PLoS ONE: Effekt af MRE11 Tab på PARP-Inhibitor Følsomhed i endometriecancer In Vitro

Abstrakt

Formål med undersøgelsen

For at vurdere hyppigheden af ​​MRE11 /RAD50 /NBS1 (MRN) -kompleks tab af protein-ekspression i livmoderkræft (EF) og til at bestemme, om tab af MRE11 gør kræftcellerne følsomme over for Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -inhibitory behandling.

Metoder

MRN ekspression blev undersøgt i 521 prøver af endometriske carcinomer og i 10 kræftcelle linjer. En formodet mutation hotspot i form af en intronisk poly (T) allel i MRE11 blev sekventeret i udvalgte tilfælde (n = 26). Følsomhed over for PARP-inhibitor, blev BMN673 testet i kolonidannelse analyser før og efter MRE11 lyddæmpning hjælp siRNA. Homolog rekombination (HR) DNA-reparation blev evalueret ved RAD51-foci dannelse assay ved bestråling og medicinsk behandling.

Resultater

Tab af MRE11 protein blev fundet i 30,7% af EF-tumorer og signifikant associeret med tab af RAD50, NBS1 og mismatch reparation proteinekspression. En endometrial cellelinie viste en markant reduceret MRE11 ekspression skyldes en homozygot poly (T) mutation af MRE11, hvorved der udvises en forøget følsomhed over for BMN673. MRE11 udtømning sensibiliserer MRE11 udtrykkende EF-cellelinier til behandling med BMN673. Den øgede følsomhed over for PARP-hæmning korrelerer med reduceret RAD51 foci dannelse ved ioniserende stråling i MRE11-udtømte celler.

Konklusion

Tab af MRE11 protein forudsiger følsomhed over for PARP-inhibitor følsomhed in vitro, definere det som en ekstra syntetisk dødelig gen med PARP. Den høje forekomst af MRE11 tab i EC’er kan potentielt udnyttes til PARP-hæmmer behandling. Endvidere kunne MRE11 protein udtryk ved hjælp af immunhistokemi undersøges som en prædiktiv biomarkør for PARP-inhibitor behandling

Henvisning:. Koppensteiner R, Samartzis EP, Noske A, von Teichman A, Dedes I, Gwerder M, et al. (2014) Effekt af MRE11 Tab på PARP-Inhibitor Følsomhed i endometriecancer

In Vitro

. PLoS ONE 9 (6): e100041. doi: 10,1371 /journal.pone.0100041

Redaktør: Sue Cotterill, St. Georges University of London, England

Modtaget: November 10, 2013; Accepteret: 21. maj 2014 Udgivet: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Koppensteiner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var delvist finansieret af Julius Müller Fonden og Zürich Cancer League. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EF) er den fjerde mest almindelige malignitet blandt kvinder. De fleste af ECS diagnosticeres i tidligt stadium og er forbundet med meget gunstige overordnede prognose [1]. Behandlingsmuligheder dog for avanceret, recidiverende eller metastatisk EC’er, er begrænsede og består hovedsagelig af cytotoksisk kemoterapi [1]. Potentielle målrettede behandlinger er under klinisk afprøvning, men er endnu ikke blevet inkorporeret i rutinemæssig klinisk brug [2].

EF er en heterogen sygdom med tydelig histologiske og molekylære egenskaber [2]. Hidtil EF er blevet klassificeret i type I og II. Dette er baseret på de forskellige histologiske egenskaber (endometrioide kontra ikke-endometrioide) og på den kliniske prognose (gunstig vs. dårlig) [2], [3]. Desuden optræder distinkte molekylære ændringer fortrinsvis i enten type I eller type II EF (gennemgået i [2]). Henviser type I tumorer er karakteriseret ved mikrosatellit instabilitet (MSI) og polymutations i forskellige typer af gener, næsten alle type II tumorer harbor mutationer af tumorsuppressorgen

TP53

[4]. For nylig er hidtil ukendte molekylære undergrupper blevet beskrevet på en måde beslægtet med brystcancer [5]. Baseret på deres mutation profil og kopi-nummer ændrer EC’er er kategoriseret i:. Den ultramutated, den hypermuted, kopien nummer lavt og kopien nummer høje undergruppe [5]

hypermutated undergruppe omfatter det meste endometrioide EF, alle husly mikrosatellit instabilitet (MSI). Disse tumorer er kendt for at udvikle mutationer i forskellige andre gener (hypermutated genom), men også dem, der er involveret i DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) reparation maskiner [6]. En af de mest almindelige tilbagevendende mutation findes i

MRE11 gen

, hvis produkt er en del af MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) – kompleks, der er involveret i påvisning og reparation af DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) [7], [8].

MRE11

germline mutationer, der forårsager en dødelig fænotype i mus [9] er sjældent i mennesker og føre til en Ataxia telangiectasia-lignende sygdom (ATLD) [10]. Somatiske mutationer i

MRE11

dog ofte påvist i tarmkræft med MSI og er også blevet foreslået til MSI-positive EC’er [11]. Mutationer af introniske poly (T) sekvens af

MRE11

mellem exon 4 og 5 er hyppige begivenheder i MSI positiv kolorektal und EC’er [11], [12]. I EF, MSI er til stede i mere end 20% af tumorer og er primært forårsaget af epigenetisk inaktivering af MMR-genet

MLH1

[13]. Dette fører til ændringer i antallet af nukleotid- gentagelser fundet i kodende og ikke-kodende elementer af mange gener, såsom

MRE11

[14].

Syntetisk letalitet opstår, når to individuelt forekommende mutationer ikke har nogen effekt på celleviabilitet, men forårsager celledød i kombination [15], [16]. Hæmning af et syntetisk dødelig partner gen i kræftceller præsentere en syntetisk dødelig mutation kan vise en attraktiv strategi for at udvikle specifikke anti-cancer medicin med minimale bivirkninger i sundt væv. Nylige undersøgelser har vist, at kræft med tab af funktion af

BRCA1

eller

BRCA2

vise udsøgt følsomhed over for Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -hæmmere [17], [18]. Eftersom MRE11 er involveret i DNA DSB-reparation gennem MRN-komplekset, tab af funktion af dette kompleks via inaktiverende mutationer kan føre til følsomhed over for PARP-inhibitorer [19]. PARP1, en DNA-reparation enzym, er blevet impliceret i reparation af DSB’er. PARP hæmning fører til apoptose eller ældning i celler, hvor DNA-reparation ved homolog rekombination (HR) er svækket (syntetisk letalitet). Til denne undersøgelse anvendte vi en potent selektiv PARP1-hæmmer BMN673, der har vist meget lovende resultater i fase I /II forsøg [20].

Her viser vi, at MRN ofte går tabt i EF, som fører til øget PARP-inhibitor følsomhed. Dette kan udnyttes til behandling af patienter med EF husning tab af MRN-komplekset. Målet med denne undersøgelse er at vise hyppigheden af ​​tabet af MRE11 og MRN-kompleks i EF, og om dette fører til øget følsomhed over for PARP-hæmmere udnytte

MRE11

som en potentiel syntetisk dødbringende gen.

Materialer og Metoder

væv microarrays

Tissue microarrays (TMAS) med formalinfikserede og paraffin indlejret endometrie carcinomer blev bygget tidligere [21]. To kohorter fra Institutes of Surgical Pathology, Universitetshospitalerne Basel og Zürich (Schweiz) indeholdende 339 (Basel-TMA) og 182 (Zürich-TMA) cancer prøver blev inkluderet i denne undersøgelse. Kliniske og patologiske egenskaber blev taget fra de kliniske databaser og patologi optegnelser. Rutinemæssige hematoxylin og eosin snit blev udført for histopatologisk evaluering. Scenen af ​​tumorer blev vurderet i henhold til Den Internationale Sammenslutning for Gynækologi og Obstetrik (FIGO) og TNM. Histologisk undertype og tumor grad blev defineret i henhold til WHO klassifikationen 2003. Opfølgende data kendes fra 480 patienter. Den mediane follow-up tid var 31,5 måneder (interval, 1-184) til Basel kohorten, og 45 måneder (interval, 1-124) til Zürich kohorte. Patienter med lokaliseret sygdom blev behandlet af hysterektomi og bilateral salpingectomy (med eller uden bækken og paraaortic lymphadenectomy). Vaginal stråleterapi blev postoperativt gives, når invasionen af ​​myometrium eller tumor grad 3 var klart. Undersøgelsen blev godkendt for begge kohorter ved lokale videnskabelige etiske komité (KEK-ZH-NR: 2010-0358). Baseline karakteristika for patienter med EF er sammenfattet i tabel 1.

Immunhistokemi

Efter antigen hentning blev objektglassene inkuberet med de følgende antistoffer: MRE11 (klon 31H4, cellesignalering, ingen . 4847, 1:500), RAD50 (13B3 /2C6, Abcam begrænset, nr. ab89, 1:500), NBS1 (cellesignalering, nr. 3002, 1:50), MLH1 (G168-15, PharMingen, Becton Dickinson , 1:100), MSH2 (25D12, Novocastra Lab. Ltd, 1:100), PMS2 (A16-4, PharMingen, Becton Dickinson, 1:300), og MSH6 (44, BD Biosciences, 1:500). Efter inkubation i 1 time ved stuetemperatur blev farvningen af ​​MRE11, RAD50, og NBS1 yderligere udført med Ventana Benchmark automatiseret system (Ventana Medical Systems, USA) under anvendelse af Ventana reagenser samt UltraMap DAB detektion kit. Antistofferne mod basefejlparringsreparationssystemet proteiner blev inkuberet i 30 minutter og proceduren farvning blev udført med det automatiserede Leica BOND system ved hjælp Bond Polymer Tilpas Detection Kit (Leica Biosystems). Udtrykket analyse blev udført ved to patologer (AN, KI). Den nukleare immunoreaktiviteten af ​​MRE11, RAD50, og NBS1 blev scoret som: negativ (0), svagt (1), moderat (2) og stærk (3). Proteinet ekspression af fejlparringsreparationsgener blev betragtet som positiv, når kernefarvning var klart. Stromaceller viser nukleare farvning blev anvendt som en positiv kontrol.

Kræft cellelinjer og vækstbetingelser

EØF cellelinjer Hec-108 [22], og Hec-116 [22] blev dyrket i MEM, HEC 1A (ATCC) i McCoys, EFE-184 (DSMZ) i RPMI, AN3CA (ATCC) i DMEM, ARK-II [23] i DMEM, SNG-II [24] i DMEM, ECC-1 [25] i RPMI 1640, og var en gave fra Uwe Schirmer, DKFZ. HEC6-ST3 [22], der dyrkes i MEM, og KLE (ATCC), dyrket i DMEM /F-12, var en gave fra Jaqueline galeasen, UCSF. Medierne blev suppleret med 10% (medium til ECC-1 med 5%) (v /v) føtalt bovint serum og med enten penicillin (100 U /ml) /streptomycin (60 mg /ml) eller antibiotika-antimykotisk, og vedligeholdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære ved 5% CO2. Alt cellekulturmateriale blev indkøbt fra Gibco af LifeTechnologies.

immunblotting

helcelle-proteinekstrakter blev fremstillet ud fra celler lyseret med en SDS-lysepuffer. Western blotting blev udført med primære antistoffer mod MRE11 (D151, gave fra Steve Jackson, Cambridge), RAD51 (kanin polyklonale antistof, Santa Cruz Biotechnology), NBS1 (monoklonalt muse-antistof, GeneTex), beta-tubulin (muse monoklonalt antistof, Sigma) . Inkubation med det primære antistof blev efterfulgt af inkubation med et HRP-konjugeret sekundært antistof (anti-muse og anti-kanin-HRP fra Sigma, anti-får HRP fra SantaCruz) og kemiluminescerende påvisning af proteiner (Amersham).

MRE11 mutation analyse

Tretten MRE11 immunhistokemisk (IHC) positive og 13 IHC negative prøver blev udvalgt fra Zürich kohorten for

MRE11

mutation analyse. Tre vævscylinderne (diameter 0,6 mm) blev udstanset fra hver paraffinblokken til DNA-ekstraktion. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Koncentrationerne af de opnåede nukleinsyrer blev målt under anvendelse af NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). PCR blev udført som tidligere beskrevet (Grannini et al., 2002) med en let modifikation. Kun 50 ng af genomisk DNA blev PCR-amplificeret. DNA-sekventering blev udført ved hjælp af BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). De opnåede sekvenser blev analyseret for mutationer i poly (T) 11 repeat region i det menneskelige

MRE11

intron 4 (tabel 2).

kolonidannelse Analyser

langtidsoverlevelse analyser blev udført som beskrevet tidligere [26]. Kort fortalt blev celler podet i seks-brønds plader in triplo i en koncentration på 300-2000 celler per brønd og behandles med inhibitoren efter 24 timer, kontinuerligt udsættes for lægemidlet (10-11 til 10-6 M) opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (kontrol: DMSO). Medier og narkotika blev erstattet hver 3 til 5 dage. Efter 10 til 15 dage blev cellerne fikseret med TCA 10% og farvet med sulforhodamin B (SRB) (Sigma) og et kolorimetrisk assay blev udført som tidligere beskrevet [26]. PARP inhibitor BMN673 var en gave fra Biomarin Pharmaceuticals, USA. Mirin blev købt fra Calbiochem.

siRNA Og transfektioner

For at vælte menneske

MRE11

vi brugte tre forskellige siRNAs (Microsynth, Schweiz) ved hjælp RNAimax (Gibco af LifeTechnologies) i henhold til producentens anvisninger. De målsekvenser (sense) var: GCUAAUGACUCUGAUGAUATT [27], GAGCAUAACUCCAUAAGUATT [28], og GAUGCCAUUGAGGAAUUAGTT [29]. Som en kontrol blev celler transficeret med siRNA mod luciferase (sense): CGUACGCGGAAUACUUCGATT. Celler blev podet 48 timer efter transfektion og behandling begyndte 72 timer efter transfektion (PARP-inhibitor, bestråling).

Analyse af RAD51 Foci Formation

Nuclear RAD51 foci blev visualiseret og kvantificeret som tidligere beskrevet [26 ] og anvendes som surrogatmarkører for induktion af DNA DSB’er og kompetent HR DNA-reparation, hhv. Kort fortalt blev celler dyrket på dækglas (12 mm, Thermo Scientific) og eksponeret for 10 Gy af IR. Efter 4-6 timers restitution, blev cellerne fikseret, permeabiliseret, og immunfarvet med primære antistoffer mod RAD51 (polyklonale kaninantistof, Santa Cruz) og detekteret med Alexa mel 488 (Invitrogen). Kerner blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindol (DAPI). Tilstedeværelsen af ​​RAD51 foci blev evalueret i et minimum af 100 celler i tre uafhængige forsøg med en automatiseret inverteret fluorescens mikroskop (LEICA-DMI6000 B).

Statistisk analyse

Den statistiske evaluering blev udført med SPSS software Version 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). De scoring data MRE11, RAD50, og NBS1 blev dikotomiseret til “negative” (ingen udtryk) og “positive” (svag, moderat eller stærkt udtryk). Den statistiske signifikans af sammenhængen mellem disse molekyler, og misforholdet reparation proteinekspression samt klinisk-patologiske parametre blev vurderet ved Chi

2 test for tendenser og Fishers eksakte test. Desuden blev Spearmans korrelation anvendes til at evaluere en associering mellem MRE11, RAD50, NBS1, og mismatch-reparation proteiner. Sandsynligheden for samlet overlevelse som en funktion af tiden blev bestemt ved Kaplan-Meier-metoden. Forskelle i overlevelseskurverne blev sammenlignet ved log rank test. Følsomhed kurver blev beregnet i GraphPad Prism version 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA) og statistiske forskelle mellem IC50-værdier blev vurderet ved hjælp af F-test. Generelt blev p-værdier mindre 0,05 betragtes som signifikant.

Resultater

MRN-kompleks Udtryk og associeringsaftaler med Uoverensstemmelse Repair Protein status og klinisk-patologisk Faktorer

immunhistokemisk analyse af MRE11 , RAD50, og NBS1 lykkedes 456, 466, og 458 endometriske carcinomer, henholdsvis på grund af den manglende tumorvæv i nogle TMA pletter. Alle molekyler viste en nuklear mønster farvning. Blandt de 521 endometriske carcinomer patienter 30,7% (132/430) viste et fuldstændigt tab af MRE11 (fig. 1A, og tabel 1). Expression tab af MRE11 signifikant korreleret med protein tab af de andre MRN-komplekse medlemmer RAD50 og NBS1. Tab af MRN-kompleks protein blev også signifikant associeret med mismatch reparation proteinekspression samt med FIGO stadium og histologisk klassificering (tabel 3). I Kaplan-Meier analyse, FIGO stadie, histologisk undertype, sortering og patientens alder var prognostiske faktorer (log rank, p-værdi 0,0001 for alle parametre). Men protein udtryk for MRE11 (log rank, p = 0,867), RAD50 (log rank, p = 0,986) og NBS1 (log rank, p = 0,991) var ikke forbundet med den samlede overlevelse. Desuden sekventering af poly (T) 11 allel af

MRE11

i genomisk DNA fra EF tumorer (n = 26; tabel 2) viste, at mutationer var hyppigere i tumorer med tab af MRE11 end hos dem, der udtrykker MRE11 , men mutationen status var ikke yderst prædiktive for proteinet status MRE11

A, negativ (fuldstændig tab af MRE11 proteinekspression).; B, + (svag nuklear ekspression); C, ++ (mellemprodukt nuklear ekspression); D, +++ (stærke kernekraft udtryk).

Tab af MRE11 er associeret med høj følsomhed til PARP Hæmning

Blandt et panel af EF-cellelinjer, AN3CA udstillede næsten fuldstændig MRE11 proteintab samt markant reducerede niveauer af RAD50 og NBS1 (fig. 2A). Sekventering af intronisk region MRE11 i denne cellelinie bekræftede den tidligere beskrevne homozygote poly (T) 9 mutation i AN3CA (fig. 2B) [11]. Ved PARP-inhibitor behandling med BMN673, AN3CA viser den højeste følsomhed blandt panelet for endometriecancer cellelinier testet (fig. 3C).

A, Western-blot der viser ekspression status MRE11, NBS1 og RAD50 i 10 endometriske carcinoma cellelinier. Kun cellelinien AN3CA indeholder en mutation af MRE11, hvilket fører til en dramatisk reduceret ekspression af MRE11. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. B, kolonidannelse assays demonstrerer følsomhed for PARP-inhibitor (BMN673) i 10 endometriske carcinoma cellelinier: alle cellelinier blev behandlet i triplikater i 14 dage. Overlevelse er repræsenteret i procent af kontrol (DMSO behandlet). De cellekolonier blev kvantificeret ved anvendelse af en kolorimetrisk metode (SRB).

A, Effektivitet af siRNAs på forskellige tidspunkter efter transfektion vist ved western blotting. B, Sensitivity assay (kolorimetrisk med SRB): alle cellelinier blev behandlet med PARP-inhibitor (BMN673) i triplikater i 14 dage. Overlevelse er repræsenteret i procent af kontrol (DMSO behandlet). Knock ned af MRE11 med tre forskellige sæt siRNAs føre til en øget følsomhed over PARP-inhibering i endometriekarcinom cellelinier HEC1A (8 gange stigning, p 0,0001) og HEC-116 (6-fold stigning, p = 0,0006). C, Cellelinier blev behandlet med den MRE11-inhibitor mirin i en slutkoncentration på 30 uM i triplikater i 10 dage. Overlevelse blev vurderet ved en kolorimetrisk følsomhed assay (SRB) og er vist i procent af kontrol (DMSO behandlet). Behandling med MRE11-inhibitor mirin føre til øget følsomhed over for PARP hæmning i både, HEC1A (2,6-dobling, p = 0,001) og HEC-116 (17-dobling, s 0,0001)

Knock-down og hæmning af MRE11 sensibiliserer celler til BMN673 grund Nedsat HR

Da tab af MRE11 udtryk i AN3CA var forbundet med betydelig følsomhed over for PARP hæmning, vi spurgte, om udtømning af MRE11 af siRNA generelt ville føre til en forøget følsomhed over for PARP-inhibitor BMN673. For at teste denne brugte vi et panel af EF-cellelinjer, der udtrykte normale niveauer af MRE11 (fig. 2A) og var også modstandsdygtige over for PARP hæmning (fig. 2C). Effektiviteten af ​​siRNA behandling blev bedømt ved Western blotting. I begge cellelinier, transfektion med MRE11 siRNA effektivt depleteret endogene MRE11 (fig. 3A). Dernæst vurderes PARP inhibitor følsomhed i MRE11-depleterede celler ved kolonidannelse. Efter udtømning af MRE11, vi konsekvent observeret et signifikant fald i cellelevedygtighed i nærvær af BMN673 (fig. 3B). For at teste om MRE11 nukleaseaktivitet er påkrævet for PARP-inhibitor modstand, dyrkede vi to cellelinier i nærvær af MRE11 inhibitor mirin og behandlede dem med BMN673 (fig. 3C). I begge tilfælde havde mirin en negativ virkning på cellelevedygtigheden som respons på PARP-inhibering, hvilket kraftigt antyder, at MRE11 nukleaseaktivitet er påkrævet for PARP-inhibitor modstand. For at bekræfte at banke ned af MRE11 fører til forringet HR, vi bestemt cellernes evne til at danne RAD51 foci som reaktion på ioniserende stråling (IR) (se fig. 4A). Faktisk ved nedregulering af

MRE11,

færre RAD51 foci per celle kunne observeres (fig. 4B). Den Capan-1 pancreatisk cellelinie kendt for at være HR-deficiente grund af en mutation af

BRCA2

tjente som kontrol (data ikke vist). Salg

A, immunofluorescens-billeder, der viser DAPI-farvede kerner (blå) og RAD51 foci (grøn) i repræsentative områder af HEC-1A og HEC-116 endometrial carcinomceller. Både vildtype MRE11 udtrykkende cellelinjer blev enten behandlet med tre forskellige sæt af siRNAs for MRE11 eller med siRNA for luciferase (siLuc) som en kontrol. De transficerede celler blev derefter eksponeret for 10 Gy af bestråling eller ikke eksponeret, som angivet. B, RAD51 foci-dannelse er vist som en procentdel af RAD51 foci positive celler (over 5 foci per celle blev vurderet som positiv) uden behandling og 6 timer efter 10 Gy bestråling. Et minimum af 100 celler blev talt for at bestemme RAD51 foci-dannelse frekvens i tre uafhængige forsøg. ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Diskussion

Dette er den første rapport, der viser, at ikke kun protein udtryk for MRE11 men også udtryk for andre medlemmer af MRN-komplekset, RAD50 og NBS1, er faret vild i en væsentlig del af ECS. Endvidere observerede vi en signifikant sammenhæng mellem protein tab af alle MRN medlemmer samt fejlparringsreparationsprotein, status i dette store datasæt. Protein udtryk for MRN-komplekset er endnu ikke blevet undersøgt i EF-tumorer. I blærekræft har MRE11 vist sig at udvise prædiktive egenskaber til strålebehandling behandling [30]. Desuden fuldstændig tab af MRN-komplekset i MSI positive kolorektal kræft er en hyppig begivenhed [31], mens tab af MRE11 i brysttumorer findes kun i 9% af tilfældene [32].

Selv om en klar sammenhæng mellem mutationsstatus og tab af protein-ekspression kunne ikke findes i denne undersøgelse, er det bemærkelsesværdigt, at en høj korrelation af protein tab af alle MRN medlemmer samt MSI status blev fundet i denne store datasæt. Forstyrrende resultater på mutations status MRE11 polyT (11) allel kan være relateret til kendte vanskeligheder i sekventering af MRE11 polyT (11) allel grund mispairing af polymeraseenzymet [33].

En tidligere undersøgelse afsløret høj frekvens af ændringer af DSB reparation gener i MSI positiv EC’er, hvor MRE11 og RAD50 udstillet heterozygot og homozygote mutationer i 51% og 17%, henholdsvis uden at undersøge konsekvenserne af tabet af proteinerne [6]. Mutationer af MRE11 polyT (11) allel er overvejende heterozygote mutationer og det er blevet foreslået, at kun dem med mutationer af to og flere nukleotider samt homozygote mutationer har en funktionel virkning i form af tab af funktion [11], [12] , [34], [35]. I denne rapport, kan vi ikke bekræfte den høje frekvens af intron mutationer, men bevise, at MRE11 protein er tabt i en væsentlig del af EC’er. For nylig er det blevet vist, at hele exon sekventering af MRE11 afslørede mutationer i 1,9% (2 ud af 107) i EF tumorer inden exonerne [36]. Imidlertid har intron mutationer ikke er blevet vurderet, at forklare, hvorfor hyppigheden af ​​

MRE11

mutationer er rapporteret til at være lav, ikke kun i studiet efter Pris et al. [36], men også i en nylig én af The Cancer Genome Atlas Research Network [5].

PARP-inhibitorer har vist bemærkelsesværdige følsomhed i BRCA1 /2-mangelfulde tumormodeller

in vitro

samt som i kliniske forsøg med bærere af

BRCA1 /2

kim linje mutationer. Yderligere udvikling beviser, foreslår imidlertid, potentialet for en bredere anvendelsesområde for PARP hæmmer aktivitet [16]. Faktisk for EF har vi tidligere foreslået tab af PTEN udtryk som en potentiel biomarkør til behandling med PARP-hæmmere baseret på prækliniske data [26] samt på en klinisk tilfælde rapport [37]. Andre undersøgelser har imidlertid været spørgsmålstegn rolle

PTEN

i HR, hvilket tyder på, at dette kan være en cellelinje specifik fænomen [38], [39]. Ikke desto mindre er den nøjagtige mekanisme af inddragelse af

PTEN

i HR DNA-reparation mangler at blive belyst.

Tab af MRE11 udtryk er blevet foreslået at bevidstgøre kolorektal [35], [38], [ ,,,0],40], bryst [41] og hæmatologiske [42] kræft cellelinjer til PARP-hæmmere på grund af forringet HR DNA-reparation. Vores rapport foreslår, for første gang, den potentielle anvendelse af PARP-inhibitorer i behandlingen af ​​endometriecancer baseret på prækliniske fund. Der er stigende tegn på, at patienter, der lider af endometriecancer og ikke udtrykker MRE11 kunne behandles med BMN673. Dette understøtter brugen af ​​MRE11 som en prædiktiv biomarkør for PARP behandling.

Som konklusion, denne undersøgelse viser, at i) fuldstændigt tab af MRN-komplekset er en hyppig begivenhed i EF, ii) tab af MRE11 udtryk samt som gene silencing og farmakologisk inhibering af nukleaseaktiviteten fører til følsomhed over for PARP-inhibering

in vitro

, og iii) tab af MRE11 er forbundet med mangelfuld HR DNA-reparation påvist efter bestråling. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at MRE11 udtryk kan anvendes som en potentiel prædiktiv biomarkør for effektiviteten af ​​PARP-hæmmer behandling i livmoderkræft med MSI.

Tak

Vi takker Martina Storz, André Fitsche og Sonja Brun-Schmid for fremragende teknisk bistand, og Markus Rechsteiner for nyttige diskussioner. Vi takker Steve Jackson for at levere offentliggjorte reagenser og Biomarin Pharmaceuticals for gaven af ​​deres PARP-inhibitor BMN673.