PLoS ONE: Cirkulerende Exosomal microRNA som biomarkører for Colon Cancer

Abstrakt

Formål

Exosomal microRNA (miRNA) er blevet tiltrække stor interesse som potentielle diagnostiske biomarkører for kræft. Formålet med denne undersøgelse var at karakterisere de miRNA profiler af serum exosomer og identificere dem, der er ændret på kolorektal cancer (CRC). For at vurdere deres anvendelse som diagnostiske biomarkører, forholdet mellem specifikke exosomal miRNA niveauer og patologiske ændringer af patienter, herunder sygdom scenen og tumor resektion, blev undersøgt.

Eksperimentel Design

Microarray analyser af miRNA i exosom-berigede fraktioner af serumprøver fra 88 primære CRC-patienter og 11 raske kontroller blev udført. Ekspressionsniveauerne af miRNA i dyrkningsmediet af fem coloncancer cellelinier blev også sammenlignet med dem i dyrkningsmediet af en normal colon-afledt cellelinie. Udtrykket profiler af miRNA, der var differentielt udtrykte mellem CRC og kontrol prøvesæt blev verificeret ved hjælp af 29 parrede prøver fra post-tumor resektion patienter. Sensitivitet blandt udvalgte miRNA som biomarkører for CRC blev evalueret og sammenlignet med dem for kendte tumormarkører (CA19-9 og CEA) under anvendelse af en modtager driftskarakteristik analyse. Ekspressionsniveauerne af udvalgte miRNA blev også bekræftet af kvantitativ real-time RT-PCR-analyser af et uafhængigt sæt 13 CRC patienter.

Resultater

serum exosomal niveauer af syv miRNA (bogstav 7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, og miR-23a) var signifikant højere i primære CRC patienter, selv dem med tidlig fase sygdom, end hos raske kontroller, og var signifikant nedreguleres efter kirurgisk resektion af tumorer. Disse miRNA blev også udskilt ved signifikant højere niveauer af tyktarmskræft cellelinjer end af en normal colon-afledt cellelinie. De høje følsomheder for de syv udvalgte exosomal miRNA blev bekræftet af en modtager opererer karakteristisk analyse.

Konklusion

Exosomal miRNA signaturer synes at spejle patologiske ændringer af CRC patienter og flere miRNA er lovende biomarkører for ikke -invasive diagnosticering af sygdommen

Henvisning:. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. (2014) cirkulerende Exosomal microRNA som biomarkører for tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10,1371 /journal.pone.0092921

Redaktør: Tadayuki Akagi, Kanazawa University, Japan

Modtaget: November 13, 2013; Accepteret: 26 februar 2014; Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Ogata-Kawata et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af Advanced Research for Medical Products Mining Program for National Institute of Biomedical Innovation (Nibio) (08-02), https://www.nibio.go.jp; Grant-in-aids fra Sundhedsministeriet, Labor og Velfærd (13802015), https://www.mhlw.go.jp/; Grant-in-aids fra Ministeriet for uddannelse, kultur, sport Teknologi af Japan (13314780), https://www.jsps.go.jp/; National Cancer Center for Forskning og Udvikling Fund (23-B-08), https://www.ncc.go.jp. National Cancer Center Biobank er støttet af National Cancer Center Research og Development Fund. . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto og Hikaru Sonoda, er medarbejdere i Shionogi Co., Ltd. Shionogi Co, Ltd har en eksklusiv licens til flere miRNA præsenteres i dette arbejde. Shionogi Co, Ltd har ansøgt om et patent (WO2011 /040.525) for udviklingen af ​​disse miRNA som diagnostiske markører. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de hyppigste årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Systematiske fremgangsmåder til diagnosticering af patologiske tilstande kan bidrage til en høj detektionsrate på patienter med tidlige stadier af CRC, hvilket fører til en reduktion i dødeligheden. Gennemførelse af fækal okkult blodprøve og fleksibel sigmoideoskopi som screeningsmetoder har reduceret CRC dødelighed [2], [3]. Men disse teknikker har iboende begrænsninger; følsomheden af ​​detektionen af ​​fækalt mørkt blodprøve er ret lav og fleksibel sigmoideoskopi er invasiv og ubehagelige for patienterne. Carbohydratantigen 19-9 (CA19-9) og carcinoembryonisk antigen (CEA) er ofte blevet brugt som tumormarkører til påvisning af mange typer af cancer, herunder colon-, lever-, pankreas-, og maven. Men følsomheden af ​​disse markører til påvisning af CRC er lav, især i de tidlige stadier af sygdommen [4]. Der er derfor et behov for udviklingen af ​​CRC-specifikke diagnostiske markører for hurtig, ikke-invasiv, og meget følsom screening af patienter.

MikroRNA’er (miRNA) er endogene, lille, ikke-kodende RNA og deres vævsspecifik ekspression bidrager til præcis styring af forskellige biologiske processer [5], [6]. Dysfunktion af miRNA findes i forskellige cancerformer og de endogene udtryk profiler af miRNA kan anvendes til at klassificere cancertyper [7], [8]. Flere miRNA viser høje niveauer af udtryk i kræft væv er blevet rapporteret som egnede diagnostiske eller prognostiske markører [9]. Nylige undersøgelser viste, at miRNA udskilles fra forskellige celler, herunder cancerceller, i kropsvæsker såsom blod, urin, modermælk, og spyt,

via

exosomer [10] – [12]. Exosomer er små membranblærer på ca. 100 nm, der integrerer protein, lipider, mRNA, og miRNA, afhængigt af oprindelsen af ​​de udskiller celler [13], [14]. Derfor kan exosomal miRNA i kropsvæsker være nyttige diagnostiske biomarkører for påvisning af kræft [10], [15]. Men er der i øjeblikket en mangel på oplysninger om forholdet mellem exosomal miRNA profiler i blod og den patologiske tilstand af kræftpatienter.

Her har vi udført microarray-baserede profilering af exosomal miRNA i sera fra raske kontroller (HC’er ) og primære CRC patienter. De miRNA profiler i exosomer fra tyktarmskræft cellelinjer blev også undersøgt for at identificere kandidat biomarkører udskilt af kolon kræftceller. De exosomal miRNA underskrifter afveg mellem CRC patienter og kontroller. Ved at sammenligne miRNA profiler af kliniske prøver og cellelinjer, otte miRNA (lad-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, og miR-23a) der blev signifikant forhøjet i serum exosomer fra primære CRC patienter og blev nedreguleret efter kirurgi blev identificeret. CRC-associeret højde af syv af disse exosomal miRNA blev valideret i en uafhængig prøvesæt hjælp kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR). Tilsammen resultaterne præsenteret her viser, at exosomal miRNA signatur afspejler patologiske forandringer i CRC patienter og gælder for udviklingen af ​​diagnostiske strategier til påvisning af primære CRC’er.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Serumprøver fra 88 CRC patienter (i alderen 35 til 65 år) med en primær tumor blev leveret af National Cancer center Hospital Biobank, Japan (Tokyo, Japan) fra 2003 til 2004. Serumprøver blev også indsamlet fra 29 af patienterne efter kirurgisk resektion af den primære tumor fra 2003 til 2004. for validering af QRT-PCR blev serumprøver fra 13 forskellige CRC patienter (i alderen 45 til 70 år) med en primær tumor fra National Cancer center Hospital Biobank , Japan i 2009. Kirurgiske eksemplarer af primær tyktarmskræft og de omkringliggende ikke-kræft regioner blev opnået fra patienter, der behandles ved Teikyo Universitetshospital (Tokyo, Japan) [16]. Sera fra 19 personer (i alderen 35 til 65 år), der gennemgik en fuldstændig fysisk screening på NTT Medical Center Tokyo (Japan) i 2011 blev brugt som HC prøver. Serumprøver blev opbevaret ved -20 ° C indtil brug.

Etik Statement

Institutional Review Board godkendelser til anvendelse af prøverne blev opnået ved NTT Medical Center, The University of Tokyo, og National Cancer Centrum. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter inkluderet i undersøgelsen.

Cellelinjer

Alle cellelinier anvendt i dette studie blev opnået fra American Tissue Culture Collection. Normale humane føtale kolon-afledte FHC celler blev dyrket i DMEM-F12 indeholdende 25 mM HEPES, 10 ng /ml choleratoxin, 5 ug /ml insulin, 5 pg /ml transferrin, 100 ng /ml hydrocortison og 10% føtalt bovint serum [17]. Den HCT116, HT-29, RKO, SW48, og SW480 human colon cancer cellelinjer blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum [18] – [20]. Dyrkningsmediet blev opsamlet efter vækst af cellerne i 48 timer.

Fremstilling af exosom-berigede fraktioner

Exosom fraktioner blev fremstillet ved en trinvis centrifugering-ultracentrifugering fremgangsmåde, som tidligere beskrevet med mindre ændringer [13]. Kort beskrevet blev dyrkningsmedium fra colon cancer cellelinjer centrifugeret ved 500 x g i 5 minutter for at fjerne cellerester, og derefter centrifugeret ved 16.500 x g i 20 minutter under anvendelse af en JA-30.50 rotor (Beckmann). Den klarede supernatant blev passeret gennem en 0,20 um filter og derefter ultracentrifugeret ved 120.000 x g i 70 minutter under anvendelse af en TLA-110 rotor (Beckmann). Pelleterne blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter resuspenderet i 250 pi PBS som exosom-berigede fraktioner. Serumprøver (750 pi) fra CRC patienter og HC blev fortyndet otte gange med PBS og exosom-berigede fraktioner blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Berigelse af exosomet markør CD81 i de forberedte fraktioner blev bekræftet ved immunoblotanalyse (se Metoder S1 og figur S1).

Udarbejdelse af samlet exosomal RNA

exosom fraktion fremstillet af serum blev blandet med 750 pi Trizol-LS-reagens (Invitrogen), og den vandige fase blev opsamlet ved tilsætning af chloroform. Efter tilsætning af ethanol til den vandige fase, blev totalt RNA oprenset ved anvendelse RNeasy Mini Spin Columns (Qiagen). RNA-prøven blev tørret under anvendelse af en Speed-Vac centrifugal-koncentrator (Savant) og derefter opløst i 10 pi nuclease-frit vand. Koncentrationen af ​​RNA blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific) og Quanti-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Invitrogen). Kvaliteten af ​​RNA blev analyseret ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyzer og små RNA chips (Agilent Technologies).

miRNA microarray analyse

I alt RNA fra exosom fraktioner blev mærket med pCp-Cy3 hjælp af Agilent miRNA mærkningsreagens, og derefter hybridiseret til en human miRNA oligonucleotid microarray (8 × 15 K, version 3.0, Agilent Technologies), ifølge producentens instruktioner. Efter hybridisering blev arrayet vasket med Genekspression Wash Buffer kit (Agilent Technologies) og scannet under anvendelse af en Agilent mikromatrice scanner. Efter numerisk konvertering af rådata ved anvendelse Feature Extraction Software (version 10.7, Agilent Technologies) blev de transformerede data analyseres ved hjælp GeneSpring GX-software (version 12.5, Digital Biology). Signalintensiteterne af pletter på mikroarrayet blev normaliseret til den samlede signalintensitet af arrayet og er vist som procentdele. De miRNA microarray data er blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus database med tiltrædelsen kode GSE40247.

QRT-PCR

Exosomal miRNA blev revers transkriberet hjælp MultiScribe revers transkriptase (Life Technologies) og miRNA- specifikke primere. De miRNA blev kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse TaqMan microRNA kits (Life Technologies) og 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ifølge en standardprotokol [21]. Den sammenlignende cyklus tærskel (Ct) blev anvendt til at vurdere den relative detektionsgrænsen på hver miRNA i prøven, som blev bestemt ved anvendelse af 2

-ΔΔCT metode [22]. I QRT-PCR-forsøg blev MIR-451 anvendes som en intern standard, fordi det var påviselig i alle prøver og dets normaliserede intensiteter var ikke signifikant forskellig mellem HC og CRC serum exosomer (

P

0,05).

statistisk analyse

En to-sidet parrede Students

t

-test eller Welch s

t

-test blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af forskelle i microarray signalintensiteter. Hierarkisk klyngedannelse analyse af datasættet af alle miRNA profiler blev udført under anvendelse Wards metode. Modtageren operating characteristic (ROC) kurve og arealet under kurven blev analyseret for at vurdere muligheden for at anvende en udvalgt miRNA-forhold som en diagnostisk markør for CRC. Korrelationskoefficienter på exosomal miRNA-profiler mellem cellelinjer og niveauerne af CA19-9, CEA, og exosomal miRNA i patientens serum som kandidat CRC markører blev bestemt ved multivariat analyse. Disse analyser blev udført under anvendelse JMP9 software. Den Jonckheere-Terpstra-test (SPSS-software version 18) blev anvendt til at bestemme korrelationen mellem CRC tumor /node /metastase (TNM) stadier og miRNA niveauer.

Resultater

Identifikation af exosomal miRNA der er forhøjede i CRC ved microarray analyse

mikroarray-baseret screening blev anvendt til at detektere miRNA niveauer i exosomal fraktioner af serumprøver fra CRC og HC patienter samt dyrkningsmedier fra en normal colon-afledt cellelinje og fem forskellige menneskelige kolon cancer cellelinjer. Figur 1 viser en oversigt over screening anvendte strategi. Exosomet-berigede fraktioner blev fremstillet under anvendelse af en trinvis centrifugering-ultracentrifugering fremgangsmåde, som vist i figur S1A. Berigelse af små RNA og CD81 i exosom fraktionerne blev bekræftet ved kapillarelektroforese og immunoblotanalyse henholdsvis (fig S1B-D). En multivariat analyse og korrelationskurver af microarray data indikerede reproducerbar påvisning af exosomal miRNA i uafhængige forsøg og korrelationer mellem miRNA profiler af de forskellige cancer cellelinjer (figur S1E og tabel S1). De exosomal miRNA profiler af de fem tyktarmskræft cellelinjer og FHC cellelinie var forskellige fra de endogene cellulære miRNA profiler (Figur S1F).

miRNA profiler af exosom fraktioner af serumprøver fra 88 primære CRC patienter (herunder TNM kliniske faser I, II, III a, III b, og IV) og 11 HC blev bestemt ved hjælp af microarrays. Kendetegnene for patienterne og de exosomal miRNA fundet i hver gruppe er vist i tabel 1. I alt 164 miRNA blev påvist i alle undersøgte serumprøver (figur S2A) og 69 miRNA blev udtrykt på betydeligt højere niveauer i CRC patienter end HC (

P

0,05) (figur S2B og S2C, tabel S2). Analyse af exosomal miRNA profiler af dyrkningsmedier fra fem forskellige tyktarmskræft cellelinjer og normal colon epitel FHC celler afslørede, at 52 miRNA blev udskilt til væsentligt højere niveauer fra alle fem tyktarmskræft cellelinjer end fra FHC celler (figur S3A og S3B, tabel S3).

En sammenligning af de 69 opreguleret miRNA fra CRC patienter og de 52 opreguleres miRNA fra tyktarmskræft cellelinier afslørede, at 16 miRNA var til stede i begge sæt (figur 2 ): lad-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-1268, miR-1290, miR-1308, miR-150, miR-181b, miR-181d, miR-1915 miR- 21, miR-223, miR-23a, miR-483-5p, og miR-638. De endogene ekspressionsniveauer af disse miRNA blev derefter målt i FHC og coloncancer-cellelinjer, samt tyktarmskræft og matches ikke-cancervæv fra fire yderligere patienter. Med undtagelse af miR-181d, som i væsentlig grad var opreguleret i både kræftcellerne og væv ingen af ​​disse miRNA blev udtrykt i cancer væv (Figur S3C) eller kræft cellelinier (

P

0,05 ) (Figur S3D) til betydeligt højere niveauer end de matchede ikke-kræft væv eller FHC cellelinje hhv. Disse resultater viser, at sekretion af miRNA er ikke afhængig af deres cellulære ekspressionsniveauer og foreslå, at opreguleret endogene miRNA i cancerceller er ikke nødvendigvis substrater for exosom-medieret sekretion. Colon kræftceller synes at udskille en delmængde af miRNA i ekstracellulære rum via exosomer.

Serum exosomal miRNA niveauer i 11 HC (blå) og 88 CRC patienter (rød) på forskellige TNM stadier (I-IV). Signalintensiteterne blev normaliseret til den samlede signal intensitet mikroarrayet. De vandrette linjer angiver den gennemsnitlige normaliserede signal intensitet for hver gruppe. Statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved Welch s

t

-test.

Forholdet mellem serum exosomal niveauer af 16 miRNA og kliniske stadier af tyktarmskræft

Dernæst vi analyserede forholdet mellem de 16 almindeligt opreguleret miRNA og kliniske stadier af CRC ved at adskille CRC patienter på grundlag af deres TNM fase. For hver miRNA, ingen signifikant korrelation (

P

0,05) mellem exosomal niveau og den kliniske fase af sygdommen blev identificeret ved en Jonckheere-Terpstra-test (Figur S4)

Down. -forordning af otte miRNA efter fjernelse af primære tumorer

for at afgøre, om de 16 almindeligt up-regulerede miRNA stammer fra kræftceller, blev microarray analyser anvendt til at bestemme niveauet af disse miRNA i exosom-berigede fraktioner af matchede serum prøver opsamlet efter kirurgisk resektion af primære tumorer (n = 29 patienter). Ekspressionsniveauer af otte af miRNA blev væsentligt reduceret (

P

0,05) efter fjernelse af de primære tumorer (figur 3 og tabel S4): Lad-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, og miR-23a. Disse resultater antyder, at disse otte miRNA kan afledes af exosomer der udskilles af cancerceller, og at deres niveauer kan afspejle coloncancer status af patienterne. Salg

(A) Scatter plot af 16 almindeligt opregulerede serum exosomal miRNA i CRC patienter (n = 29) før (Pre) og efter (post) kirurgisk fjernelse af tumorer. Prøven sæt inkluderet fase I (n = 6), fase II (n = 6), fase IIIa (n = 5), fase IIIb (n = 9), og trin IV (n = 4) patienter. Dataene repræsenterer de gennemsnitlige normaliserede signalintensiteter (%). De røde prikker indikerer de otte miRNA, der var betydeligt nedreguleret efter tumor resektion: lad-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, og miR- 23a. (B) Individuelle ændringer i serum exosom niveauer af de otte nedreguleret miRNA i CRC patienter (n = 29) før (Pre) og efter (post) kirurgisk fjernelse af tumorer. Statistisk signifikante forskelle mellem de gennemsnitlige Pre værdier og de gennemsnitlige post-værdier blev bestemt ved parrede Students

t

-tests.

Potentielle serum exosom miRNA til anvendelse som diagnostiske biomarkører

for at estimere deres magt som potentielle diagnostiske markører, cut-off-værdier for de otte miRNA, der var opreguleret i tyktarmskræft og nedreguleret efter tumor resektion blev analyseret ved hjælp af en ROC-kurve (figur 4). De sande positive satser for miR-1246 og miR-23a til identifikation af de 88 CRC patienterne var 95,5% og 92,0%, henholdsvis; disse miRNA havde også lave falsk positive satser til identifikation af de 11 HC (9% og 0%, henholdsvis). De sande positive satser for miR-21, miR-150, lad-7a, miR-223, miR-1224-5p, og miR-1229 til identifikation af CRC var 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% og 22,7%, henholdsvis; de falske positive satser af disse miRNA varierede fra 0% til 9% (figur 4). Det bemærkes, at en kombineret anvendelse af 8 miRNA ikke viste mere diagnostisk effekt end i Mirs-1246 og -23a (data ikke vist). Til sammenligning sensitivitet blandt CEA og CA19-9, som er kendt biomarkører af CRC, var 30,7% og 16,0%, henholdsvis. En multivariat analyse viste ingen sammenhæng mellem niveauerne af de otte udvalgte miRNA i serum exosomer og serumniveauer af CEA og CA19-9 (tabel S5). Derfor har vi revurderet ekspressionsniveauerne af de otte miRNA i serum exosomer ved QRT-PCR-analyser af en ekstra prøve sæt, der omfattede otte HC’er, syv fase I CRC patienter og seks fase II CRC patienter (Tabel S6). Niveauerne af syv af de miRNA, nemlig Lad-7a, MIR-1229 MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a, var signifikant højere i serum exosomer fra CRC patienter end dem fra HC (

P

0,05) (Figur 5). Statistisk signifikante stigninger i ekspressionsniveauer af disse miRNA blev endda observeret for den tidlige fase (TNM stadie I) CRC prøver (Figur S5). Disse resultater tyder på, at serum exosomal miRNA kan være nyttige til tidlig påvisning af primære CRC’er.

De signalintensiteter af miRNA er vist som procentdele af den samlede signal intensitet. De cut-off værdier af de otte miRNA, der var opreguleret i tyktarmskræft og nedreguleret efter tumor resektion blev analyseret ved hjælp af en ROC-kurve. Sorte bokse angiver patienter over cut-off værdi af de biomarkører eller miRNA niveauer. De normaliserede intensiteter af målbart miRNA i serum exosomer blev beregnet som 0.

Box-og-knurhår plots af ekspressionsniveauerne af de otte udvalgte miRNA i et uafhængigt sæt HC (n = 8) og CRC patienter med primær tumor (n = 13). Statistisk signifikante forskelle mellem HC og CRC datasæt blev bestemt ved Welch s

t

-tests. Den sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode blev anvendt til at kvantificere niveauet af exosomal miRNA i HC og CRC patienter. Den relative forhold blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode. Ct-værdi af MIR-451 blev anvendt som en intern standard. Hvert datapunkt blev normaliseret til en repræsentativ HC prøve.

Diskussion

For nylig miRNA har tiltrukket stor interesse som et middel til at analysere de molekylære veje er involveret i kræft udvikling og progression. Ud over deres vigtige cellulære funktioner, er det muligt, at udskilte miRNA indlejret i exosomer kan være diagnostiske biomarkører for detektion af kræft. Her omfattende analyser af exosomal miRNA profiler identificeret 16 miRNA, der blev givet udtryk for på betydeligt højere niveauer i colon cancer cellelinjer og serumprøver fra CRC patienter end normale kolon-afledte celler og serumprøver fra HC’er henholdsvis. Endogene ekspressionsniveauer af de fleste af disse miRNA blev ikke opreguleret i cancer-cellelinjer og cancer væv, hvilket antyder, at exosomal sekretion af miRNA afhænger ikke af cellulære ekspressionsniveauer. På den anden side, miR-181, en kontekst-afhængig cancerassocieret miRNA [23], [24], kun indiceret opreguleret cellulære og exosomal ekspressionsniveauer i cancercellelinier og kliniske prøver, hvilket tyder på en interessant hypotese, at funktionen af exosomal miR-181 kan være involveret i tyktarmskræft udvikling og progression.

De serum exosomal niveauer af otte af disse 16 miRNA var signifikant nedreguleret efter kirurgisk resektion af primære tumorer, hvilket tyder på, at disse miRNA udskilles fra tumorceller. Men vi ikke udelukke, at disse miRNA udskilles fra andre celler, herunder immune og inflammatoriske celler, der opstår tilfældigt på primære læsioner i vævet. Endelig CRC-associerede stigninger i de exosomal niveauer af syv miRNA niveauer (lad-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, og miR-23a) blev valideret af QRT-PCR , hvilket indikerer, at disse miRNA kan være egnede biomarkører til at afsløre tyktarmskræft. De høje følsomheder og særlige forhold disse exosomal miRNA bestemt af ROC-analyse (figur 4) støtte deres anvendelse som diagnostiske biomarkører.

exosomal niveauer af de syv udvalgte miRNA ikke var afhængig af den kliniske fase af CRC (figur S4 ). Faktisk miR-23a og miR-1246 udviste høje følsomheder for trin I prøver af 95% og 90%, hhv. Til sammenligning sensitivitet blandt CA19-9 og CEA for fase I CRC er kun 10 og 15%, hhv. Desuden QRT-PCR viste reproducerbar påvisning af disse miRNA ved høje niveauer i et uafhængigt sæt af serum exosomer fra trin I CRC patienter (Figur S5). Disse resultater antyder, at disse miRNA er egnede biomarkører til påvisning af tidlige stadium CRC. Imidlertid er yderligere validering nødvendig for at støtte dette forslag.

En nylig rapport viste, at lade-7a udtrykkes ved høje niveauer i exosomer udskilles i serum ved glioblastom tumorceller [15]. Desuden MIR-1246 er påviselig i hele serumprøver, snarere end exosom-fraktioner, fra esophageal cancerpatienter [25]. Vi målte også lade-7a, MIR-1224-5p, og MIR-150 niveauer i dyrkningsmediet af pancreas cellelinier og fandt, at niveauerne var de samme som udskilles af fem colon cancercellelinier (data ikke vist), hvilket tyder at disse miRNA almindeligvis udskilles fra forskellige cancerceller. Adskillige rapporter har foreslået anvendelsen af ​​cirkulerende miRNA helt plasma eller serum, herunder MIR-141, MIR-21, MIR-221, MIR-29, og MIR-92a, som diagnostiske biomarkører for CRC [26] – [30]. Disse miRNA blev vist for at vise følelser og særlige sammenlignes med tyktarmskræft markører øjeblikket i brug. Især blev MIR-141, MIR-221, og MIR-21 rapporteret at være opreguleret i cancervæv [31] – [33]; den samlede miRNA indstilles fra hele plasma eller serum kan omfatte endogene cellulære miRNA afledt af knækkede eller cirkulerende tumorceller [34], [35], hvilket kan forklare, hvorfor miR-141, miR-221, og miR-21 er til stede i høje niveauer i hele serum eller plasma prøver fra kræftpatienter. Desuden blev serum /plasma miRNA, som ikke er forbundet med vesikler, rapporterede at vise forskellen stabilitet for behandling med RNase A [36], hvilket antyder, at exosomal miRNA er mere foretrukne som biologiske prøver til udvikling af diagnostiske biomarkører på grund af deres stabilitet i serum /plasma. Faktisk resultaterne præsenteret her viser, at exosomal miRNA niveauer også afspejle cancer-bærende status og patologiske ændringer af patienter. Exosomer aktivt frigives fra kræftceller og deres specifikke bestanddele afhænger af celle, hvorfra de stammer. Faktisk kan kræftceller bruge en endnu uidentificeret mekanisme til at integrere en delmængde af miRNA i exosomer.

Sammenfattende forsøg er for nylig blevet gjort til at bruge miRNA i serum eller plasma som diagnostiske biomarkører for forskellige kræftformer [37] ; dog er der i øjeblikket ingen kollektive opfattelse af hvilke miRNA skal vælges som markører. De unikke egenskaber af exosomer, herunder deres evne til at integrere specifikke miRNA, deres stabilitet i omløb, deres reproducerbar påvisning og, vigtigst af alt, at de afspejler de egenskaber kræftceller, kan gøre dem nyttige for udviklingen af ​​meget følsomme diagnostiske strategier til hurtig og ikke-invasiv overvågning af den patologiske tilstand af kræftpatienter.

Støtte Information

Figur S1.

Fremstilling af exosom-berigede fraktioner fra serum eller celledyrkningsmedium. (A) Oversigt over exosom-berigelse procedure. (B) Immunoblotanalyse af CD81-niveauer i humane sera før exosom-berigelse og før (bane 2) eller efter overnsight opbevaring ved 4 ° C (bane 5 og 6), -20 ° C (bane 7 og 8), eller – 80 ° C (bane 9 og 10). Føtalt bovint serum (FBS) før (bane 1) og efter opbevaring natten over ved 4 ° C (bane 3 og 4) blev anvendt som en kontrol. Exosomet fraktion blev derefter fremstillet fra 1 ml serum under anvendelse af ultracentrifugering fremgangsmåde beskrevet i Materialer og fremgangsmåder sektion (bane 11). Fem mikroliter af hver serumprøve eller 300 ng af den berigede fraktion blev sat på en 10-20% gradient SDS-polyacrylamidgel. CD81, et exosomet markering, blev detekteret under anvendelse af et specifikt antistof. (C) Påvisning af den lille RNA del af cellulære totale RNA’er (endogene) og exosomal RNA’er (exosomal) fra HCT116 celler (30 ng af hver). RNA’erne blev læsset på 5-150 nt små RNA chips (Agilent) og kapillær elektroforeseret bruge en Agilent 2100 Bioanalyzer. En lille RNA fraktion indeholdende miRNA kunne påvises ved ca. 10-40 nt. Toppen ved 4 repræsenterer nt en størrelse markør. De fyldte og åbne pile angiver 5S tRNA og små rRNA’er hhv. FU, fluorescensenheder. (D) Immunoblotanalyse af CD81-ekspression i serumfrit dyrkningsmedium HCT116 celler før og efter exosom-berigelse. De angivne mængder af proteinprøver fra cellepelleten, næringssubstrat og exosom-berigede fraktioner blev underkastet immunoblotanalyse under anvendelse af antistoffer rettet mod CD81 eller anti-γ-tubulin, en repræsentant intracellulært protein. Bane 1-4, cellepellet; banerne 5-7, serumfrit dyrkningsmedium; banerne 8-10, exosom-berigede fraktion. (E) Scatter plots af normaliserede signalintensiteter (%) for exosomal miRNA (venstre paneler) og endogene cellulære miRNA (højre paneler) i de angivne cellelinjer. (F) Hierarkisk klyngedannelse af endogene og exosomal miRNA i den normale FHC cellelinje og fem menneskelige kolon kræftceller. Dataene repræsenterer middelværdierne af normaliserede signalintensiteter (%) N = 3 uafhængige forsøg. I alt 489 miRNA var påviselige i alle prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092921.s001

(TIF)

Figur S2.

microarray analyse af miRNA-profiler i exosom-berigede serumprøver fra CRC patienter og HC. (A) Hierarkisk klyngedannelse af exosomal miRNA i prøver fra 11 HCS og 88 CRC patienter (TNM: fase I, n = 20; fase II, n = 20; fase IIIa, n = 20; stadie IIIb, n = 16; stadie IV , n = 12). Den blå og rød skravering angiver HC og CRC patienterne. Signalintensiteter for hver miRNA er vist som en procentdel af det samlede signal intensitet på arrayet. I alt 64 miRNA blev påvist i alle serumprøver undersøges. (B) Hierarkisk klyngedannelse af de 69 miRNA, der blev givet udtryk for på betydeligt højere niveauer i CRC patienter end HC’er (

P

0,05 af Welch s

t

-test). (C) Scatter plot af de normaliserede signalintensiteter af de 69 exosomal miRNA, der var opreguleret i CRC patienter (y-akse) i forhold til HCS (x-aksen). Dataene repræsenterer de gennemsnitlige normaliserede signalintensiteter af hver miRNA fra CRC og HC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092921.s002

(TIF)

Figur S3.

microarray analyse af exosomal miRNA fra tyktarmskræft cellelinjer og endogene ekspressionsniveauer af miRNA. (A, B) Ekspressionsniveauerne for de 52 miRNA, der blev udskilt fra fem tyktarmscancerceller til betydeligt højere niveauer end fra FHC celler (

P

0,05). Dataene repræsenterer de gennemsnitlige normaliserede signalintensiteter på n = 3 uafhængige microarray eksperimenter.