PLoS ONE: Palliation of Bone Cancer Pain af antagonister af blodpladeaktiverende Factor Receptorer

Abstrakt

Bone kræft smerte er den mest alvorlige blandt cancersmerter og er ofte resistente over for de aktuelle analgetika. Således er udviklingen af ​​nye analgetika effektiv til behandling knoglekræft smerte ønskes. Blodpladeaktiverende faktor (PAF) -receptorantagonister blev for nylig påvist at have effektive smertestillende virkninger på neuropatisk smerte i flere dyremodeller. Den foreliggende undersøgelse undersøgte smertelindrende effekt af PAF-receptor-antagonister på smerte knoglekræft hjælp lårben knoglekræft (FBC) model i mus. Dyr blev injiceret med osteolytiske NCTC2472 celler i skinnebenet, og efterfølgende virkningerne af PAF receptorantagonister på smerte adfærd blev evalueret. Kemisk strukturelt anden type antagonister, TCV-309, BN 50739 og WEB 2086 lindres den allodyni og forbedrede smerte adfærd, såsom bevogtning adfærd og lemmer anvendelse abnormiteter i FBC model mus. Den smertelindrende virkning af disse antagonister blev opnået med lave doser og blev langvarig. Blokade af spinal PAF receptorer ved intratekal injektion af TCV-309 og WEB 2086 eller knockdown af ekspressionen af ​​spinal PAF-receptor-protein ved intratekal overførsel af PAF-receptor siRNA også produceret en smertelindrende effekt. Mængden af ​​en inducerbar PAF syntese enzym, lysophosphatidylcholin acyltransferase 2 (LPCAT2) protein steget betydeligt i rygmarven efter transplantation af NCTC 2472 tumorceller i mus skinneben. Kombinationen af ​​morfin med PAF receptorantagonister udvikler markant forøgelse af den analgetiske virkning mod smerter knoglekræft uden at påvirke morfin-induceret forstoppelse. Gentagen administration af TCV-309 undertrykte udseende smerte adfærd og langvarig overlevelse FBC mus. De foreliggende resultater tyder på, at PAF-receptor-antagonister i kombination med, eller uden, kan opioider udgør en ny strategi til behandling af vedvarende smerter knoglekræft og forbedre livskvaliteten for patienter

Henvisning:. Morita K, Shiraishi S, Motoyama N, Kitayama T, Kanematsu T, Uezono Y, et al. (2014) Palliation af Bone Cancer Pain af antagonister af blodpladeaktiverende faktor receptorer. PLoS ONE 9 (3): e91746. doi: 10,1371 /journal.pone.0091746

Redaktør: Theodore John Price, University of Arizona, USA

Modtaget: 16 oktober, 2013; Accepteret: 14 februar 2014; Udgivet: 17 Marts 2014

Copyright: © 2014 Morita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Grants-in Støtte til videnskabelig forskning (B) 22.390.349, (C) 21.592.421 og (C) 24.592.798 fra den japanske Society for Fremme af Sciences og af National Research and Development Fund Cancer center (23-A-30 ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

smerter i kræft er produceret af pres på, eller kemisk stimulering af specialafdelinger smerte-signalering nerveender kaldes nociceptorer (nociceptive smerter), eller det kan være forårsaget af skader eller sygdom påvirker nervefibre selv (neuropatisk smerte), som reagerer på stimuli, der normalt ikke-smertefuld; allodyni. Knoglekræft smerte er en af ​​de mest almindelige og sædvanligvis alvorlige smertetilstande hos kræftpatienter [1].

Opioider er fortsat grundlaget for cancer smertebehandling, men ud over de akutte bivirkninger langsigtede konsekvenser af tolerance, afhængighed, hyperalgesi og undertrykkelsen af ​​de hypothalamus /hypofyse-aksen bør anerkendes. Fordi de nuværende tilgængelige behandlinger er relativt ineffektive mod smerte knoglekræft, næsten halvdelen af ​​kræftpatienter har utilstrækkelig smertebehandling [2], [3]. Således er udviklingen af ​​hidtil ukendte analgetika effektiv til behandling knoglekræft smerte er nødvendige.

Vi har tidligere foreslået, at blodplade-aktiverende faktor (PAF) kan være en mediator af neuropatisk smerte. PAF injektion i musen rygmarven forårsagede termisk hyperalgesi og taktil allodynia, som var i det mindste delvist medieres af spinal dysfunktion af glycin-receptor α3 (GlyRα3) og blev blokeret af PAF receptorantagonister [4], [5]. Efterfølgende undersøgelser viste PAF-receptor blokade reduceret smerte adfærd fremkaldt i nerveskade modeller. En PAF-receptor-antagonist, CV-3988, injiceres nær den dorsale rodganglier (DRG) i rotter eller mus, som mangler PAF receptorer viste en reduktion i taktil allodyni efter spinal nerveskade [6]. Intrathecal injektion af PAF-receptor-antagonist, WEB 2086, et benzodiazepin-derivat i 9 dage efter kirurgi hos rotter undertrykt udvikling af mekanisk allodyni i en rotte skånet nerveskade model [7]. PAF receptorantagonister, TCV-309 (PAF beslægtet), BN 50739 (naturprodukt beslægtet forbindelse), og WEB 2086, produceret dybe og langvarige anti-allodyni virkninger i flere forskellige neuropatisk smerte modeller i mus, herunder en delvis iskiasnerven ligering skade model, en delvis infraorbitale nerve ligation model, en kronisk sammensnøring af infraorbitale nerveskade model (CCI-model) og en streptozotocin (STZ) -inducerede diabetes model [8]. Det tyder på, at PAF bidrager til neurale vævsskade og smerte adfærd efter nerve skade.

De dyremodeller ovenfor undersøgte smerter på grund af knoglekræft, hvor tumorceller injiceres lokalt i knoglen. Den foreliggende undersøgelse anvendte lårbenet knoglekræft (FBC) model i mus [9]. Dyrene blev injiceret med osteolytiske NCTC2472 celler, og efterfølgende virkningerne af PAF-receptor-antagonister på smerte adfærd blev evalueret.

Materialer og metoder

forsøgsdyr

blev udført Eksperimenterne hjælp mandlige C3H /HeN mus (CLEA Japan, Inc., Tokyo), der vejer 20-25 g. Alle eksperimentelle procedurer og håndtering af dyr blev udført i henhold til både de ledende principper for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr er godkendt af den japanske Farmakologisk Samfund og retningslinjerne i Hiroshima University, Hiroshima, Japan og retningslinjerne i National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan. Protokollen blev godkendt af udvalget om etik af dyreforsøg i Hiroshima University (Permit nummer: A-09-17 og A-11-16), og af National Cancer Center (Permit nummer: T11-004-M02) . Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Dyrene blev anvendt til kun én måling i hvert forsøg

lårbenet Bone Cancer (FBC) Model

Mus

For FBC model NCTC 2472 tumorceller (American Type Cuiture Collection, ATCC.; Manassas, VA, USA) blev injiceret i marvhulen af ​​den distale femur af C3H /HeN mus [9]. De NCTC 2472 celler blev opretholdt i Dulbeccos Modified Eagles Medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle produkterne fra Gibco Laboratories); og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 derefter passeret ugentligt ifølge ATCC retningslinjer. Til indgivelse blev celler løsgøres ved skrabning og derefter centrifugeret ved 900 rpm i 3 min. Pelleten blev suspenderet i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og derefter anvendt til intratibial injektion.

I implantation blev tumorceller injiceret følge protokollen beskrevet tidligere af Honoré et al. [9] med mindre modifikation. Kort fortalt blev C3H /HeN mus bedøvet med en natriumpentobarbital (60 mg /kg) i.p. injiceres. For intratibial inokulering af celler, højre knæ på hver mus var bøjet og placeret overfor forsøgslederen, og en minimal hud indsnit udsætte tibiale plateau. En 25 gauge dental reamer blev anvendt til at perforere tibiale plateau og, når fjernet, blev en 30 gauge nål forbundet til en Hamilton-sprøjte fyldt med cellesuspensionen forsigtigt indføres i marvhulen af ​​skinnebenet. Derefter blev 10

5 NCTC 2472 celler suspenderet i 5 pi HBSS injiceres langsomt (levende celler). Kontrolgrupperne blev injiceret med 5 ul HBSS eller HBSS indeholdende 10

5 NCTC 2472 celler dræbt ved hurtigt nedfrysning og optøning dem to gange uden kryobeskyttelse og derefter vask med frisk HBSS (dæmpe celler). Endelig blev Caviton EX, en tand-grade hydrauliske midlertidig fugemasse (GC Dental Products, Co. Ltd., Tokyo, Japan) anvendes på den tibiale plateau indridset område og den kirurgiske procedure blev afsluttet med syning af knæet hud. Legemsvægte blev registreret for hver mus hver 3. dag under hele undersøgelsen. Dyrene blev aflivet efter vægttab på mere end 20% af kropsvægten eller ved at demonstrere relaterede symptomer som alvorlige ataktiske bevægelser eller andre neurologiske abnormiteter grundet etiske overvejelser.

Drug Administration

Gabapentin (1 – (aminomethyl) -cyclohexaneddikesyre) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Morfin blev opnået fra Takeda Pharmaceutical Co., (Osaka, Japan). WEB 2086 (3- [4- (2-chlorphenyl) -9- methyl-6

H

thieno [3,2

f

] [1], [2], [ ,,,0],4] triazolo [4,3

en

] [1], [4] diazepin-2-yl] -1- (4-morpholinyl) -1-propanon) blev opnået fra Tocris Bioscience ( Ellisville, MO). TCV-309 (3-brom-5 – [

N

phenyl

N

– [2 – [[2- (1,2,3,4-tetrahydro-2-isoquinolyl – carbonyloxy) ethyl] carbamoyl] ethyl] carbamoyl] -1-propylpyridinium nitrat), og BN 50739 (tetrahydro-4,7,8,10methyl- (chlor-2phenyl) 6 [dimethoxy-3,4- phenylthio] methylthiocarbonyl-9 pyrido [4 ‘, 3’-4,5] thien [3,2

f

] triazol-1,2,4 [4,3

en

] diazepin-1, 4) blev doneret fra Takeda Pharmaceutical Co., og Institut Henri Beaufour henholdsvis.

TCV-309 og WEB 2086 blev hver opløst i sterilt kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) eller saltvandsopløsning. BN 50739 blev opløst i et opløsningsmiddel indeholdende 25% 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Sigma /RBI, Natick, MA) og destilleret vand, pH justeret til -6 anvendelse af 1 N NaOH, og fortyndes passende med ACSF eller saltvand. Andre reagenser blev opløst i ACSF eller saltvand. Det stof opløsninger blev frisk fremstillet på hver forsøgsdag. ACSF sammensætning (i mM) var NaCl 142, KCl 5, CaCl

2 2H

2O 2, MgCl

2 · 6H

2O 2, NaH

2PO

4 1,25, D glucose 10, HEPES 10, pH 7,4. TCV-309, BN70329, eller WEB 2086 blev indgivet intravenøst ​​30 min-3 timer før smerte vurdering.

Knockdown af PAF receptor i rygmarven

Knockdown af PAF-receptoren blev udført i overensstemmelse med en foregående rapport [5]. siRNA’er blev inkorporeret i hæmagglutinerende virus af Japan (HVJ) -Envelope vektor ifølge fabrikantens anvisninger. Kort fortalt, efter blanding 40 pi (1 assay enhed, AU) i HVJ-Envelope Vector med 4 pi af det omsluttende faktor blev blandingen centrifugeret (10.000 x

g

, 10 min, 4 ° C), og pelleten suspenderet i 10 pi pufferopløsning. Derefter blev 10 pi af en blanding af 3 siRNAs opløsning (# 1, # 2 og # 3, 1 pg /pl hver) tilsat, og blandingen blev holdt på is i 5 min. Sterile ACSF (10 pi) indeholdende syntetiske siRNA-duplexer (0,45 pmol /dyr) blev injiceret i subarachnoide rum mellem L5 og L6 hvirveldyr af bevidste mus. Sekvenserne af siRNA oligonukleotid (sense) var som følger: PAF-receptor (# 1, 5′-CACCUCAGUGAGAAGUUUUACAGCA-AG-3 ‘; # 2, 5′-ACCCUUCCAAGAAACUAAAUGAGAU-AG-3′; # 3, 5’-CAACUUCCAUCAGGCUAUUAAUGAU- AG-3 ‘; targeting sekvenser omkring position 1005-1029, 232-256, 893-917, henholdsvis i

pafr

, GenBank ingen D5087).. Endvidere blev uoverensstemmende siRNA med tre eller fire nukleotid-fejlparringer rede til at undersøge uspecifikke virkninger af siRNA-duplexer (siRNA # 4, 5′-ACUCUGCCAAGAGACUACAUGAGAU-AG-3). Disse udvalgte sekvenser blev også forelagt en BLAST-søgning (Bioinformatik center Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japan) mod muse-genomet sekvens for at sikre, at kun ét gen i muse-genomet blev målrettet. siRNA’er blev købt fra iGENE Therapeutics Inc. (Tsukuba, Japan).

Behavioral Analysis i FBC Model

adfærdsanalyse prædannedes følge protokollen beskrevet tidligere [5], [10]. De smerte-relaterede adfærd i FBC modellen blev evalueret før og efter administration af lægemidlet på 11 dage efter tumor implantering. De eksperimentelle og skinopererede dyr blev bedømt for igangværende smerte baseret på bevogtning adfærd, for ambulant smerte baseret på lemmer brug abnormitet, og for allodyni-lignende opførsel baseret på von Frey filament test og pensel test. Bevogtning adfærd, lemmer brug abnormitet og allodyni-lignende smerter blev vurderet i de samme dyr. Musene blev anbragt i en klar plast observation box og fik lov til at vænne i 15 min. Derefter blev spontan bevogtning adfærd vurderes i løbet af en 2-min observationsperioden. Ophævelsen cirka bagpoten på den ipsilaterale side under gang blev målt som bevogtede adfærd. Limb-brug abnormitet blev scoret på en skala fra 0 til 4: 0, normal brug af lemmer; 1, let halte; 2, klar halte; 3, delvis manglende brug af lemmer; og 4, komplet manglende brug af lemmer. Allodyni-lignende opførsel blev vurderet ved let strøg benskade med en pensel (allodyni score) eller vurderet ved måling tærsklen for potetilbagetrækning i afhængighed af probing med en række af kalibrerede fine filamenter (allodyni tærskel) som rapporteret tidligere [5]. Det allodyni point er rangeret som beskrevet af Minami et al. [11]: 0, intet svar; 1, mild knirkelyde med forsøg på at bevæge sig væk fra strøg sonde; 2, kraftig pibende, bide strøg sonde og stærke bestræbelser på at flygte fra den strøg sonde. Værdier er gennemsnittet af den samlede score evalueret 3 gange ved hvert tidspunkt (muligt maksimum score på hvert tidspunkt: 2 /mus). Vagten gange var signifikant forlænget ved 5 og 6 dage efter tumor implantering i forhold til værdierne ved præ-implantation. Tilsvarende dyr også begyndt at udvise abnorm lemmer-brug på 5 dage efter tumor implantering, og sådan unormal adfærd var mere fremtrædende i de senere dage. Tærsklen allodyni blev vurderet ved måling tærsklen for potetilbagetrækning som reaktion på probing med von Frey-monofilamenter, og væsentlige tærskelværdier fald blev observeret efter 3

rd dag efter tumorimplantation forhold til værdierne ved præ-implantation, og faldet nået en top efter 5 og 7 dage. Allodyni score blev vurderet ved at måle rangeret respons på let strøg med en pensel, og væsentlige score stigninger blev set efter den 4-dag efter tumorimplantation forhold til værdierne ved præ-implantation, og stigningen toppede efter 6 og 8 dage. I hele eksperimentet blev adfærdsmæssig testning udført ved blind af en enkelt eksperimentator. Injektioner blev udført blind af en anden person. Intratekal injektion blev udført som tidligere beskrevet [4].

Bestemmelse af Lyso-PAF-acetyltransferase (Lyso-PAF AT) /Lysophospha- tidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), en PAF Synthesis Enzyme

columna regioner af rygmarven (L2-L6) blev opnået fra sham-opererede (dæmpe celler implanteret) eller tumorbærende mus. Rygmarven væv (4,8-5,0 mg) blev homogeniseret i 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) indeholdende 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, 10 mM p-glycerophosphatopløsninger og 1 ug /ml af forskellige proteaseinhibitorer ( benzamdine, leupeptin og antipain). Homogenatet blev omsat med 0,6% NP-40 i 5 minutter ved 4 ° C efterfulgt af centrifugering ved 15.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev opnået. Supernatanten blev blandet i et volumen ration af 04:01 i 10 mM Tris-HCI (pH 6,8) indeholdende 10% (vol /vol) glycerol, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,01% bromphenolblåt og 0,5% β-mercaptoethanol med efterfølgende kogning ved 70 ° C i 30 min.

Immunoblotting Assays Salg

De opnåede prøver blev underkastet elektroforese i 2 timer ved stuetemperatur på polyacrylamidgeler (stacking gel 3% og adskillende gel 10% ) og derefter blottet til polyvinylidenfluorid membraner tidligere er behandlet med 100% methanol. De overførte proteiner på membranerne blev blokeret ved inkubering med blokerende opløsning, 5% skummetmælk-holdig vaskepuffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 137 mM NaCl og 0,1% Tween 20), ved 25 ° C i 1 time. Membranerne blev eksponeret for det primære antistof som følger: mod LPCAT2 (1:1,000; slgM); mod β-actin (1:1,000; IMGENEX Innovations i Functional Genomics, SanDiego, CA) fortyndet med vaskepufferen indeholdende 1% skummetmælk natten over ved 4 ° C, efterfulgt af vask tre gange med vaskebuffer, og derefter inkubation med et sekundært antistof som følger: for LPCAT2 antistof og β-actin-antistof, et anti-kanin IgG-antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (1:2,000; DakoCytomation, Glostrup, Danmark) ved stuetemperatur i 1 time. Membranerne blev igen skyllet tre gange med vaskepufferen og udviklet med en forøget kemiluminescens (ECL) vestlige detektionssystem (ECL reagenser, købt hos Thermo Fisher Scientific, og Nacalai Tesque Inc., Kyoto Japan; ImageQuant ™ LAS 4000 mini registreringssystem, GE healthcare Japan, Tokyo, Japan). Tætheden af ​​hvert bånd blev analyseret ved anvendelse af NIH Image software, og de densitometriske enheder blev justeret på basis af værdien af ​​β-actin. Dataene er udtrykt som middelværdien ± SEM.

Morfin obstipation

Mus blev tilvejebragt foder og vand ad libitum før testperioden og begge (med eller uden TCV-309) grupper forbruges sammenlignelige mængder af mad forud for testen målt over en 24-timers periode i testmiljøet. Ingen mad eller vand var tilgængelig under testen. Musene blev bur i akryl kasser med gitter gulve ophængt over filtrerpapir. Fækale boli blev opsamlet fra hver gruppe af mus hver time i 1 time efter injektion af saltvand eller forskellige doser af morfin og vægten af ​​fækalt boli blev registreret som et indeks for de obstiperende virkninger af morfin.

Generering af Kaplan-Meier overlevelseskurver

sundhed af musene blev undersøgt dagligt. Mus, der præsenteres med tegn på dårligt helbred blev dræbt ved cervikal dislokation ifølge anbefalingerne i vores etiske udvalg. Det er vores erfaring, disse tegn forud dødstidspunktet af et par dage. Dødstidspunktet blev registreret for hver mus, der blev fundet død eller blev dræbt. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret ved hjælp Graphpad Prism-software (version 4, Graphpad, Inc, San Diego, Californien)

Statistiske Analyser

Alle data er rapporteret som værdier af middelværdien ± SEM. (standardfejl på middelværdi). GraphPad Prism software version 4 blev anvendt til at udføre den statistiske analyse. Med hensyn til den statistiske analyse af smerte-relaterede adfærd, sammenligninger af allodynis selv, tilbagetrækningstærskel, bevogtning adfærd og lemmer brug abnormitet af forskellene mellem lægemiddelbehandlede grupper og køretøjet-behandlede gruppe blev vurderet ved hjælp af to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer test, eller en uparret Students

t

-test. Sammenligninger af median overlevelse blev udført ved hjælp af log-rank og Gehan-Breslow-Wilcoxon test. En sandsynlighed (P) af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Virkninger af systemisk administration af specifik PAF receptor antagonister på taktil allodynia og Pain opførsel i FBC Model mus

.

effekter af TCV-309 på allodyni og smerte adfærd (bevogtning adfærd og lemmer brug abnormitet) blev undersøgt i FBC model mus. TCV-309 med en afstand af 10-300 ug /kg ved i.v. dosisafhængigt reduceret allodyni score (figur 1A) og øget tilbagetrækning tærskel (figur 1B) på 11 til 15 dage efter tumorimplantation i musene. Virkningerne af TCV-309 var ganske langvarig. For eksempel TCV-309 lindres mekanisk allodyni betydeligt ved en enkelt injektion af 100 ug /kg, i.v. med en maksimal effekt på 1 til 2 dage efter injektionen op til 6 dage. Bevogtning adfærd blev kontinuerligt forværret under observationsperioden, mens lemmer brug abnormitet nåede en maksimal respons og fortsatte i perioden (figur 1C, 1D). Bevogtning adfærd og lemmer brug abnormitet blev også forbedret ved TCV-309. TCV-309 op til 1 mg /kg påvirkede ikke generelle adfærd eller motorisk funktion anslået af rotarodtesten (data ikke vist). Andre PAF-receptor-antagonister, BN 50739 og WEB 2086, også forbedres de allodyni og smerte adfærd i FBC model mus (Figure1E-1H).

TCV-309 0,01-0,3 mg /kg, WEB 2086 0,1 mg /kg, BN 50739 0,1 mg /kg eller et køretøj blev injiceret intravenøst ​​ved 11 dage efter tumortransplantation. Kontrolmus modtog injektioner med et køretøj: saltvand eller 25% 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. De smerte-relaterede adfærd, der er udviklet efter tumor implantation i mus blev ikke påvirket af køretøjer behandlinger. Værdier repræsenterer middel ± SEM. n = 11 mus per gruppe. † P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med den tilsvarende kontrol (køretøj behandlet) værdier, som bestemt ved analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer test

Virkninger af Blokade af Spinal PAF receptorer på. allodyni og Pain opførsel i FBC Model Mus

for at bekræfte det sted cancersmerter lindring af PAF-antagonister, virkningerne af intratekal injektion af TCV-309 og WEB 2086, og også indblanding i angivelsen af ​​spinal PAF-receptorer ved hjælp siRNA af PAF-receptor-mRNA blev undersøgt. Spinal indgivelse af 10 pg af disse lægemidler 13 dage efter tumorimplantation produceret hurtigt og markant undertrykkelse af taktil allodynia med maksimal effekt ved 1 dag efter implantation og undertrykte signifikant allodyni inden for 4 dage (figur 2A). virkninger Pain release evalueret af tilbagetrækningstærskel, bevogtning adfærd og lemmer brug abnormitet af intratekal injektion af TCV-309 og WEB 2086 blev også opnået (figur 2B-2D)

(A-D).; Tumorceller blev implanteret i intramedulla af venstre lårben knogle 13 dage før intrathekale (i.t.) injektion af PAF receptorantagonister. TCV-309 (10 pg /mus), blev WEB 2086 (10 pg /mus) eller køretøjet injiceret intratekalt på tidspunktet “0”. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM., N = 8-12 mus pr gruppe. * P 0,01 sammenlignet med den tilsvarende kontrol (køretøj behandlet) værdier, som bestemt ved analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer test. Kontrolmus fik injektioner med et køretøj: ACSF. De smerte-relaterede adfærd, der er udviklet efter tumor implantation i mus blev ikke påvirket af køretøjet behandlinger. (E-H); siRNA eller uoverensstemmende siRNA af PAF-receptor-mRNA blev transficeret ind i rygmarven 13 dage efter tumorimplantation. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. n = 8-10 mus per gruppe. † P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med den tilsvarende kontrol (uoverensstemmende siRNA transfektion) værdier, som bestemmes ved analyse af valiance efterfulgt af en uparret Students

t

-test. Kontrolmus fik injektioner med uoverensstemmende siRNA eller et køretøj: Kun HVJ-kuvert. De smerterelaterede adfærd, der er udviklet efter tumorimplantation i mus blev ikke påvirket af fejlparrede siRNA eller vehikel behandlinger.

Knockdown af ekspressionen af ​​spinal PAF-receptor-protein blev opnået ved intratekal overførsel af PAF-receptor siRNA i mus. Som tidligere rapporteret, en signifikant reduktion i PAF-receptor-ekspression i normale mus og mus 15 dage efter operationen på iskiasnerven, og nåede 37,5 ± 5,4% og 29,9 ± 4,9% af kontrollen ved 3 dage efter siRNA transfektion, hvorimod udtrykket blev ikke ændret ved den HVJ-E vektor alene eller uoverensstemmende siRNA [5]. Ved siRNA transfektion 13 dage efter tumor implantation, den allodyni score, tærskel tilbagetrækning, bevogtning adfærd en lem-brug abnormitet blev forbedret med maksimal effekt på 2 til 3 dage efter siRNA transfektion, mens smerte-lindring handling gradvist forsvundet over 9 dage (Figur 3E-3H). Injektion af forkerte siRNA havde ingen effekt på udviklingen af ​​allodyni og smerte adfærd. Mængden af ​​LPCAT2 protein steget betydeligt i rygmarven på 8, 15 og 30 dage efter transplantation af NCTC 2472 tumorceller i mus skinneben (figur 3). Resultaterne understøtter det koncept, at PAF stigning i rygmarven af ​​tumor-bærende mus kan vedrøre smerte produktionen, og at det sted, smertelindring virkning af PAF-receptor-antagonister involverer rygmarven i FBC mus.

Ændring af spinal LPCAT2 ekspression 3, 8, 15, og 30 dage efter de niveauer af immunreaktivitet blev normaliseret til den for β-actin og repræsenteret% induktion sammenlignet med værdierne i sham-opererede (dæmpe celler implanteret) mus (gennemsnit ± SEM ., n = 5-7). * P 0,05, *** P 0,001 versus de tilsvarende værdier i skinopererede mus (uparret Students

t

-test)

Forstærkning af den analgetiske virkning ved kombination. af PAF receptorantagonister med morfin

smerte Bone kræft er en af ​​de mest alvorlige former for smerter kræft og er ofte resistente over for behandling, selv med opioidanalgetika. Kombinationer af opioider og ikke-opioide analgetika er sædvanlig praksis at opnå en bedre smertestillende virkning i klinisk praksis. Kombineret administration af morfin med TCV-309 blev undersøgt (figur 4A). Morfin 0,1 og 0,3 mg /kg injektion 1 dag efter TCV-309 3 og 10 ug /kg administration resulteret i en markant reduktion i allodyni score ved 30 min efter morfin injektion og virkningen returneret til hvert niveau af TCV-309 alene ved 3 til 4 timer efter administration. Kombinationen af ​​morfin 1 mg /kg med gabapentin 10 mg /kg i.v. havde ingen signifikant anti-allodyni virkning (figur 4B). En stor dosis af gabapentin, 30 mg /kg, var forpligtet til at producere en forbigående anti-allodyni effekt. Morfin alene havde ringe analgetisk virkning ved 0,3 til 3 mg /kg, s.c. og en lille effekt på 10 mg /kg i FBC model. En højere dosis på 30 mg /kg af morfin var mindre effektivt (figur 4C).

TCV-309, 3 og 10 ug /kg blev injiceret i.v. 10 dage efter tumorimplantation og morfin 0,1 mg /kg og 0,3 mg /kg blev injiceret s.c. 1 dag efter injektion af TCV-309 (A). Gabapentin 10 og 30 mg /kg intravenøst blev injiceret 11 dage efter tumortransplantation og morfin, 1 mg /kg blev injiceret ved 30 min efter gabapentin injektion (B). Morfin 0,3-30 mg /kg blev injiceret ved 11 dag efter tumortransplantation (C). Smerte-lignende adfærd blev evalueret ved 20 min efter morfininjektion. Forskellige doser af TCV-309 blev injiceret i.v. ved 11 dage efter tumorimplantation og morfin 0,3 mg /kg blev injiceret s.c. 1 dage efter injektionen af ​​TCV-309 (D). En dag efter injektionen af ​​TCV-309, blev forskellige doser af morfin injiceret (E). Kontrolmus fik injektioner med et køretøj: saltvand. De smerte-relaterede adfærd, der er udviklet efter tumor implantation i mus blev ikke påvirket af køretøjer behandlinger. Hver gruppe indeholdt 11 mus.

† P 0,05, * P 0,01 sammenlignet med den tilsvarende kontrol (køretøj behandlet) værdier, som bestemt ved analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer test.

§P 0,01 sammenlignet med den tilsvarende kontrol (køretøj behandles uden morfin) værdier, som bestemt ved analyse af varians efterfulgt af en uparret Students

t

-test

. dosis-respons forhold for TCV-309 og morfin i kombination er vist i figur 4D og fig 4E. Morfin 0,3 mg /kg og TCV-309 0,1-1,0 mg /kg ved hver dosis alene havde ingen anti-allodyni effekt, men i kombination, score det allodyni faldet med mere end 90%, afhængigt af dosis TCV-309 (figur 4D ). Morfin i kombination med TCV-309 10 ug /kg så lav som 0,03 mg /kg frembragte en signifikant anti-allodyni virkning og afskaffet allodyni respons ved 0,3 mg /kg (figur 4E). Otte dage efter injektion af TCV-309, WEB 2086 og BN 50739, smertelindrende effekt af disse forbindelser blev ikke signifikant (figur 5). Men den yderligere indgift af morfin 0,3 mg /kg stadig markant lindres allodyni og smerte adfærd (figur 5). Disse resultater viste, at PAF-receptor-antagonister opnår langvarig potensering af den analgetiske virkning, når morfin blev administreret.

TCV-309, WEB 2086 og BN 50739 blev administreret ved 11 dage efter tumor implantering. Morfin 0,3 mg /kg s.c. blev injiceret ved 8 dage efter injektionen af ​​PAF receptorantagonister. Allodyni (A, B), bevogtning adfærd (C) og lemmer brug abnormitet (D) blev evalueret ved 20 min efter injektion af morfin. Værdier repræsenterer middel ± SEM. n = 11 mus per gruppe. * P 0,01 sammenlignet med de tilsvarende kontrolværdier, som bestemt ved analyse af varians efterfulgt af en uparret Students

t

-test

Effekt af PAF receptor antagonister på Morfin-induceret. Forstoppelse

Forstoppelse er en af ​​de mest almindelige bivirkninger af morfin og det vises i næsten alle patienter behandlet med morfin. Hvis forhindringen virkning af morfin på intestinal aktivitet ikke forstærkes, kan denne bivirkning af morfin reduceres ved at reducere doseringen af ​​morfin uden at forstyrre den analgetiske virkning. Morfin reduceret mængden af ​​afføring fra 1 mg /kg s.c. og afskaffede det mere end 10 mg /kg. Den dosisafhængige forstoppelse virkning af morfin blev ikke påvirket af TCV-309 10 ug /kg (figur 6).

Normalt mus modtog med forskellige doser af morfin og de akkumulerede feces på gulvet over 60-309 var injiceret 1 dag før morfin administration. Data er udtrykt som middelværdien. n = 10 mus per gruppe.

Gentagen administration af TCV-309 beskyttet mod Udseende of Pain-lignende adfærd

Som anti-allodyni effekt af TCV-309 var lang varig, blev virkningen af ​​gentagen indgift undersøges. I kontrol mus, taktil allodyni optrådte på 3 dage efter tumor implantering og nåede at toppe respons på 8 dage. Bevogtning adfærd optrådte på 10 dage efter tumor implantering og øges gradvist over 30 dage, mens lemmer brug abnormitet optrådte på 8 dage og nåede et maksimum på omkring 16 dage efter implantation (figur 7A-7D). Injektion af TCV-309 ved 0,3 mg /kg, i.v. blev startet på dagen blev musene implanteret med tumoren og blev fortsat hver 4. dag i 28 dage. Smerter adfærd evalueres af allodyni score, tilbagetrækningstærskel, bevogtning adfærd og lemmer brug abnormitet ikke vises under dosering (figur 2). Således opstod behandlingen med TCV-309 før smerte beskyttet mod krise af smerte og tolerance over for TCV-309 analgesi ikke udvikle sig.

Administrationen af ​​TCV-309 0,3 mg /kg intravenøst blev startet 6 timer før tumorimplantation, gives en gang dagligt og fortsatte hver 4. dag op til 28 dage. Allodyni (A, B), bevogtning adfærd (C) og lemmer brug abnormitet (D) blev evalueret ved 3 timer og 1, 2, 3 dage efter TCV-309-injektion.