ekspression af E-cadherin og forøget ekspression af vimentin blev påvist under anvendelse af Western blot. (E) Immunfluorescensfarvning blev udført for at validere ændringerne i markørproteiner fra enten epitel- eller mesenchymale fænotyper. Scale barer: 25 pm

3.. Up-modulation af N-cadherin Expression og EMT blev fundet i biopsier af resistente Kræft

For at identificere ekspressionen af ​​N-cadherin og EMT biomarkører i EGFR-mutant NSCLC vævsprøver, vi udførte biopsier på patienter før erlotinib behandling og på det tidspunkt, at resistens blev erhvervet. Tretten patienter havde tumorvæv rådighed både før og efter TKI behandling. Kendetegnene for de 13 patienter er vist i tabel 1. Immunhistokemisk farvning af tumorprøver blev anvendt til at analysere proteinekspression af epitel markør E-cadherin og mesenchymale markør vimentin. De epitel markører blev påvist i næsten alle biopsi prøver fra NSCLC patienter forud for erlotinib behandling, hvorimod der ikke blev påvist mesenkymale markører i 2 ud af 13 tumorvæv. I resistente cancere, blev ekspressionen af ​​E-cadherin reduceres i 5 ud af 13 biopsier. Desuden er der i 11 (84,6%) ud af 13 tumorer, vimentin udtryk steg efter erlotinib modstand blev erhvervet; således, udviste i alt 11 prøver tegn på en EMT som svar på induktion af lægemiddelresistens.

Af de samlede sager, 12 ud af 13 tilfælde var negative for N-cadherin med undtagelse af én adenocarcinom tilfælde der havde focal N-cadherin ekspression før erlotinib behandling. På den anden side blev ekspressionen af ​​N-cadherin steg i 10 ud af 13 biopsier i resistente cancertyper. Immunohistokemisk ekspression blev opsummeret i tabel 2. Repræsentative immunohistokemiske farvninger er vist i figur 3A.

(A) Tabet af E-cadherin og en stigning i både vimentin og N-cadherin ekspression blev observeret i disse tumorer (lavere panel), sammenlignet med deres tilsvarende primære tumorer (øvre panel). Scale barer: 100 um. Forstørrelse, × 200.

4. Evnen til vækst og Invasion blev Øget i H1650ER Celler

Induktion af EMT var i overensstemmelse med aggressive egenskaber, såsom øget klonogene vækst, celle motilitet og invasion. For yderligere at karakterisere H1650ER celler, sammenlignede vi væksten af ​​parentale og resistente cellelinier ved anvendelse af en celle-tælling assay; procentdelen af ​​levedygtige celler blev beregnet i forhold til de ubehandlede kontroller (Fig. 4A). Vi udførte også en Matrigel-coated kammer assay, der viste forøget celle invasion af H1650ER celler sammenlignet med parentale celler (fig. 4B). Desuden fandt vi, at H1650ER celler fået en mere tumorigen fænotype, som dokumenteret af øget klonogene vækst (fig. 4C).

(A) Vækst kurver af H1650, H1650ER celler og alle andre celler blev udført i rutinemæssig kultur medium. Værdierne viser middelværdien celleantal ± S.D. af tredobbelte brønde på hvert tidspunkt og viser tre individuelle eksperimenter. Fejl søjler viser SD; *, P 0,01; **, P 0,001. (B) parentale celler og H1650ER celler podedes på Matrigelcoatede polycarbonatfiltre at analysere deres invasive potentialer. Scale barer: 25 um. Resultaterne blev opnået fra tre forsøg, og søjlerne repræsenterer S.D.s; *, P 0,01. (C) parentale celler og H1650ER cellelinier blev også dyrket i blød agar for at teste deres evne til at danne kolonier efter 15 dages inkubation. Original forstørrelse, × 10. Resultaterne blev opnået fra tre eksperimenter.

5. Down-modulation af N-cadherin ekspression i H1650ER Celler resulterede i nedsat Invasion

De H1650ER celler, der udtrykker høje niveauer af N-cadherin blev ned moduleres af forbigående transfektion med siRNA’er. Disse effektive siRNA’er frembragte signifikante reduktioner i N-cadherin-protein (figur 5A.) Ved sammenligning med to kontrol cellelinier: vildtype-cellelinje og cellelinje transficeret med lipofectamin. Samtidig, N-cadherin silencing reduceret AKT phosphorylering (fig. 5B). Nedreguleringen af ​​N-cadherin ekspression blev associeret med reducerede invasion evner i Matrigelcoatede kammer sammenlignet med vildtypeceller eller fingeret transficerede celler (fig. 5C).

(A) N-cadherin ekspression i H1650ER celler transficeret med siRNA’er rettet mod N-cadherin efter 48 timer. Proteinekspression målt ved flowcytometri, en repræsentativt eksperiment. (B) Evnen hos invasion evalueret efter transfektion i 48 timer under anvendelse af en Matrigelcoatede kammer og 20% ​​FCS som kemoattraktant. Scale barer: 25 um. (C) Ændringer i AKT og phospho-AKT kinase aktivitetsniveau upon N-cadherin siRNA lyddæmpning ved Western blot.

Diskussion

Her præsenterer vi dokumentation for, at erhvervet resistens over for, EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren, erlotinib i lungekræft medieres af epitel-mesenkymale overgang (EMT). I denne undersøgelse fandt vi, at H1650 lungecancerceller udviklet resistens over for erlotinib og gennemgik EMT fænotypiske forandringer, som var konsistente med reduceret ekspression af den epitheliale markør E-cadherin og forøget ekspression af mesenchymale markører vimentin. Desuden er der i disse kliniske prøver, forbehandling kræftformer udstillede adenocarcinom histologi med bevaret membranøs farvning for E-cadherin, mens positivt udtryk for vimentin blev hyppigere anerkendt i avancerede efterbehandling kræftformer, hvilket indikerer, at nogle svulster undergik EMT. Især vores data viser, at EMT er forbundet med erlotinib modstand i NSCLC, som tidligere rapporteret [24] – [25]

Afvigende udtryk for cadheriner eller cadherin switching, er en af ​​de vigtigste begivenheder i EMT. i visse typer af cancer [26] – [27]. Inaktivering af E-cadherin er en vigtig begivenhed i tumorudvikling [28] – [29]. Unormal aktivering af en cadherin, såsom N-cadherin, ville være en efterfølgende begivenhed, som fremmer angiogenese, hjerne metastase, og er forbundet med ringe overlevelse [30] – [31]. I vores undersøgelse, er N-cadherin niveau opreguleret i H1650ER celler. Immunhistokemi viste også, at N-cadherinekspression var signifikant opreguleret i tilbagevendende, efterbehandling lungekræft prøver, der er indsamlet fra 10 ud af 13 patienter. Desuden siRNA-medieret knockdown af N-cadherin reducerer væksten og invasion af H1650ER celler

in vitro

. Den afvigende N-cadherin udtryksfulde status både

in vitro

in vivo

lyser vores hypotese, at de afgørende roller N-cadherin bor ikke kun i EMT, men også i tumormetastaser og erlotinib modstand. Men mere expremental data har behov for at verificere vores hypotese. Da ikke alle lunge adenocarcinom er sentitve til TKI, da kun få cellelinjer er følsomme over for TKI, såsom A549, PC9, HCC827, CALU-3, HCC4006 dem huser den erhvervede mutation i EGFR-genet [21], [32 ] – [35]. I de begrænsede følsomme cellelinjer, forskningen om forholdet mellem N-cadherin og modstanden er endnu mindre. Yamauchi M, et al [32] fandt også N-cadherin ekspression blev signifikant opreguleret i gefitinib-resistent PC9 /ZD celler, der huser den erhvervede resistente mutation T790M i EGFR-genet, andre celler, der udtrykker N-cadherin blev fundet resistent over for erlotinib (A549, H157, og H322), og at hæmning af N-cadherinekspression hjælp siRNA førte til et signifikant fald i levedygtighed i A549 og H322 celler.

Andre forskere har rapporteret, at N-cadherin styrer motilitet og migration af kræftceller ved at undertrykke Akt fosforylering [36] – [37]. Efter aftale med den delvise ansvar af p-Akt aktivering i invasion af nogle cancer cellelinjer, der udtrykker N-cadherin, fandt vi, at erlotinib blokerede EGFR og ERK fosforylering men ikke Akt fosforylering i erlotinib-resistent H1650ER celler. Vedvarende Akt phosphorylering i erlotinib-resistent lungecancerceller antyder, at disse celler vedtage en alternativ mekanisme til aktivering af PI3K /Akt at overleve [38] – [39]. Vi foreslår, at Akt aktivering kan være forbundet med N-cadherin opregulering, som blev støttet af vores resultater, at vedvarende Akt fosforylering i erlotinib-resistent lunge kræftceller kunne overvindes ved en N-cadherin inhibitor. Dette synes at være i overensstemmelse med den aktuelle litteratur. Tanaka H et al. viser, at N-cadherin tavshed reducerer AKT fosforylering, mens N-cadherin overekspression øger AKT-aktivitet i prostata cancer celler [40]; Tilsvarende Wallerand H et al. viser, at N-cadherinekspression er associeret med Akt aktivering og høj invasiv i humane blærekræft cellelinjer [41]. Så det lader til, at N-cadherin er ikke kun en biomarkør for TKI modstand efter udsættelse for EGFR-hæmmere, men også en fungerende molekyle.

Sammenfattende vores undersøgelse giver en yderligere indsigt i de involverede i NSCLC og TKI mekanismer modstand, afslører, at opregulering af N-cadherin i H1650 ER celler fører til øget tumor celle migration, invasion og tumorigent potentiale. Vores resultater antyder også, at opretholdelsen af ​​EMT fænotype i H1650ER celler kan være relateret til den vedvarende ekspression af N-cadherin. Derfor kan N-cadherin tjene som et lovende nyt mål til behandling af cancere med erhvervet resistens over for EGFR TKI’er. Fordi N-cadherin udtrykkes på celleoverfladen, vi overvejer også, om terapeutiske mål tasterne N-cadherin-specifikke monoklonale antistoffer ville have virkning i disse cancerceller med erhvervet resistens over for EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren.

Tak

forfatterne er taknemmelige for Zheng Wang (Department of Respiratory Medicine, Hefei No.1 Folkets Hospital, Hefei, Anhui, Kina) og Xiao Li (Department of Respiratory Medicine, Henan Provincial Folkets Hospital, Zhengzhou, Henan, Kina) til kommentarer til manuskriptet.