PLoS ONE: Analyse af Normal-Tumor Tissue Interaktion i Tumorer: Forudsigelse af prostatakræft Funktioner fra Molekylær Profil af Tilstødende Normal Cells

Abstrakt

Statistisk modellering, i kombination med genom-dækkende udtryk profilanalyser, har påvist, at den molekylære tilstand af tumoren er tilstrækkelig til at aflede patologisk tilstand. Disse undersøgelser har været meget vigtigt i diagnostik og har bidraget til at forbedre vores forståelse af tumor biologi. Dog kan deres betydning i dybdegående forståelse af kræft patofysiologi begrænses, da de ikke udtrykkeligt tager hensyn til grundlæggende rolle af vævet mikromiljø i at anvende tumor fysiologi. På grund af vigtigheden af ​​normale celler i udformningen vævet mikromiljø vi formulere den hypotese, at molekylære bestanddele af profilen af ​​normale epitelceller hosliggende tumoren er prædiktive for tumor fysiologi. Vi rettet denne hypotese ved at udvikle statistiske modeller, der linker genekspressionsprofiler repræsenterer molekylære tilstand af tilstødende normale epitelceller til tumor funktioner i prostatacancer. Desuden viste, netværksanalyse at predictive gener er knyttet til aktiviteten af ​​vigtige udskilles faktorer, som har potentiale til at påvirke tumor biologi, såsom IL1, IGF1, PDGF BB, AGT, og TGFp

Henvisning:. Trevino V, Tadesse MG, Vannucci M, al-Shahrour F, Antczak P, Durant S, et al. (2011) Analyse af Normal-Tumor Tissue Interaktion i Tumorer: Forudsigelse af prostatakræft Funktioner fra Molekylær Profil af tilstødende normale celler. PLoS ONE 6 (3): e16492. doi: 10,1371 /journal.pone.0016492

Redaktør: Diego Di Bernardo, Fondazione Telethon, Italien

Modtaget: 4. august, 2010; Accepteret: 3 januar 2011; Udgivet: 30 marts 2011

Copyright: © 2011 Trevino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Victor Trevino var en modtager af en Darwin Trust Fellowship og CONACYT. Dette arbejde er delvist finansieret af tilskud fra CRUK (C8504 /A9488), spanske ministerium for videnskab og innovation (BIO2008-04212), GVA-FEDER (PROMETEO /2010/001). Forfatterne takker også støtte fra Statens Institut for Bioinformatik (www.inab.org) og RTICC (tilskud RD06 /0020/1019) begge initiativer Instituto de Salud Carlos III (MICINN). Marina Vannucci er delvist støttet af NIH-NHGRI R01-HG003319. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

anvendelsen af ​​funktionelle genomics teknologier, især genekspression profilering, har givet det videnskabelige samfund med værktøjer til at karakterisere den molekylære tilstand af celler og væv på et genom niveau. Disse teknologier kombineret med evnen til at dissekere bestemte celletyper fra et komplekst væv har skabt en hidtil uset mulighed for at karakterisere den molekylære identitet af specifikke celletyper i forbindelse med en kompleks væv [1]. Efter denne fremgangsmåde, har genekspressionsprofilering blevet anvendt til at generere den transkriptionelle profil af tumorceller, der er prædiktive for både tumor funktioner og klinisk resultat i en række forskellige humane cancere [2]. Mange undersøgelser genom-dækkende imidlertid analyseres ofte ikke tager udtrykkeligt hensyn til, at komponenter af den ekstracellulære matrix (ECM) (matrixproteiner, opløselig vokse faktorer og chemokiner) secerneres af normale celler, der støder op til tumorstedet, stærkt påvirke biologi af tumoren. For nylig er stromaceller opstået som primære kandidater til at spille en rolle i normal-tumorcelle interaktion [3]. Disse celler udskiller de fleste af de involveret i ECM opdeling enzymer, for eksempel de producerer vækstfaktorer, der har en rolle i regulering af tumorcelleproliferation, apoptose, og migration. De udskiller også pro-inflammatoriske cytokiner, der er involveret i kemotiltrækning og aktivering af specifikke leukocytter og dermed spiller en rolle, når inflammatoriske responser [4]. Vækstfaktorer og cytokiner er også involveret i den neoplastiske transformation af celler, angiogenese, tumor klonal ekspansion og vækst, passage gennem ECM, intravasation i blod eller lymfekar og den ikke-tilfældige homing af tumormetastase til specifikke steder. Mange af disse faktorer er også secerneres af normale epitelceller, immunceller og endotelceller i nærheden af ​​tumormassen. Det har også vist sig, at stroma kan have indflydelse på responset på antitumorterapi. Faktisk er tilstedeværelsen af ​​CD11b + leukocytter bibringer resistens over for anti-angiogenese terapi [5].

Desuden forbehandling af stroma med anti-angiogenese molekyler før tumorimplantation i musetumormodeller kan paradoksalt nok øger tumorudvikling [6], [7]. Dette illustrerer, at kvaliteten af ​​tumor stroma væsentligt kan påvirke tumor udvikling.

Betydningen af ​​mikro-miljø til at bestemme debut og progression af kræft opstår spørgsmålet, om det kan være muligt at forudsige patofysiologi og det kliniske udfald af tumoren fra specifikke komponenter af molekylære tilstand af normale celler. Hvis det er muligt, vil vi forvente disse molekylære signaturer til at repræsentere vigtige elementer i celle-celle krydstale involveret i at specificere udviklingen af ​​kræft.

Vi behandlet dette spørgsmål ved at udvikle statistiske modeller baseret på et genom bred profilering af normal væv tilstødende tumor og identificere aspekter, der er prædiktive for kræft funktioner.

Vi har analyseret to forskellige prostatakræft microarray datasæt tilgængelige i det offentlige rum [8], [9]. Vi viser, at den molekylære tilstand af celler tilstødende til tumoren i begge datasæt er prædiktiv for klinisk relevante cancer funktioner. Disse veje er informative molekylære signaturer og repræsentere veje er involveret i produktion og respons på udskilles faktorer.

Disse resultater understøtter den potentielle relevans af normale væv biopsier i diagnose og prognose for prostatakræft. Denne fremgangsmåde giver også en generelt anvendelig analyse strategi for at identificere de vigtigste veje er involveret i celle til celle kommunikation.

Resultater

Statistisk modellering skaber en sammenhæng mellem den molekylære tilstand af normale celler og tumor histo-patologiske funktioner

det oprindelige mål med vores analyse var at teste, om den molekylære profil normale celler er prædiktiv for kræft funktioner. Vi overvejede oprindeligt to vigtige aspekter af prostata tumor fysiologi: graden af ​​organisering af tumorceller defineret af en histo-patologisk pointsystem kaldet Gleason score, og evnen af ​​tumorceller at trænge ind i orgel kapsel sammenfattet af en binær histo-patologiske score kaldet kapsulær penetration. Niveauet af differentiering af tumorceller måler tendensen hos celler til at aggregere i glandulære strukturer, der minder om organiseringen af ​​det normale væv. Gleason score kan anvendes til at definere to hovedklasser. Den første er præget af lav kvalitet tumorer, der viser en meget organiseret struktur (korrespondent til en score under eller lig med 6), mens en anden klasse er kendetegnet ved høj kvalitet tumorer celler, der er spredt i matricen og ikke udviser en tendens til dannelse glandulær strukturer (korrespondent til en score over eller lig med 7). Derimod kapsulær penetration beskrive, i hvilket omfang cellerne er unddraget den kapsel, der omgiver prostata.

Vores analyse formål at forbinde den molekylære profil af normale celler til differentiering niveau (lav versus høj differentiering) og kapsulær penetration (positiv versus negativ). Dette blev opnået ved at udvikle statistiske modeller, der var baseret på den molekylære profil af normale celler og intelligent af prøven klasser, specielt Gleason score og kapsulær penetration.

Til dette formål, vi anvendt to forskellige multivariat modellering tilgange ( GA-MLHD og BVS metoder) til to uafhængige datasæt udviklet af Singh et al. [9] og Lapointe et al. [8]. De to statistiske modellering tilgange er designet til at søge efter flere gen-markører, der maksimerer sondringen mellem prøven klasser. Ved hjælp af disse metoder, har vi udviklet repræsentative modeller, der var prædiktive for tumor funktioner ved hjælp af genekspressionsprofilen af ​​normale celler. Klassifikation nøjagtighed og størrelsen af ​​disse modeller var sammenlignelige med dem, der er udviklet ved hjælp af den molekylære tilstand af tumorceller (tabel 1). Repræsentative modeller udviklet med BvS og GA-MLHD metoder repræsenterer optimale forudsigende delmængder, der er baseret på en meget lignende antal gener og har en høj grad af overlapning på genniveau, tyder på, at vores resultater er uafhængige af den anvendte metode (figur 1 og figur S1, S2 og S3). I overensstemmelse med den relativt lille grad af overlapning mellem de microarray platforme ( = 8%, se Data Processing afsnit i tekst S1 for detaljer), de repræsentative modeller udviklet af de to uafhængige datasæt har ingen gener til fælles

.

figuren viser varmen kortene repræsenterer udtrykket profil af gener udvalgt af GA og BVS modeller i både Lapointe og Singh datasæt fra de normale væv data. Hver kvadrant i figuren repræsenterer en kombination af en modellering tilgang og en specifik datasæt. Gener stede i GA-MLHD og BVS for samme datasæt er fremhævet med rødt. Nøjagtigheden er rapporteret under hver Heatmap. GeneBank tiltrædelse nummer og gen symbol er vist i venstre side af Heatmap. Lysere grønne eller røde farver i heatmaps repræsenterer lavere eller højere relativ udtryk hhv. t-test p-værdi er vist for sammenligning med forskellen udtryk kriterier, der almindeligvis anvendes i univariate variable tilgange valg.

Yderligere analyse af det relative bidrag af de enkelte gener til prøven adskillelse var udført under anvendelse af en principal komponent analyse (figur 2). Denne fremgangsmåde har afsløret, at gener involveret i celle kommunikationsveje er prædiktive for kapsulær penetration. I genet, som er valgt af GA i det normale væv datasæt, en kombination af højere ekspression af genet

PRELP

og en nedre ekspression af generne

UBE4A

,

ZNF146

i de normale celler var prædiktiv for tumor kapsulær penetration. I genet sæt udviklet ved anvendelse af BVS proceduren på det normale væv datasæt, en høj ekspression af

PPP2R4

,

PRELP

,

CALLA

,

ISG20L2

var prædiktive for tumor kapsulær penetration. Modellerne er udviklet fra Lapointe datasættet viste, at lavere udtryk for

OAT

og højere udtryk for

PCGF5

MitCN

i GA model og lavere udtryk for

IGF1

PRAC

og højere udtryk for

PCGF5

og

CPSF7

er prædiktive for kapselskrumpning penetration.

figuren viser resultatet af en PCA repræsenterer prøve separation på basis af ekspression i normalt væv af gener udvalgt af modelberegning. Hver kvadrant i figuren repræsenterer en kombination af en modellering tilgang og en specifik datasæt. Hver kvadrant indeholder en 2D plot repræsenterer adskillelsen af ​​kapsulære penetration negative (sort nære cirkler) og positive (rød nære cirkler) prøver (plots B, D, F og H) og et søjlediagram (plots A, C, E og G) repræsenterer PC loadings (x-akse) for hvert gen komponent (y-akse). Bemærk, at pc-belastninger udgør bidraget fra hver gen til klassen separation. Stiplede linjer afgrænses gener med større bidrag, diskuteres i manuskriptet. Gener stede i GA-MLHD og BVS for samme datasæt er fremhævet med rødt.

Forbindelsen mellem normal og tumor vist i denne analyse er også understøttet af en univariat analyse, som vi har udført ved hjælp af en bred spektrum af tilgængelige metoder (Figur S4).

Specificitet af gen-signaturer prædiktive af kræft histo-patologiske træk

Tilstødende normale og tumorvæv er morfologisk forskellig. Men de viser en grad af molekylært lighed, som er delvist en konsekvens af at dele den samme mikro-miljø [10]. Vi spekulerede derfor, om de prædiktive modeller vi har udviklet fra normale epitelceller repræsenterer en molekylær signatur, der er specifik for normalt væv eller om ekspressionen af ​​de prædiktive gener i tumorceller kan også være prædiktiv for tumor funktioner. For at imødegå denne hypotese, tog vi gener udvalgt af vores modellering strategier udviklet fra de normale væv datasæt og testet, om deres udtryk i tumor spørgsmålet var prædiktiv for kræft funktioner.

Vi udfordrede også forudsigelse nøjagtighed modeller udviklet fra tumoren data ved at udføre den tilsvarende sammenligning i den normale datasæt. I begge tilfælde forudsigelsen nøjagtigheden af ​​modellerne er tæt på 50% (hvilket svarer til den forventede nøjagtighed et tilfældigt gæt) (figur 3). Denne analyse viser derfor, at de molekylære signaturer, vi har identificeret, er specifikke for vævene (normal eller tumor) de er blevet udvalgt til at repræsentere.

Den intelligente nøjagtighed af modellerne udviklet ved hjælp af normale væv (panel A, fyldte cirkler ) er sammenlignelig med de modeller, der er udviklet ved hjælp af tumorvæv (panel B, fyldt diamanter). Når modellerne udviklet ved hjælp af normale væv er uddannet og testet ved hjælp af data fra tumorvæv, er forudsigelsen magt faldt betydeligt (tomme cirkler). Ligeledes tumormodeller trænet og testet med data fra normalt væv er også ikke-prædiktive (tomme diamanter).

Funktionelle netværk knyttet til prædiktive underskrifter svarende til normale epitelceller udtryk profiler omfatter vigtige cytokin og vækstfaktor signaler

for at lette den biologiske fortolkning af de gener, der er repræsenteret i vores statistiske modeller brugte vi IPA analysesoftware til at udføre en dybtgående analyse på netværket niveau. For at sikre vores analyse omfattede hele spektret af mulige løsninger, vi bruges som input til IPA-softwaren på listen over gener er repræsenteret i samlingen af ​​prognosemodeller identificeret fra det normale væv ved GA procedure. Disse dækker et bredere spektrum af løsningen plads i forhold til de repræsentative modeller, der er beskrevet ovenfor (figur 1 og 2) og udgør 239 og 259 gener for Singh og Lapointe datasæt hhv. I denne analyse fokuserede vi på Kapsulær penetration på grund af sin kliniske og prognostisk relevans. blev udført Netværket analyse uafhængigt i de to datasæt og de mest betydningsfulde netværk (statistisk signifikante og med 50% målgener repræsenteret i netværket). blev udvalgt til yderligere analyse

I begge datasæt, forudsigende gener var en del af netværk, der forbinder ekstracellulære molekyler som den pro-inflammatoriske cytokin

IL1β

, de pro-metastatiske kemokiner

CX3CL1

og

CCL20

og vækstfaktorer

IGF1

,

TGF

PDGF BB

med aktiviteten af ​​den nukleare transkriptionsfaktorer

NFkB

,

HF4A

,

TP53

og

MYC

.

Figur 4 beskriver de væsentligste netværk identificeret af IPA ansøgning repræsentant for de modeller, baseret på den molekylære tilstand af normale celler og intelligent af kapselskrumpning indtrængen i Lapointe et al . datasæt (se tabel S2 for den fulde liste over væsentlige netværk identificeret af IPA). Figur 4A viser et netværk repræsenteret ved interaktionen mellem den pro-inflammatoriske cytokin

IL1β

transkriptionsfaktoren

NFkB

. Figur 4B-D repræsenterer tre indbyrdes forbundne sub-netværk, der involverer samspillet mellem flere vækstfaktorer gener og transkriptionsfaktorer P53 (

TP53

) og C-MYC (

MYC

). Mere specifikt figur 4C repræsenterer et netværk, herunder vækst faktorer

IGF1

, dets receptor

IGF1R

PDGF BB

. Figur 4B repræsenterer samspillet mellem den ekstracellulære faktorer angiotensin (

AGT

), vækstfaktoren

TGFp

og Notch receptor ligand Jagged (

JAG

). Figur 4D på den anden side repræsenterer gener, der er direkte eller indirekte forbundet med transskription faktor c-myc (

MYC

).

Figuren repræsenterer de fire mest betydende netværk udvalgt af IPA software. Gener repræsenteret ved blå figurer er til stede i indsamlingen af ​​modeller indsamlet af GA-MLHD procedure. Gener, der er repræsenteret med røde figurer repræsenterer gener i indsamlingen af ​​modeller, men også i de repræsentative mest prædiktive modeller. Gener i nettene er arrangeret ved cellulær lokalisering (ekstracellulær, membran, cytoplasmaet og kernen). Bemærk, at IPA-softwaren søge efter statistisk signifikante sub-netværk af en given maksimal størrelse for at forenkle deres visualisering. Ikke desto mindre, i dette tilfælde de er forbundet som vist med rød stiplet pile forbinder specifikke netværkskomponenter.

De øverste fire mest betydende netværk identificeret fra Singh datasæt (figur S5) repræsenterer gener forbundet med de samme cytokiner og vækstfaktorer identificeret i Lapointe datasættet. Denne interessant observation tyder på, at på trods af den begrænsede mængde overlap på gen-niveau, kan modeller stammer fra to datasæt repræsenterer funktionelt lignende molekylære netværk.

Angivelse af predictive cytokiner, vækstfaktorer og deres receptorer i prostatakræft progression

for at forbedre forståelsen af ​​den biologiske betydning af IPA-netværk, vi analyserede ekspression af gener i forskellige stadier af prostatakræft progression. Vi fokuserede undersøgelsen på en lille delmængde af 20 gener, der repræsenterer de udskilte faktorer indgår i IPA netværk og deres receptorer (Tabel S3).

Med det formål at begrænse indblanding af stromale celle forureninger, udvalgte vi et datasæt repræsenterer en microarray analyse af syv typer normale og tumor epithelceller befolkninger og oprenses ved laser-capture mikro-dissektion (LCM) rapporteret af Tomlins et al. [11]. Disse omfattede normale prostataceller oprenset fra sunde prostata (NOR), normale celler fra benign prostatahyperplasi (BPH), normale celler stødende op til tumoren (adj), tumorceller fra prostata intraepitelialneoplasi (PIN), tumorceller fra lav kvalitet prostatacarcinom (L-PCA), tumorceller fra højkvalitets prostata carcinom (H-PCA) og tumorceller fra prostatakræft metastaser (Meta).

vi hypotesen, at da de 20 gener, vi udvalgte indgik i modeller prædiktive tumor kapsulær penetration, kan de også differentielt udtrykt under prostatakræft progression. Vi testede denne hypotese ved at sammenligne de syv LCM cellepopulationer. Vi opdagede, at en overraskende stor del af disse gener differentielt blev udtrykt (75% ved p

0,001

og 95% ved

s 0,05

) (tabel S3, figur 5, S7 og S8). Yderligere støtte til relevansen af ​​genekspression signatur vi havde identificeret kom fra den iagttagelse, at todimensionale klynge analyser udføres ved hjælp af matrix af forskellen genekspression profiler (gennemsnitlig udtryk for hver gruppe), gengivet den forventede forhold mellem de forskellige stadier i udvikling af prostatacancer (figur 5A). Mere præcist, normale cellepopulationer grupperet sammen efterfulgt af PIN-kode og en klynge af L- PCA og H-PCA. Den Metastatisk cellegruppe grupperet til side.

Figuren viser resultaterne af analysen foretages på datasættet udviklet af Tomlins et al. [11]. Forskellige cellepopulationer er mærket som følger. Normale celler (norm), normale celler stødende op til tumoren (adj), benign prostatahyperplasi (MPH), lav kvalitet prostatacarcinom (L-PCA), high-grade prostatacarcinom (H-PCA) og metastatiske celler (meta). Panel A viser en todimensional klyngeanalyse udført på generne udtrykkes differentielt (

s 0,01

) på tværs af de syv LCM oprensede normale og tumor epithelial cellepopulationer. Panel B repræsenterer ekspressionsniveauet (y-akse) af gener differentielt udtrykt mellem normen, tilstødende og BPH (repræsenteret på y-aksen). Niveauer af individuelle gener på tværs af alle faser er vist i panelerne CF og i figur S8.

Af relevans for forståelsen af ​​biologiske grundlag for den prædiktive effekt af normale celler signatur er den observation, at normale celler stødende op til tumoren viste signifikante forskelle i forhold til normale celler og BPH (figur 5B). Fem gener (

IL1R, LOX

og

TGFBR, CX3CL1

Cyr61

) blev differentielt udtrykt mellem de tre populationer af normale celler. Mere specifikt blev normale celler tilstødende til tumoren (Norm), kendetegnet ved en lavere ekspression af tumorsuppressorgen

LOX

, receptorerne for interleukin 1 (

IL1R

) og

TGFp Hotel (

TGFBR

) og ved en højere udtryk for de pro-tumor gener

Cyr61

og

CX3CL1

.

Vi derefter undersøgte udtrykket af individuelle gener på tværs af de forskellige stadier af tumor progression i forhold til de netværk identificeret af IPA-softwaren (Figur 4).

cytokin

IL1β

, identificeret ved IPA-analyse, som er knyttet til aktivering af pro-metastatiske kemokiner

CX3CL1

og

CCL20

(figur 4A), var opreguleret i tumorcellepopulationer PIN og H-PCA (figur 5A og 5C), hvorimod ekspressionen af ​​

IL1R1

, som medieres aktiviteten af ​​

IL1β

, følger en modsat tendens (figur 5A, B og C). Den pro-metastatisk chemokin

CX3CL1

blev udtrykt ved højere niveauer i tilstødende celle populationen i forhold til PIN, L-PCA og H-PCA, men ikke i Meta celler (Figur 5E). Udtrykket af

LOX

genet blev fundet højere i alle tumorcellepopulationer forhold til tilstødende og normale celler (figur 5F) i overensstemmelse med det faktum, at højere udtryk for

LOX

er blevet forbundet til hypoxi induceret metastaser i bryst, hoved, hals kræft [12], [13].

udtryk for

AGT

,

TGFB

JAG1

blev forbundet i en anden IPA netværk (figur 4B). Udtrykket for angiotensinogen (

AGT

) er højere i tilstødende celler sammenlignet med PIN, L-PCA og H-PCA hvorimod

JAG1

følger en modsat tendens (nedreguleret i tilstødende celler respekt til L -PCA, H-PCA og Meta). Hvis angiotensinogen produceres ved højere niveauer i tilstødende celler en af ​​de aktiverende enzymer, der omdanner produktet af

AGT

gen i angiotensin II (

ACE

) er stedet højere i PIN og L-PCA , hvilket tyder potentialet for udnyttelse i tumorceller ved lavere udviklingstrin prostatakræft. Konstateringen af, at

AGT

JAG1

har modsatrettede tendenser understøtter hypotesen om, at

AGT

kan undertrykke udtryk for

JAG1

(Figur S8 panelerne E og F). Denne forbindelse blev rapporteret af IPA-softwaren (Figur 4B), men blev understøttet af en endotelcelle kultur forsøgsmodel [14]. Disse resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at denne mekanisme også kan være relevant i prostatakræft.

En tredje IPA netværk repræsenterer samspillet mellem tumorfremmende faktorer

IGF1, PDGF BB

Cyr61

(figur 4C). Selv udtryk for

PDGF

er konstant i alle cellepopulationer, dets receptor (

PDGFR

) er højere i H-PCA og Meta cellepopulationer i forhold til tilstødende celler. Udtrykket af

Cyr61

er højere i tilstødende celler respekt til PIN og Meta cellepopulationer (figur S8).

Diskussion

Vi har vist, at normale epitel celle signaturer er forudsigende vigtige træk ved prostatacancer. Denne opdagelse har potentielle kliniske implikationer, da det kan antyder, at den molekylære tilstand af normale celler har prognostisk værdi. På molekylært niveau, har netværket analyse afslørede, at vores tilgang har potentiale til at identificere gener involveret i sygdommen patogenese. Disse omfatter centrale gener, der koder cytokiner og vækstfaktorer udtrykt af normale epitelceller og vides at påvirke biologi tumoren.

Cytokine induceret produktion af pro-metastatiske kemokiner Salg

Netværket vist i figur 4A