PLoS ONE: mekanisme af kræft Cell død som følge af Udtømning af en Essential Replication Regulator

Abstrakt

Baggrund

Udtømning af replikation faktorer forårsager ofte celledød i kræftceller. Udtømning af Cdc7, en kinase afgørende for initiering af DNA-replikation, inducerer cancer celledød uanset dens p53 status, men de præcise veje for celledød induktion er ikke blevet karakteriseret.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi har anvendt den nyligt udviklede cellecyklus indikator, Fucci, til præcist karakterisere celledød proces induceret af Cdc7 udtynding. Vi har også genereret og udnyttede lignende fluorescerende cellecyklus indikatorer hjælp fusion med andre cellecyklus lovgivere til at analysere former for celledød i levende celler i både p53-positive og -negative baggrunde. Vi viser, at distinkte celle-cyklus reaktioner induceret i p53-positive og -negative celler ved Cdc7 udtynding. p53-negative celler overvejende arrestere tidsmæssigt i G2-fase, akkumulere CyclinB1 og andre mitotiske regulatorer. Langvarig anholdelse på G2-fase og pludselige indtræden i afvigende M-fase i overværelse af akkumulerede CyclinB1 efterfølges af celledød på post-mitotisk tilstand. Ophævelse af cytoplasmatisk CyclinB1 ophobning delvist nedsætter celledød. ATR-MK2 vej er ansvarlig for binding af CyclinB1 med 14-3-3σ protein. I modsætning hertil p53-positive kræftceller ikke ophobes CyclinB1, men synes at dø hovedsagelig gennem indtræden i afvigende S-fase efter Cdc7 udtynding. Kombinationen af ​​Cdc7 hæmning med kendte anti-cancer markant stimulerer celledød virkninger i cancerceller i en genotype-afhængig måde, hvilket giver et strategisk grundlag for fremtidige kombinationsbehandlinger.

Konklusioner

Vores resultater viser, at brugen af ​​Fucci, og lignende fluorescerende cellecyklus indikatorer, tilbyder en bekvem analysesystem med til at identificere cellecyklusbegivenheder forbundet med kræft celledød. De angiver også genotype-specifik celle død tilstande fremkaldt af mangelfuld initiering af DNA-replikation i cancerceller og dens potentiale udnyttes til udvikling af effektive behandlinger mod kræft

Henvisning:. Ito S, Ishii A, Kakusho N, Taniyama C, Yamazaki S, Fukatsu R, et al. (2012) Mekanisme af Cancer Cell død som følge af Udtømning af en Essential Replication Regulator. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10,1371 /journal.pone.0036372

Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: Januar 19, 2012; Accepteret: 30 marts 2012; Udgivet: Maj 4, 2012 |

Copyright: © 2012 Ito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-Aid for videnskabelig grundforskning (a) og en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på prioriterede område “kromosom Cycle” fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (til HM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cdc7 er en konserveret serin-threonin-kinase der spiller en kritisk rolle i affyringen af ​​replikationsinitieringssteder [1] – [3]. Et centralt substrat er MCM, en komponent af prereplicative kompleks (præ-RC), og phosphorylering af MCM2, 4 og 6 underenheder af MCM kompleks ved Cdc7 udløser associering Cdc45 med pre-RC, et afgørende skridt til frembringelse af en aktiv replikationsgaffel [4] – [6]. Cdc7 danner et kompleks med Dbf4, en aktiverings-underenhed, til at generere en aktiv kinase-kompleks [2]. Hos mennesker, to aktivering underenheder, ASK og Drf1 /ASKL1, er kendt for at eksistere [2], [7] – [9].

Knockout of Cdc7 i mus forårsager tidlig embryonal letalitet. Inaktivering af Cdc7 gener i muse ES-celler er også letal [10]; celler ophører DNA-syntese, akkumulere DNA skader, og til sidst undergå celledød i en p53-afhængig måde. Knockdown eksperimenter i pattedyrceller viser, at ASK er afgørende, mens Drf1 /ASKL1 kan være undværlige for levedygtighed [9], [11]. Faktisk inaktivering af ASK gener i muse ES-celler fører også til dødelighed [12]. Disse resultater indikerer, at Cdc7-ASK er essentiel for proliferation af mammale celler. På den anden side kan Drf1 /ASKL1 spille en fremtrædende rolle som en aktivator af Cdc7 i den tidlige udvikling af padder [13], [14]. En ortolog af Drf1 /ASKL1 er ikke blevet identificeret hos mus.

På et cellulært niveau, knockdown af Cdc7 blev vist sig at forårsage celledød i kræftceller, men ikke i normale celler, hvor p53-afhængige veje anholdelse cellecyklussen formentlig i G1-fasen [15], [16]. Det blev også rapporteret, at Cdc7 knockdown induceret p38-afhængig celledød i HeLa-celler [17]. Imidlertid Cdc7 udtømning forårsager celledød også i p53-positive celler, hvilket antyder, at p53 alene kan ikke forhindre celledød induceret af Cdc7 depletering i cancerceller. På nuværende tidspunkt er de præcise mekanismer af p53-uafhængig celledød i Cdc7-depleterede cancerceller ikke kendt. I denne undersøgelse, analyserede vi effekten af ​​Cdc7 udtynding i kræftceller ved at bruge den nyligt udviklede cellecyklus indikator Fucci [18] samt lignende fluorescerende cellecyklus indikatorer. Vores resultater peger på forskellige virkninger af p53 på tilstanden af ​​celledød i Cdc7-udtømte kræftceller.

Resultater

Udtømning af Cdc7 kinase i humane cancerceller forårsager celledød

Udtømning af Cdc7 i HeLa, U2OS eller andre cancerceller med siRNA resulterede i inhibering af DNA-syntese, ophobning af kromosom skader [ved γ-H2AX foci) og eventuel tab af levedygtighed levedygtighed [15], [19], [20] . Celledød blev induceret i begge p53-positive eller p53-negative cancerceller, i overensstemmelse med tidligere rapporter [15], [19]. FACS-analyser af DNA-indholdet indikerede, at Cdc7 udtømning fører i første omgang til nedsat G1 befolkning, efterfulgt af forøgelse af sub-G1 population, der indikerer celledød (Fig. S1A og fig. S2B).

For at undersøge tilstand af celledød induceret af Cdc7 depletion anvendte vi HeLa-celler, der udtrykker indikatoren cellecyklus, Fucci (Fluorescerende ubiquitin-baserede indikator cellecyklussen; [18]), der tillader visualisering af cellecyklussen tilstand (rød for G1 og grøn for S /G2 /M). HeLa-Fucci blev transficeret med Cdc7 siRNA og cellerne blev overvåget for at bestemme cellecyklus stadium, hvor de gennemgår celledød. Celledød forekommer ved både post-mitotisk G1 og under S /G2 /M-fasen i HeLa-Fucci (fig. 1A og C, film S1 og S2). Vi har også genereret U2OS-Fucci og undersøgte celledød mode i U2OS efter Cdc7 udtynding. I U2OS, mere end 70% af cellerne døde under S /G2 /M-fase (grøn;. Figur 1B og C). I modsætning hertil Cdc7 udtømning ikke inducere celledød i NHDF (normal human dermal fibroblast) celler og førte oftest til G1 arrest som beskrevet tidligere (. Fig S1 og data ikke vist; [15]).

(A og B) HeLa (A) eller U2OS (B) celler, der udtrykker Fucci blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA, og tid bortfalder billedet blev optaget med Olympus LCV100 (film S1 og S2). Billeder taget fra tidsforløbet data på de angivne tidspunkter præsenteres. De øverste paneler (kontrol siRNA) viser celler, der undergår normal celledeling. Tal i hvert panel viser tiden (timer) efter siRNA transfektion. Lavere to paneler (a og b) viser Cdc7 siRNA behandlede celler. Nogle celler døde i rød farve (G1-fasen, a), og andre celler døde i grøn (S /G2 /M-fase, b). Længder på cellecyklus faser er angivet i panelerne (G1, pile punkterede linier; S /G2 /M, pile optrukne linier). Bar, 20 pm. (C) Døde celler i Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-Fucci (venstre, 324 celler) eller U2OS-Fucci (højre, 180 celler) blev talt fra tid bortfalder data til at bestemme fraktioner af de døde celler i rødt og grønt. Celledød forekommer ved både G1 og S /G2 /M faser i Cdc7 siRNA behandlet kræftceller. (D, E og F) HeLa-celler blev transficeret med kontrol eller Cdc7-D siRNA og blev høstet ved 48 timer (D) eller på de angivne tidspunkter (E og F). Hele celleekstrakter (D) eller CSK-opløselige ekstrakter (E) blev analyseret ved western blotting under anvendelse af antistofferne angivet. (F) Cdc2-CyclinB1 kinaseaktivitet blev målt ved anvendelse af CSK-opløselige ekstrakter. Immunopræcipitaterne (IP), som anvendes til assays og input Ekstrakterne blev analyseret ved western blotting. Omfanget af Cdc7 udtømning var ens mellem HeLa og U2OS. Cdc7 var ikke påvises ved western efter siRNA behandling i begge celler. (G) HeLa-celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA for angivne tidspunkter, opsamles, vaskes med PBS, hævede i 75 mM KCl i 20 minutter ved 37 ° C, og fikseret med iseddike /methanol (01:03) opløsning tre gange. Faste kromosomer blev droppet på et dias glas, lufttørret og farvet med 5% Giemsa løsning i 1/15 M PBS. Spread kromosomer blev observeret under All-in-One mikroskopi (Keyence). De mitotiske celler med afvigende kondenserede kromosomer blev talt, og fraktionerne præsenteres. De mellemværker viser repræsentative billeder af afvigende kondenserede kromosomer er observeret i et Cdc7 siRNA behandlet HeLa celle (til venstre) og ordentligt kondenserede kromosomer er observeret i en kontrol celle (til højre). Bar, 50 um. (H) HeLa-celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA i 48 timer, vaskes med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter farvet med Hoechst 33342. Cellerne blev undersøgt under konfokal mikroskopi LSM510 (1427 celler [Cdc7] og 1023 celler [kontrol]), og cellerne i M faser fase blev scoret. Fraktionerne af celler i hver mitotiske fase, fremgår. (I) Spread og faste kromosomer udarbejdet i U2OS som beskrevet ovenfor, blev observeret af FSX100 Olympus mikroskopi. Ingen signifikant forskel blev observeret i mitotiske celler efter Cdc7 depletion. Imidlertid er antallet af apoptotiske celler steg i Cdc7-depleterede U2OS celler. Bar, 32 um. I C, G og H, “n” repræsenterer antallet af uafhængige forsøg udført.

Cytoplasmisk ophobning af CyclinB1 protein i Cdc7-udtømte HeLa celler

FACS-analyse af Cdc7- depleteret HeLa-celler viste ikke akkumulering af G2 /M population (fig. S1A og fig. S2B). Imidlertid Western-analyser af forskellige proteiner efter Cdc7 udtømning i HeLa-celler viste, at niveauer af CyclinB1, AuroraA og PLK1 proteiner forøget (fig. 1D, E og F). Niveauerne af både Cdc25C, Cdc25CS216 (fig. 1E) og tyrosin 15 phosphorylering af Cdc2 steg også (fig. 1F), hvilket antyder, at G2 /M checkpoint kan induceres i Cdc7-depleterede HeLa-celler. Selv om niveauet af CyclinB1 protein forøges, CyclinB1-afhængige Cdc2 kinaseaktivitet var næsten den samme som for kontrollen (fig. 1F). Dette kan skyldes den association med 14-3-3-proteiner, der kan inhibere kinaseaktiviteten (se nedenfor), samt til checkpoint-inducerede inhiberende tyrosin 15 phosphorylering. På den anden side, i p53-positive U2OS, udtømning af Cdc7 forårsagede ikke CyclinB1 akkumulation, og påvirkede ikke CyclinB1-afhængig Cdc2 kinase aktivitet eller tyrosin 15 phosphorylering af Cdc2 (fig. 1 F).

farvning og observation af M fase kromosomer angivet en stigning på afvigende kondenserede kromosomer i Cdc7 siRNA-behandlede celler (fig. 1G). Ca. 50% af de mitotiske celler udviste afvigende kondenserede kromosomer i Cdc7-depleterede HeLa-celler. Også metafase at telofase cellepopulationer faldt i Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-celler (fig. 1H). Disse resultater viser, at en stor population af celler standse eller bremse på G2 efter udtømning af Cdc7 kinase i HeLa-celler med aberrerende kondenserede kromosomer, og en del af cellerne dør under G2 /M-fase, eventuelt ved metafase. Imidlertid har præcis timing af celledød under M-fasen ikke blevet bestemt. I U2OS, er der ingen signifikant forskel for M fase kromosomer mellem Cdc7-udtømte og kontrol celler. Imidlertid er antallet af apoptotiske kerner steg efter udtømning af Cdc7 i U2OS (fig. 1I). Således viser disse resultater også, at timingen af ​​celledød induceret af Cdc7 udtømning kan variere i HeLa og U2OS celler.

Vi analyserede derefter den cellulære lokalisering af CyclinB1 protein ved immunfarvning. Vi bemærkede stigningen i CyclinB1-positive celler i Cdc7 siRNA-behandlede celler, som forventet ud fra en stigning i det samlede CyclinB1 proteinniveau. Vi bemærkede også, at en væsentlig population af Cdc7-depleterede HeLa celler indeholder CyclinB1 protein i cytoplasma (Fig. 2A og B). For at bekræfte dette resultat, vi undersøgte effekten af ​​Cdc7 udtømning hjælp HeLa celler stabilt udtrykker mKO2-fusioneret CyclinB1 protein. I denne cellelinie, de røde fluorescerende signaler først dukkede op i cytoplasmaet ved ca. 10-14 timer efter celledeling. Signalerne var påviselige i ca. 5-6 timer. Eftersom synkronisering forsøg antyder, at G2 /M-faser i HeLa-celler vare omkring 3-5 timer, CyclinB1 sandsynligvis udtrykkes fra sen S-fase gennem metafase. Disse signaler translokerer i kerner og forsvinder efter metafase (fig 2C, øvre panel, film S3.), I overensstemmelse med den forventede opførsel af det endogene CyclinB1 proteinet, som vist tidligere [21] – [23]. Når celler blev behandlet med Cdc7 siRNA, populationen af ​​cellerne med stærke cytoplasmatiske røde signaler steget, og disse signaler forblev i cytoplasmaet i en længere periode (Fig. 2C, nederste panel og film S4). Den nødvendige tid til translokation af de røde signaler i kerner efter dens udseende i cytoplasmaet var et par timer i kontrolcellerne, mens det steg i Cdc7-udtømte celler (fig. 2C og D, film S3 og S4). Dette blev også observeret med forskellige Cdc7 siRNAs (fig. S2 og data ikke vist). Disse resultater er i overensstemmelse med tanken om, at CyclinB1 akkumuleres i cytoplasmaet i HeLa celler behandlet med Cdc7 siRNA. Vi genererede også HeLa celler, der udtrykker mKO2-AuroraA. Ekspression og aktivitet AuroraA, en af ​​de mitotiske kinaser, er kendt for at top ved G2 /M-fase [24]. Konsekvent, de AuroraA signaler fremkom ved G2 fase, og forsvandt i slutningen af ​​M-fasen i kontrolceller, mens varigheden af ​​AuroraA signaler blev meget længere efter Cdc7 depletion (Fig. S3, film S5 og S6). Denne virkning blev igen observeret for andet Cdc7 siRNAs (fig. S3C og data ikke vist). Disse resultater indikerer, at Cdc7 udtømning forårsager G2 cellecyklus forsinkelse i HeLa-celler samtidig med øget CyclinB1 og AuroraA proteinniveauer.

(A) HeLa-celler blev dyrket på dækglas, transficeret med kontrol eller Cdc7-D siRNA for 48 timer, fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med anti-CyclinB1 antistof efterfulgt af FITC-konjugeret anti-muse IgG og Hoechst33342. Venstre, Cdc7 siRNA; højre, kontrol siRNA. Green, CyclinB1; blå, DNA. Billeder blev taget af FSX100 Olympus mikroskopi. Bar, 16 um. (B) Mere end 3.000 celler blev undersøgt og celler med nukleare CyclinB1 signaler blev scoret og fraktionerne præsenteres. “N” repræsenterer antallet af uafhængige forsøg udført. (C) HeLa-celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 blev behandlet med Cdc7-D siRNA eller kontrol siRNA. Time lapse billeder blev registreret af Olympus LCV100 (film S3 og S4). Billeder taget fra tidsforløbet data på de angivne tidspunkter præsenteres. Upper, kontrol siRNA; lavere, Cdc7 siRNA. Røde signaler viser mKO2-CyclinB1. De kontrol siRNA-behandlede celler angiver dem, der gennemgår periodisk cytoplasmatisk udseende, kernetransplantation, og nedbrydning (øverste panel), mens Cdc7 siRNA-behandlede celler viser vedvarende stærke cytoplamic signaler for en lang periode (nederste panel). Tal i hvert panel viser tiden (timer) efter siRNA behandling. Bar: 20 pm. (D) Den tid (timer) mellem den første forekomst af cytosolisk mKO2-CyclinB1 signal og dets translokation ind i kernen blev målt i tid lapse billeder af kontrol eller Cdc7-D siRNA behandlede HeLa celler. P-værdien af ​​de to-tailed uparret t-test blev beregnet ved Prism software.

Mange Cdc7-udtømte celler med høj cytoplasmatisk CyclinB1 brat ind mitose efter langvarig G2 anholdelse, og meget ofte gennemgår tilsyneladende celledød i de følgende timer. Dette svarer til det mitotiske katastrofe tidligere [25] rapporterede, men cellerne forhindres i at gå frem i M-fasen ved inhibering af nuklear translokation af CyclinB1, ikke på tidspunktet for spindel checkpoint, som tidligere rapporteret i et andet system [26]. Faktisk havde ophævelse af spindlen checkpoint ved siRNA målrettet mod MAD2 ikke påvirke CyclinB1 fastholdelse i cytoplasma, der forekommer som respons på Cdc7 udtømning i HeLa-celler (data ikke vist).

14-3-3σ sekvestrerer CyclinB1 i cytoplasmaet efter Cdc7 udtømning

det næste spørgsmål er, hvordan CyclinB1 akkumuleres i cytoplasmaet. 14-3-3σ er bevaret, velkarakteriserede faktorer, der er kendt for at binde til forskellige cellecyklus regulatorer og fastholde dem i cytoplasma i nogle tilfælde [25]. Hver af de syv 14-3-3 isoformer blev udtrykt, og dets interaktion med Cdc2-CyclinB1 blev undersøgt. 14-3-3σ var blandt de stærkeste bindere (data ikke vist). Vi undersøgte, om den akkumulerede CyclinB1 er bundet til 14-3-3σ i Cdc7-udtømte HeLa-celler og fandt, at CyclinB1-bundet 14-3-3σ steget betydeligt i Cdc7-udtømte celler (fig. 3A, bane 2). Også, immunopræcipitation af forbigående udtrykt 14-3-3σ efter Cdc7 udtømning viste, at CyclinB1 og Cdc2 er forbundet med 14-3-3σ (fig. 3B). Vi undlod imidlertid at detektere sammenslutning af 14-3-3σ og Cdc25C, som tidligere beskrevet [25], [27]. Disse resultater antyder, 14-3-3σ sekvestrerer den Cdc2-CyclinB1 kompleks i cytoplasmaet efter Cdc7 udtømning i HeLa-celler.

(A) HeLa-celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA i 24 timer. Ekstrakter blev fremstillet, og de immunpræcipitater med anti- CyclinB1 antistof (bane 1 og 2) og input-ekstrakter (bane 3 og 4 20% af ekstrakten anvendes til immunopræcipitation) blev analyseret ved western blotting. (B) HeLa-celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA, efterfulgt af transfektion af et flag-tagged 14-3-3σ-udtrykkende plasmid. Ekstrakter blev fremstillet ved 48 timer efter siRNA transfektion og immunopræcipitaterne med anti-Flag-antistof (bane 1 og 2) eller normal (kontrol) IgG (bane 3 og 4) og input ekstrakter (bane 5 og 6; 17% af ekstrakten anvendte for immunofældning) blev analyseret ved western blotting. Bindingen af ​​Cdc2 /CyclinB1 med 14-3-3σ stigninger efter Cdc7 siRNA behandling, hvilket antyder, at 14-3-3σ bevarer CyclinB1 i cytoplasmaet efter Cdc7 udtømning i HeLa-celler. (C og D) HeLa-celler blev behandlet med Cdc7-D siRNA, 14-3-3σ og Cdc7-D siRNAs, 14-3-3σ siRNA og styre siRNA i 48 timer. (C) Western blot-analyse af hele celleekstrakter. (D) DNA-indholdet af cellerne i C blev analyseret ved FACS (10.000 celler for hver) og den del af cellerne i hver celle cyklus trin præsenteres. (E) HeLa-celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 blev behandlet med Cdc7-D og /eller 14-3-3σ siRNA som angivet. Tiden (t) mellem den første forekomst af cytosoliske mKO2-CyclinB1 signaler og dets translokation ind i kernen blev målt ved hjælp af tid bortfalder billeder, som startede på 24 timer efter siRNA transfektion. P-værdien af ​​den tosidede uparret t-test blev beregnet ved Prism software. Co-udtynding af 14-3-3σ ført til et fald i det samlede CyclinB1 protein niveau (C), reduceret celledød (D), og reduceret varigheden af ​​dens cytoplasmatisk tilbageholdelse (E).

reduktion af cytoplasmatisk akkumulering af CyclinB1 delvist reducerer celledød

Eftersom celler akkumulerer CyclinB1 i cytoplasmaet er tilbøjelige til celledød, undersøgte vi, om reduktion af cytoplasmatisk CyclinB1 antagoniserer celledød virkning Cdc7 udtynding. Co-udtømning af både Cdc7 og 14-3-3σ i HeLa-celler reducerede CyclinB1, AuroraA, PLK1 og Cdc25C protein niveauer (fig. 3C). Den nødvendige tid til nuklear translokation af CyclinB1 afkortet og sub-G1 cellepopulation faldt (fig. 3D og E). Disse resultater antydede, at fraværet af 14-3-3σ letter G2-M overgang og progression i den næste celle cyklus fase, delvist redde celler fra celledød.

Vi udtrykte næste mKO2-NLS-CyclinB1, som konstitutivt lokaliseret i kernerne i HeLa-celler ved sen S gennem metafase. I disse celler den nødvendige tid til overgangen fra sen S til G2 /M blev afkortet sammenlignet med mKO2-CyclinB1 udtrykkende celler og celledød blev delvist omgået ved 48 timer efter Cdc7 depletion (Fig. 4A og B). Dette er i overensstemmelse med en tidligere rapport, at ektopisk ekspression af NLS-CyclinB1 i HeLa-celler reducerede G2-forsinkelse forekommer som reaktion på X-ray bestråling [28]. Celler, der udtrykker mKO2-NLS-CyclinB1 stadig undergik apoptose på senere tidspunkter efter Cdc7 udtynding. Dette kan forventes, eftersom ekspression af nuklear CyclinB1 vides at inducere apoptose i cancerceller [29]. Co-udtømning af CyclinB1 reduceret G2-forlængelse og delvis reddet celledød induceret af Cdc7 depletion (Fig. 4C, D). Disse resultater understøtter den opfattelse, at cytoplasmatisk akkumulering af CyclinB1 og dens pludselige translokation i kerner i det mindste delvist ansvarlig for den observerede celledød i HeLa-celler induceret af Cdc7 depletion og at celledød kan i det mindste delvist forhindret ved at lette mitose.

(A) HeLa celler, der udtrykker mKO2-NLS-CyclinB1 (venstre) eller mKO2-CyclinB1 (til højre) blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA og blev overvåget af Olympus LCV100. Døde celler blev talt i den tid lapse billeder på de angivne tidspunkter. Celledød blev undertrykt i mKO2-NLS-CyclinB1 udtrykker HeLa celler op til 72 timer (hvor halvdelen af ​​de Cdc7-forarmet HeLa-celler er normalt døde). mKO2-NLS-CyclinB1 plasmid blev konstrueret ved insertion af NLS-sekvensen (PPKKKRKVEDP) fra SV40 stort T-antigen i mKO2-CyclinB1 plasmidet mellem mKO2 og CyclinB1. Omkring 200 eller 60 celler, der udtrykker mKO2-NLS-CyclinB1 eller mKO2-CyclinB1 henholdsvis blev talt. “N” repræsenterer antallet af uafhængige forsøg udført. (B) HeLa celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 (WT) eller mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA og varigheden af ​​CyclinB1 udtryk før overgangen til M fase blev målt i tid bortfalder billeder. Upon Cdc7 udtømning, havde NLS-celler ikke akkumulerer den mærkede CyclinB1 i cytoplasmaet, og fortsatte gennem cellecyklussen mere eller mindre normalt. (C) HeLa-celler blev behandlet med angivne siRNA’er i 48 timer. DNA indhold blev analyseret ved FACS (10.000 celler for hver) og fraktionerne af sub-G1 population blev beregnet og præsenteret. Co-udtømning af CyclinB1 reducerede celledød induceret af Cdc7-D siRNA i HeLa-celler. (D) HeLa-celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 (WT) blev behandlet med Cdc7-D eller Cdc7-D + CyclinB1 siRNA og tiden (timer) mellem den første forekomst af cytosolisk mKO2-CyclinB1 signal og dets translokation ind i kernen blev målt i tidsforløbet billeder af hver cellepopulation. Nedregulering af CyclinB1 udtryk forkortet G2 anholdelse induceret af Cdc7 udtynding. I (B) og (D) blev de P-værdierne fra de to-halet uparret t-test beregnet af Prism software.

G2 forlængelse skyldes udtømning af Cdc7 i p53-negative celler gennem MK2 aktivering

det er tidligere blevet rapporteret, at p38-MK2-vejen aktiveres i HeLa-celler ved udtømning af Cdc7 [17]. Derfor har vi undersøgt, om denne vej er involveret i cytoplasmatisk ophobning af CyclinB1 i Cdc7-udtømte HeLa-celler. Først, vi bekræftet, at MK2 er hyperphosphoryleret ved Cdc7 depletion i HeLa-celler, men ikke i U2OS eller NHDF-celler (fig. 5A). Denne aktivering af MK2 i Cdc7-depleterede HeLa-celler kunne skyldes direkte aktivering af MK2 af Cdc7-induceret replikation stress. Alternativt kan forøgelse af G2-fase celler af Cdc7 depletion bidrage til aktivering af MK2, eftersom MK2 er kendt for at være mere aktiv i G2 og M-faser. Co-udtømning af Cdc7 og MK2 reducerede cyclin B1 og AuroraA protein niveauer og Cdc25C Ser216 fosforylering, tyder på, at mitose er delvist restaureret (fig. 5B). Det reducerede også bindingen af ​​14-3-3σ og CyclinB1 /Cdc2 (fig. 5C). Men samtidig udtømning af Cdc7 og MK2 ikke forhindre HeLa celledød, formentlig fordi MK2 udtømning alene inducerede signifikant celledød (data ikke vist).

(A) HeLa (bane 1, 2, 7 og 8 ), blev U2OS (bane 3 og 4) og NHDF (bane 5 og 6) celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7 siRNA og hele celleekstrakter kørt på en phosgel og analyseret ved western blotting. Bane 7 og 8, uddrag af Cdc7 siRNA-behandlede HeLa-celler ikke-behandlede (-) eller behandlet med λ-phosphatase (+). Pilespidser angiver den phosphorylerede MK2 band. (B) HeLa-celler blev behandlet med kontrol siRNA (bane 1 og 5), Cdc7 siRNA (bane 2 og 6), Cdc7 og MK2 siRNA’er (bane 3 og 7) og MK2 siRNA (bane 4 og 8) i 48 timer, og CSK-opløselige (bane 1-4; Sup) og -insoluble (bane 5-8; PPT) proteiner blev analyseret ved western blotting. Tubulin og LaminB vises som lastning kontrol. (C) Glutathion Sepharose 4B kugler, der bærer GST-14-3-3σ protein blev inkuberet i 1 time ved 4 ° C med CSK-opløselige ekstrakter af HeLa-celler behandlet med siRNA, som vist. Bundne proteiner blev undersøgt ved Western blotting. “Input” repræsenterer kun ekstrakterne uden tilsat GST-14-3-3σ protein. Cdc7 og MK2 co-depletion reducerede bindingen mellem 14-3-3σ og Cdc2 /CyclinB1. (D) HeLa-celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 blev behandlet med angivne siRNA’er. Tiden (t) mellem den første forekomst af cytosolisk mKO2-CyclinB1 signal og dets translokation ind i kernen blev målt i tid bortfalder billeder. Co-udtømning af MK2, p38 (opstrømskinase af MK2) eller ATR reduceret cytoplasmatisk tilbageholdelse af CyclinB1 (G2 forlængelse) blev observeret i Cdc7-depleterede HeLa-celler. P-værdierne fra de to-halet uparret t-test blev beregnet ved Prism software. Cdc7-D siRNA blev anvendt i alle eksperimenterne.

Den nødvendige tid til nuklear translokation efter samtidig udtømning af Cdc7 og MK2 blev afkortet tæt på kontrolniveauet. Endvidere blev G2 forlængelse observeret efter Cdc7 udtømning også annulleret ved co-udtømning af ATR eller p38 med Cdc7 (fig. 5D). Disse resultater viser, at denne G2 checkpoint afhænger ATR-regulerede MK2 aktivering.

Cytoplasmisk ophobning af CyclinB1 ikke forekommer i p53-positive U2OS eller HCT116 efter Cdc7 udtømning

Selvom Cdc7 udtynding i U2OS celler (human osteosarcom), inducerede kraftig celledød, niveauerne af de mitotiske kinaser ikke steg (fig. 1). Vi etablerede derfor U2OS stabilt udtrykker mKO2-CyclinB1, og undersøgte effekten af ​​Cdc7 siRNA på CyclinB1 dynamik. I denne cellelinie, vi ikke observere nogen ophobning af CyclinB1 i cytoplasmaet efter Cdc7 udtynding. Den nødvendige tid til nuklear translokation i Cdc7-depleterede U2OS celler var svarende til den i kontrolceller (fig. 6A). Blev det dog længere, når p53 blev co-depleteret (fig. 6A). Den CyclinB1 protein niveau lidt steg efter co-udtømning af Cdc7 og p53 i U2OS (fig. 6B). Vi undersøgte dernæst en coloncancer cellelinie HCT116. I p53-positive HCT116 cancerceller, niveauerne af mitotiske proteiner såsom CyclinB1 og PLK1 faldt efter Cdc7 depletering formodentlig på grund af G1 arrest (fig. 7A). Samtidigt blev Cdc2 /CyclinB1 aktivitet også reduceret i Cdc7-udtømte p53-positiv HCT116 celler (Fig. 7B). Den nødvendige tid til nuklear translokation i Cdc7-depleterede p53-positive HCT116 celler var svarende til den i kontrolceller (fig. 7C, venstre panel). I modsætning hertil Cdc2 /CyclinB1 aktivitet i p53-negative HCT116 efter Cdc7 depletering var næsten den samme som for kontrollen (fig. 7B). Som det ses i HeLa-celler, den nødvendige tid til nuklear translokation i Cdc7-depleterede p53-negative HCT116-celler var længere end for kontrollen (fig. 7C, højre panel). Denne G2 forlængelse blev annulleret af co-udtømning af Cdc7 og MK2 i p53-negative HCT116 celler (Fig. 7C, højre panel). Disse resultater indikerer, at G2 fase forlængelse efter Cdc7 udtømning afhænger fravær af p53-protein [15], [30] – [32]

(A) U2OS celler, der udtrykker mKO2-CycinB1 blev behandlet med siRNAs og tid. lapse billeder blev registreret af LCV100. Tiden (t) mellem den første forekomst af cytosolisk mKO2-CyclinB1 signal og dets translokation ind i kernen blev målt i tid lapse billeder af hver celle population. I Cdc7-udtømte U2OS, går CyclinB1 ikke ophobes i cytoplasmaet. Imidlertid co-nedbrydning af Cdc7 og p53 forårsaget CyclinB1 akkumulering i cytoplasmaet i en længere periode. P-værdierne fra de to-halet uparret t-test blev beregnet ved Prism software. (B) Western-analyse af hele celleekstrakter af U2OS celler behandlet med angivne siRNA’er i 48 timer. En phosgel blev anvendt til påvisning af MK2. Andre proteiner blev påvist på en gradientgel 4-12%.

(A) p53-positive eller ekskluderet HCT116-celler blev behandlet med kontrol eller Cdc7-D siRNA i 48 timer, og hele celleekstrakter blev analyseret ved western blotting. (B) CSK-opløselige ekstrakter blev fremstillet ud fra de samme celler som i (A) og immunpræcipitation blev udført med anti-CylinB1 antistof. Cdc2-CyclinB1 kinaseaktivitet blev målt med histon H1 som et substrat (øvre panel), som beskrevet i “Materialer og metoder”. Grafen nedenfor viser kvantificering af niveauet af phosphorylering. Lower panel, western blotting analyser af CyclinB1 proteiner i immunopræcipitater der anvendes til kinaseassays. (C) p53-positive (venstre) eller -negative (til højre) HCT116 celler, der udtrykker mKO2-CyclinB1 blev behandlet med angivne siRNA og tid bortfalder billederne blev optaget. Tiden (t) mellem den første forekomst af cytosolisk mKO2-CyclinB1 signal og dets translokation ind i kernen blev målt i tid bortfalder billeder. P-værdierne fra de to-halet uparret t-test blev beregnet ved Prism software.

For nylig blev det rapporteret, at FoxO3 transkriptionsfaktoren er involveret i G1 arrest, forårsaget af udtømning af Cdc7 i normale celler [16]. FoxM1, andet Fox familiemedlem, er kendt for at regulere ekspressionen af ​​mitotiske regulatorer såsom Plk, CyclinB1 og CyclinA efter DNA-skader [33] – [36]. Ekspression af FoxM1 reguleres negativt af p53 [37], [38]. I HeLa, vi viser, at mRNA niveauerne af FoxM1 steg efter Cdc7 udtømning (Fig. 8A), der kan også være delvis ansvarlig for en stigning på FoxM1 protein niveauer under samme betingelse. Disse resultater tyder på, at disse Fox familie transkriptionsfaktorer kan være involveret i cellecyklus arrest og induktion af celledød ved Cdc7 udtynding i p53-negative celler. Dobbelt knockdown af Cdc7 og FoxM1 i HeLa-celler dramatisk reduceret CyclinB1 mRNA niveau i forhold til Cdc7 udtømning alene. Den CyclinB1 proteinniveauet også reduceret ved samtidig nedbrydning af Cdc7 og FoxM1, men ikke til omfanget af mRNA-niveauet (fig. 8B).