PLoS ONE: Silencing af XB130 er forbundet med Både Prognose og kemosensitivitet af Gastric Cancer

Abstrakt

XB130 er et nyligt karakteriseret adapter protein, der blev rapporteret til at fremme skjoldbruskkirtlen tumor vækst, men dens rolle i udviklingen af andre former for cancer, såsom gastrisk cancer (GC) er fortsat ukendt. Derfor undersøgte vi sammenhængen mellem XB130 ekspression og prognosen af ​​GC patienter. Emnerne var 411 patienter med GC i trin I til IV. XB130 ekspression blev undersøgt i kirurgiske eksemplarer af GC. Kaplan-Meier-analyse og Cox proportional hazards model blev anvendt til at vurdere den prognostiske betydning af XB130 for overlevelse og gentagelse. Desuden blev GC-celler stabilt transficeret med XB130 korte hårnål RNA etableret for at analysere effekten af ​​XB130 på følsomhed kemoterapi. Resultaterne viser, at både XB130 mRNA og proteinekspression kunne detekteres i normale gastriske væv. Den samlede overlevelse tid af trin IV patienter og sygdomsfri periode efter radikal resektion af GC i fase I-III patienter var signifikant kortere, når immunhistokemisk farvning for XB130 var lav, end når farvning var høj (begge

s

Accepteret: Juni 24, 2012; Udgivet: 23 august, 2012 |

Copyright: © Shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det nationale program på Key Basic Research Project (2012CB945100, at WL og YL), Team Program of Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (S2011030003134, at WL og YL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

onkogener og anti-onkogener har en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af ​​Gastric cancer (GC), og genetisk heterogenitet har vist sig at påvirke prognosen markant. Derfor jagt efter nye gener og proteiner med potentiel værdi som diagnostiske eller prognostiske værktøjer er vigtig, og målretning hidtil ukendte onkogener er en anden lovende fremgangsmåde til cancerbehandling.

XB130 er et nyligt identificeret adapter protein, der er stærkt udtrykt i den milt og skjoldbruskkirtlen hos mennesker, mens den viser svag ekspression i nyren, hjernen, lunger og bugspytkirtel [1]. XB130 er blevet påvist i follikulær og papillær skjoldbruskkirtlen carcinom, samt i humane lungecarcinom cellelinier [2]. Selvom dets ekspression blev reduceret i skjoldbruskkirtlen carcinom, blev XB130 fundet at være en tumor promotor [2]. Det er blevet rapporteret, at XB130 ikke blot har en rolle i celleproliferation, overlevelse, bevægelighed og invasion [2], [3], [4], men er også involveret i signaltransduktion [1]. XB130 reguleres af Rac og cytoskelettet [3], og det er involveret i aktiveringen af ​​c-Src [1] og phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) /Akt pathway [4], som igen regulerer cytoskelet funktion [3]. Disse signalveje har også vist sig at have en væsentlig rolle i udviklingen og progressionen af ​​GC [5], [6], [7]. Derfor kunne der være en rolle XB130 i GC også. Imidlertid har ingen forskning på dette nyligt fundet adapter protein blevet gjort inden for gastroenterologi hidtil. I denne undersøgelse, vi hypotese, at XB130 udtryk kan være forbundet med overlevelse og /eller tumor tilbagefald samt med kemosensitivitet af GC.

Resultater

XB130 udtryk i normale gastriske væv og GC

Forskellig fra tidligere rapporter, bekræftede vi, at XB130 konstitutivt udtrykkes i normale væv af human lever, tyktarm, milt og mave (figur 1a). Immunhistokemi blev udført for at vurdere XB130 ekspression i alle 411 par af paraffinindlejrede afsnit fra GC og deres tilgrænsende ikke-tumorvæv. Vi fandt, at XB130 overvejende blev udtrykt i cytoplasmaet i den normale gastriske væv, mens det var betydeligt nedreguleret i væv af GC. Vi yderligere kategoriseret GCS i XB130 positiver (high udtryk med score ≥3) og negativer (lav udtryk med score 3) ved farvning scoringer (figur 1b). Forekomsten af ​​XB130 positiver og negativer i fase I-III GC var ingen forskel, men den del af XB130 negativer var højere i trin IV og i de post-kirurgi gentagelse grupper (figur 1c). Kvantificeret mRNA niveau af XB130 blev påvist i fase IV palliativ resektion prøver og væsentligt reduceret i avanceret GC’er (figur 1d). Tilsvarende blev reduceret protein ekspression af XB130 i avanceret GC også bekræftet ved Western blot (fig 1e).

(a) XB130 genet udtrykkes i human lever, milt, colon og mave. (B) Repræsentative billeder af XB130 protein immunofarvning i GC væv og den tilstødende ikke-tumorvæv. (C) Forekomsten af ​​XB130-negative og XB130-positive GC i etaper I-III (n = 263) og trin IV (n = 148). (D) I trin I-III GC efter radikal resektion, XB130 mRNA-ekspression var signifikant lavere i tumorvæv end i tilsvarende tilstødende ikke-tumorvæv kvantificeret ved fluorescens PCR

(p

0,01, n = 9 per gruppe

)

. (E) Ekspression af XB130 protein af trin I-III GC (T) er betydeligt reduceret i forhold til, at ved normal gastrisk væv (N) på western blotting (

s Restaurant 0,01, n = 6 pr gruppe) . Prøver i (a), (d) og (e) var friske væv fra patienter med trin I-III GC der modtog radikal resektion kirurgi, mens prøver i (b) og (c) var fra patienter med trin I-IV GC som beskrevet i afsnit metoden.

lav udtryk for XB130 er korreleret med dårlig prognose

i analysen af ​​de samlede 411 tilfælde af GC på trin i-IV, kumuleret overlevelsesraten for patienter med XB130 negativ farvning var signifikant lavere end dem med positiv farvning (figur 2a). Hos patienter med stadie IV GC, som mistede operationen kur mulighed, det viste signifikant lavere overlevelsesrate i XB130 negativ gruppe (figur 2b). Median samlet overlevelse tid af patienter i fremskredent stadium var længere i XB130 positiv end i negativ gruppe (16,7 vs. 8,5 måneder, HR for negative gruppe var 1,72, p = 0,011; tabel 1). Hos de patienter på stadium I-III GC, som fik radikal resektion kirurgi, den sygdomsfri overlevelse i XB130 positiv gruppe var højere end den negative gruppe (p 0,05, figur 2c), mens den gennemsnitlige tid til gentagelse var 36 og 24 måneder i positive og negative grupper (tabel 1, HR for negative patienter var 1,2, p = 0,022). Disse resultater tyder på, at lav udtryk for XB130 er forbundet med kortere overlevelse og højere tilbagefald i GC patienter.

(a) I alle 411 patienter med GC (trin I-IV), den kumulative overlevelsesrate for XB130- negativ gruppe var signifikant lavere end den positive gruppe (

s

0,0001). (B) I 148 patienter med stadie IV GC, den XB130-negative gruppe havde en signifikant lavere kumulativ overlevelsesrate end den positive gruppe (

s

= 0,01). (C) Hos patienter med stadie I-III GC behandlet med radikal resektion, den kumulative sygdomsfri overlevelse var signifikant lavere for XB130-negative gruppe end den positive gruppe (

s

= 0,019).

prognostiske værdi af andre klinisk-patologiske parametre

indflydelse andre klinisk-patologiske parametre på samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse blev opført i tabel 1 og figur 3. Ud over XB130, resultaterne af Kaplan-Meier overlevelsesfunktionen analyse i patienter ved IV stadium grupperet efter de kendte faktorer, såsom carcinoembryonisk antigen (CEA) koncentration, differential grad, metastase, ascites og kemoterapi viste signifikant indflydelse på den kumulerede overlevelse (figur 3 a-e ). I en univariate Cox regressionsanalyse patienter modtog radikal terapi, vi bemærkede, at scenen var også en væsentlig prognostisk faktor for gentagelse (tabel 1)

Tallene er mærket som følger:. Kumulativ overlevelse af patienter med GC med ( a) Carcinoembryonalt antigen (CEA) ≤5 mg /L eller . 5 ug /l, (b) forskellige differential (DIF) grad, (c) med (M

1) eller uden (M

0 .) metastase, (d) med eller uden ascites, (e) med eller uden kemoterapi

I en multivariat analyse ved hjælp Cox model, vi bemærkede, at XB130, CEA, kemoterapi og ascites (alle p 0,01) var uafhængige faktorer til at forudsige HR for død hos patienter i stadie IV, mens XB130 (p = 0,044) og fase (p 0,000) var uafhængige faktorer til at forudsige HR for gentagelse efter radikal resektion af GC i patienter med stadie i-III (tabel 2).

Kemoterapeutica følsomhed som reaktion på XB130 tavshed

for at finde ud af det terapeutiske potentiale i at målrette XB130, vurderede vi celle levedygtighed sh-XB130 som reaktion på 5-FU, cisplatin og irinotecan. Cellen levedygtighed i SH-XB130 og vildtype grupper var både undertrykt af alle tre kemoterapeutika i en dosisafhængig måde. Henholdsvis, sammenlign med sh-XB130, vildtype kontrol viste mere følsomme over for 5-FU manifesteret ved en betydelig lavere cellelevedygtighed (figur 4a), hvorimod cisplatin (figur 4b) og irinotecan (figur 4c), blev påvist at være mere effektiv i SH- XB130 gruppen end i vildtype kontrol.

(a) Celler udsat for 5-FU viste bedre levedygtighed i sh-XB130 gruppen end i scramble (n = 3-4 ved hver koncentration i hver gruppe). (B) Cell levedygtighed i sh-XB130 gruppen drastisk reduceret ved udsættelse for cisplatin (n = 5-10 ved hver koncentration i hver gruppe). (C) Irinotecan også reduceret levedygtighed celle i sh-XB130 (n = 3-4 ved hver koncentration i hver gruppe).

*

p

0,05,

†

p

0,01,

‡

p

0,001 vs. vildtypeceller ved den tilsvarende koncentration. (D) XB130-negative patienter havde en lavere overlevelsesrate, når de behandles med 5-FU (Fu = 1).

Survival analyse GC patienter modtog 5-FU terapi

Sorteret af XB130 negativ og positiv, vi evaluerede 5-FU-terapi i stadie IV GC patienter i en retrospektiv undersøgelse. Behandlet med 5-FU, patienter med XB130 positiv farvning haft en højere overlevelsesrate end den negative gruppe (figur 4d). Tilsvarende XB130 positiver med 5-FU-terapi havde længere overlevelse tid (figur 4d). Da der var få patienter behandlet med cisplatin eller irinotecan, blev indflydelsen af ​​XB130 ekspressionsniveauet på kliniske terapeutiske virkninger ikke sammenlignet i denne undersøgelse.

Diskussion

XB130 er et nyligt klonet 130 kDa-adapter protein og er rapporteret at være hovedsageligt udtrykkes i skjoldbruskkirtlen og miltvæv valideret ved Northern blot og spiller en multifunktionel rolle i celleoverlevelse, proliferation, invasion i skjoldbruskkirtlen tumor [2], [3], [4], men dets mRNA og protein-ekspression i andre væv er ikke blevet bekræftet af real-time PCR, western blot eller immunhistokemi. I denne artikel, gav vi det første tegn på, at XB130 mRNA og protein også blev konstitutivt udtrykt i normal gastrisk væv og relativt lavere ekspression i GC celler. Disse resultater står i modsætning til tidligere rapporter, at XB130 mRNA var knap påviselige i andre væv undtagen skjoldbruskkirtlen og milten [1], [4], dels fordi de kun bruges Northern blot for bekræftelse. XB130 ekspression reduceres i skjoldbruskkirtlen tumor, men det forbliver helt uklart, om XB130 er en prognostisk biomarkør for andre maligne tumorer såsom gastrisk cancer (GC) [2]. For at bekræfte, at XB130 deltager i GC progression, havde vi analyserede overlevelse eller tilbagefald hos 411 patienter med GC og bemærkede, at XB130 lave udtryk forudsagt en lavere overlevelse og højere recidiv. Endvidere blev Chemotherapeutic følsomhed basere på XB130 udtryk beregnet for første gang, og cellulære eksperimenter og klinisk retrospektiv undersøgelse viste, at nedregulering af XB130 øger narkotika følsomhed over for cisplatin og irinotecan og nedsætter narkotika følsomhed over for 5-fluorouracil.

I betragtning af kræftfremkaldende i tidligere rapporter [2], [8], [9], XB130 bør betragtes som en anden onkogen end en tumor-undertrykkende protein, selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at teste, om det også er tilfældet i GC. Så, hvordan man kan forklare den kliniske betydning af vores kliniske observation, at XB130 nedregulering forudsiger en lav samlet overlevelse i avanceret GC og højere recidiv hos patienter behandlet med radikal resektion kirurgi? Faktisk er det kendt, at tumorigenese kan skyldes ændringer af multiple gener og proteiner, medens XB130, adapteren protein med mere end én funktionel domæne, kan påvirkes af flere opstrøms og nedstrøms faktorer. Derfor er det for tidligt at vurdere, om et gen eller et protein er onkogen eller ikke bare basere på dets ekspression i kliniske prøver, selv om sidstnævnte havde antyde nogle spor. Faktisk kan nedregulering af XB130 i GC betragtes som en kompenserende justering, fordi nogle tumorsuppressorer ville blive mobiliseret til at modstå XB130 under progression af GC. Tilsvarende blev det rapporteret, at tumor suppressor p53-ekspression var højere i dårligt differentierede GC end i veldifferentierede dem [10], mens der i tidlige gastriske cancere med lave niveauer af apoptose, forøget ekspression af Bcl-2 og p53 var mere sandsynligt at fremme metastase [11], [12].

XB130 kan være en proto-onkogen, der bevarer i normalt væv. Sådanne proto-onkogener kan bidrage til at opretholde de fysiske funktioner af cellefornyelsen og opadgående vandring i normal mave. I mellemtiden er der et andet sæt regulerer gener, der forhindrer normal celle over-spredning og metaplasi. Men når probiotika balance disequilibrated, celledeling og metastase er ude af kontrol, dermed fører til carcinogenese [13]. Denne klassiske teori om proto-onkogen kan give en acceptabel forklaring på, hvorfor normalt væv med sådanne høj XB130 udtryk stadig “sund”. Det er kendt, at mange gener og signalveje spille pro-onkogene eller anti-oncogene roller på en kontekst-afhængig måde, så det er ikke ualmindeligt, at det samme gen kan udøve anden effekt på forskellige stadier eller i forskellige vævstyper for kræft udvikling [ ,,,0],14], [15], [16]. I den foreliggende undersøgelse, selv om vi ikke ind på funktioner XB130 i normal gastrisk væv, dette emne er interessant samt og har brug for yderligere forskning.

Hvis XB130 udtryk mønster kan tjene som et surrogat markør prædiktiv af kemoterapi svar, ville det også give en forklaring på prognosen. I øjeblikket fluorpyrimidinderivater-baserede og platin sammensatte-baserede kombinationsregimer er blevet accepteret som konventionel første linje behandling for GC [17], mens irinotecan, en topoisomerase I-inhibitor, er ansat som second-line behandling [18], og cisplatin har i vidt omfang blevet anvendt til behandling af fremskreden inoperabel GC [19]. I nærværende forskning blev kemoterapeutiske-følsomhed undersøgelser basere på XB130 ekspressionsniveau udført. I GC celler, XB130 knockdown angivet bedre lydhørhed over for cisplatin og irinotecan, men med mindre følsomhed over for 5-FU. Vores kliniske data viste en kortere samlet overlevelsestid i 5-FU-behandlede patienter med lavt udtryk for XB130, hvilket tyder på, at XB130 nedregulering reducerer lydhørhed over for 5-FU, som kan være en anden forklaring på den dårlig prognose hos patienter med lav udtryk for XB130 i denne undersøgelse. Vores resultater i GC cellelinje implicerer, at i avanceret GC’er, hvoraf de fleste er fremhævede ved XB130 lav udtryk, kan drage større fordel af cisplatin og irinotecan end 5-FU. I betragtning af den heterogene genomisk baggrund, såsom de forskellige udtryk for XB130 i GC, er det muligt, at nogle bestande kan drage fordel af irinotecan og /eller cisplatin, som det foreslås i vores cellulære eksperiment, og er umagen værd for yderligere undersøgelse. Yderligere potentielle undersøgelser kan afgøre, om XB130 ekspressionsmønstre kan anvendes til at hjælpe stratificere patienter i forskellige multimodale behandlingsregimer.

Sammenfattende har vores nuværende undersøgelse forudsat første bevis på, at XB130 eksistens i gastrisk væv og GC for første gang . Vi bekræftet, at kemoterapeutiske følsomhed evaluering basere på XB130 udtryk først var rettet, hvilket indikerer, at XB130 lav udtryk patienter kan være følsomme over for cisplatin og irinotecan, men senior beviser kræver. Den kliniske prospektiv med denne undersøgelse indbefatter (1) XB130 kan fungere som GC prognostisk biomarkør for sin lave ekspression implicerer for ugunstige udfald; (2) Da XB130 lavt udtrykte GC er lydhøre over for cisplatin og irinotecan overlegen til 5-fluorouracil i vores kemoterapeutiske følsomhedsanalyse, kan vurderingen af ​​XB130 udtryk vejlede klinisk medicin i GC.

Materialer og Metoder

patienter og vævsprøver

Alle 411 patienter blev histologisk diagnosticeret på Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina) fra 2000 til 2011. Tumor fase blev defineret i henhold til 7. udgave af AJCC kræft rastende manuelle 2010. prøver til diagnostiske formål blev taget med samtykke fra hver patient. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board af Nanfang Hospital, Southern Medical University. Den gennemsnitlige opfølgningstid for alle patienter var 59,5 (95% CI: fra 55,5 til 63,5) måneder. Den kliniske karakteristika og XB130 ekspression af alle GC patienter er beskrevet i tabel 1. Patienter af I-III fase GC blev udført radikal resektion, mens patienter på stadium IV modtog palliativ operation.

Før immunhistokemi analyse paraffinindlejrede primære vævsprøver blev skåret i 4 um-tykke snit, og monteret på objektglas. Ni par af tumor og cancer-tilgrænsende normale væv fra trin IV GC patienter blev tilfældigt opsamlet til kvantitativ real-time PCR og seks par for Western blot-analyse.

Immunhistokemi

Immunhistokemisk farvning blev udført ved hjælp af Dako Envision System (Dako, Carpinteria, CA) og kanin anti-XB130 Ab (1:100; Abnove) efter producentens anbefalede protokol. For XB130 vurdering blev vævssnittet scannet helt at tildele scoringer. Den farvningsintensitet blev scoret som 0 (negativ), 1 (svag), 2 (middel) eller 3 (kraftig). Omfanget af farvning blev bedømt som 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), eller 4 (76% -100%), i henhold til de procentdele af positivt farvede områder i forhold til hele karcinom området (eller hele afsnittet for normale prøver). Summen af ​​de farvning intensitet og omfang scoringer blev brugt som den endelige farvning scores (0-7) for XB130. Med henblik på overlevelse evaluering blev tumorer med en endelig farvning score på ≥3, betragtes som positivt. XB130 immunfarvning blev evalueret uafhængigt af to personer blindede til de kliniske parametre.

Fluorescens kvantitativ PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkription af cDNA blev derefter opnået med iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ved at følge producentens instruktioner. Alle RNA-data præsenteret i forhold til husholdning gen β-actin under anvendelse af ΔΔCt metoden. Rutinemæssig PCR blev også udført for at undersøge ekspressionen XB130 i forskellige organer af humane og muse (primer sekvenser i tabel S1).

Western blotting Salg

Væv blev vasket to gange med kold phosphatpufret saltopløsning ( PBS) og lyseret med protein lysisbuffer i 30 min. Centrifugering blev udført, og protein-holdige supernatant blev tilbageholdt. De proteinlysater blev separeret electrophorectically på 10% SDS-polyacrylamidgel og overført til polyvinyliden fluorid membraner (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA). Derefter immunoblotting blev udført ved anvendelse af kanin-anti-XB130 antistof (PradoWalnut, CA, USA) og β-actin (Santa Cruz, CA). Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved den forøget kemiluminescens-metoden (Amersham) med en western blotting påvisning systemet (Kodak Digital Science, Rochester, NY, USA) og blev kvantificeret af Image software QuantityOne v4.6.2.

Cellekultur

Celler fra SGC7901 cellelinje blev dyrket i komplet medium [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone)]. Stabilt-transficerede celler blev opretholdt i medier med tilstedeværelsen af ​​puromycin (Sigma-Aldrich). Cellerne blev inkuberet ved 5% CO

2 ved 37 ° C.

Stabilt-transficerede cellelinier etablering

Tre forskellige shRNA sekvenser af XB130 blev klonet ind pSUPER-Rretro-puromycin plasmid med restriktionsenzymet Bgl II, Hind III (New England Biolabs) og T4-DNA-ligase (Takara). Både pSUPER-Rretro-puro-shXB130 og pSUPER-Rretro-puro blev bygget. pSUPER-Rretro-puromycin-shXB130 kombineret med pakning plasmidvektor eller scramble vektor som negativ kontrol blev pakket i virus ved hjælp af calciumphosphatmetoden. SGC7901 celler blev transficeret ved shRNA plasmider ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), gentaget tre gange. Celler blev dyrket som nævnt ovenfor, og enkelte kolonier blev udvalgt ved western blotting og fluorescens kvantitativ PCR og anvendt til yderligere forsøg. Tre shRNA målrettet XB130 og en scramble var designet (tabel S2). Både mRNA og protein ekspression af XB130 (primersekvens i tabel S1, ekspression resulterer i figur S1A, B) blev bekræftet ved real-time PCR og western blot. Adenovirusinfektion effektivitet var viste i fig S1c og D.

Cellelevedygtighed analyse

trypsinbehandlet og podet på plader med 96 brønde ved initial densitet på 0,2 x 10

4 /brønd blev celler dyrket og observeret ved 1, 3, 5 og 7 døgn. Cellelevedygtighed blev bestemt ved methyl thiazolyltetrazolium (MTT) assay ifølge producentens anvisninger. Absorbansen blev målt ved 570 nm, med 655 nm som referencebølgelængde. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer.

Kemoterapeutica-følsomhed vurdering GC celler

Celler af vildtype kontrol og sh-XB130 var dyrket i medium med 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin eller irinotecan ved forskellige koncentrationer. Otteogfyrre timer senere blev cellelevedygtighed vurderet.

Statistisk analyse

Resultater rapporteres som middelværdien ± SEM eller medianen. Den chi-square test for kategoriske variable og t-test for kontinuerlige variabler blev brugt. Overlevelse og gentagelse satser blev beregnet efter den Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans blev accepteret ved en

s

værdi på mindre end 0,05.

Støtte oplysninger

figur S1.

Validering af gendæmpning effekt af små hårnåle RNA’er af XB130 (sh-XB130) og den infektiøse effektivitet af adenovirus. XB130 nedreguleret celler line modeller blev bekræftet ved real-time PCR (a) og Western blot (b). Celler transficeret med scramble vektor tjente som negativ kontrol og ikke-transficeret MOCK som kontrol. Den infektiøse effektivitet af adenovirus i 293FT dyrkede celler blev bekræftet ved normale (c) og fluorescens (d) microscopies. Indsat i A er amplifikationskurven af ​​real-time PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s001

(PPT)

tabel S1. Salg Primer sekvenser for Real-time eller rutine PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s002

(DOC)

tabel S2.

XB130 Sh-RNA-sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s003

(DOC)