PLoS ONE: MicroRNA-afhængig forordning af transskription i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Planocellulært lungecancer (SCC) og adenocarcinom er de

mest almindelige

histologiske undertyper af ikke- småcellet lungekræft (NSCLC), og er traditionelt blevet forvaltet i klinikken som en enkelt enhed. Stigende beviser dog, illustrerer den biologiske mangfoldighed af disse to histologiske undergrupper af lungekræft, og støtter behovet for at forbedre vores forståelse af den molekylære basis ud over de forskellige fænotyper, hvis vi sigter mod at udvikle mere specifikke og individualiseret målrettet terapi. Formålet med denne undersøgelse var at identificere microRNA (miRNA) -afhængig transkriptionel regulering forskelle mellem SCC og adenocarcinom histologisk lungekræft undertyper. I dette arbejde, parret miRNA (667 miRNA ved TaqMan Low Density Arrays (TLDA)) og mRNA profilering (Whole Genome 44 K-array G112A, Agilent) blev udført i tumor prøver af 44 NSCLC patienter. Ni miRNA og 56 mRNA’er blev fundet at være udtrykt forskelligt i SCC versus adenocarcinom prøver. Elleve af disse 56 mRNA blev forudsagt som mål for de miRNA identificeret til at være anderledes til udtryk i disse to histologiske betingelser. Af dem, 6 miRNA (MIR-149, mir-205, mir-375, miR-378, miR-422A og MIR-708) og 9 målgener (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) blev valideret ved kvantitativ PCR i en uafhængig kohorte af 41 patienter med lungecancer. Endvidere blev den omvendte korrelation mellem mRNA og microRNA udtryk også valideret. Disse resultater tyder på miRNA-afhængig transkriptionel regulering forskelle spiller en vigtig rolle i fastlæggelsen af ​​centrale kendetegn for NSCLC, og kan give nye biomarkører for personlige behandlingsstrategier

Henvisning:. Molina-Pinelo S, Gutiérrez G, Pastor MD, Hergueta M, Moreno-Bueno G, García-Carbonero R, et al. (2014) MicroRNA-afhængig forordning af transskription i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10,1371 /journal.pone.0090524

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrig

Modtaget: August 29, 2013; Accepteret: 3 feb 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Molina-Pinelo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. LPA er finansieret af Fondo de Investigación Sanitaria (PI081156, PI1102688 og R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (P08-CVI-04090), og Roche Fellowship i 75-års jubilæum, Spanien. SMP er finansieret af Fondo de Investigación Sanitaria (CD1100153), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el kræft, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 og PI-0046/2012), og Fundación Mutua Madrileña (2009 ). MDP er finansieret af Fondo de Investigación Sanitaria (CD0900148). RGC er finansieret af Fondo de Investigación Sanitaria (PI10 /02164). GMB er finansieret af SAF2010-20175 og Madrid Regional Government (S2010 /BMD-2303). AC lab blev støttet af tilskud til fra det spanske økonomi- og konkurrenceevne, ISCIII (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejería de Ciencia e Innovacion (CTS-6844) og Consejería de Salud af Junta de Andalucia (PI-0135-2010 og PI-0306-2012). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den primære årsag til kræft død på verdensplan, der er ansvarlig for en million dødsfald om året [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for 80% af alle lungetumorer, og omfatter flere histologiske undertyper såsom storcellet carcinom (LCC), pladecellecarcinom (SCC), og adenocarcinom. SCC og adenocarcinom er de

mest almindelige

typer af NSCLC, der tegner sig for 25% og 40% af alle tilfælde, henholdsvis [2], [3]. SCC stammer fra dysplastiske flerlagede epitel i

central

luftveje, mens adenocarcinom stammer fortrinsvis fra prækursor celler i mono- eller dobbeltlag overfladeepitelet af lungen periferien [4].

NSCLC uanset den histologiske subtype, er

traditionelt været behandlet i klinikken som en enkelt homogen enhed. Men flere og flere tegn illustrerer den store biologiske mangfoldighed af denne sygdom, som gradvist fører til mere specifikke diagnostiske og terapeutiske strategier afhængig af pågældende histologiske subtype. Faktisk fremskridt i målrettede lungekræft terapi nu kræver nøjagtig klassificering af NSCLC [5]. For eksempel EGFR mutationer er mere fremherskende hos patienter med lunge-adenocarcinom, og tilstedeværelsen af ​​disse mutationer er forbundet med følsomhed over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer [6]. Tilsvarende ALK traslocations, er til stede i kun 4% af adenocarcinomer, forudsiger en høj følsomhed for ALK-rettede terapier såsom crizotinib. Derimod er FGFR1 forstærkning mere almindeligt observeret i SCC, og er nu ved at blive betragtet som et potentielt handlingsrettede mål i kliniske forsøg med FGFR hæmmere [7]. Derfor er en større viden om de molekylære mekanismer, der er involveret i tilblivelsen, progression og spredning af de forskellige undertyper af NSCLC er nødvendigt for udviklingen af ​​specifikke diagnostiske metoder og design af mere hensigtsmæssige, individualiserede og effektive terapeutiske strategier.

De store fremskridt i genomiske teknologier har genereret mange kandidatlande biomarkører med potentiel klinisk værdi i NSCLC. MikroRNA’er, som post-transkriptionelle modulatorer, er centrale aktører i reguleringen af ​​mange biologiske processer. Dysregulering af deres fysiologiske roller bidrager til mange patologiske tilstande, herunder initiering og progression af cancer. I den forbindelse har en række undersøgelser vurderet den potentielle rolle miRNA underskrifter for at diskriminere histologiske undertyper eller til at forudsige tilbagefald eller overlevelsen af ​​NSCLC patienter [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], og miRNA profilering er blevet foreslået som en meget pålidelig strategi for klassificering NSCLCs [11], [15], [16]. Ikke desto mindre er den høje kompleksitet transkriptom regulering komplicerer fuld forståelse af gen regulatoriske netværk er involveret i disse processer.

For at løse dette problem, er formålet med denne undersøgelse var at vurdere miRNA-afhængig transkriptionel regulering forskelle mellem SCC og adenocarcinom histologiske lungekræft undertyper. Med dette formål, miRNA og mRNA parret udtryk profiler blev analyseret i NSCLC tumorprøver, og de potentielle samspil mellem dem blev udforsket. I denne undersøgelse har vi identificeret og valideret en delmængde af deregulerede miRNA og target gener, der er i stand til at definere forskellige molekylære funktioner i disse to store histologiske undertyper af NSCLC.

Materialer og metoder

Patienter og Tumor Prøver

Patienter inkluderet i denne undersøgelse skulle have histologisk bekræftet tidligt stadium SCC eller adenocarcinom NSCLC. Tumorprøver fra 85 patienter blev prospektivt indsamlet under den kirurgiske procedure og straks snap-frosset ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Tilstødende ikke-tumor lungevæv blev også indsamlet fra patienter, der indgår i valideringen kohorte. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser deltagende centre [Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid) og Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla)] og alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke før studere indrejse. Kliniske og patologiske data blev udtrukket fra de medicinske journaler og centralt revideret med henblik på denne undersøgelse. Studiepopulationen blev delt i en uddannelse kohorte (N = 44), blev anvendt til profil udvikling og en uafhængig validering kohorte (N = 41). Vigtigste karakteristika for studiepopulation er opsummeret i tabel 1 og 2. |

Microarray genekspressionsprofiler

microarray eksperimenter blev udført ved hjælp af menneskelige Whole Genome 44 K-array G4112A (Agilent Technologies , Wilmington, DE). RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen) og RNAesy Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland) som angivet af fabrikanterne. RNA blev mærket og array hybridiseret under anvendelse af lav-RNA Linear Amplification Kit og in situ-hybridisering Kit Plus (Agilent Technologies, Wilmington, DE) hhv. Efter hybridisering og vask blev objektglassene scannet i en Axon GenePix Scanner (Axon Instruments Inc., Union City, CA) og analyseret ved hjælp af Feature Extraction Software 6.1.1 (Agilent teknologier, Wilmington, DE). RNA fra tumorprøver blev mærket med Cy5-dUTP og hybridiseret mod en lungekræft henvisning pool (mærket med med Cy3-dUTP) bestående af primære tumorvæv fra patienter med forskellige histologiske undertyper af lungecancer. Som kontrol blev ti yderligere hybridiseringer udført ved hjælp af den gensidige fluorokrom mærkning.

For at detektere differentielt udtrykte gener mellem de to histologiske undertyper, to former for analyser blev foretaget med MIDAW værktøjet [17]. Først blev en t-test udført med falsk opdagelse sats (FDR) kontrol estimeres ved anvendelse af single-trins Bonferroni procedure. Gener, som passerede t-testen filter blev udsat for et andet filter. Kun gener viser en logaritmiske forholdsværdi lavere at -0.3 eller større end 0,3 (svarende til en 2-gange ændring) blev selekteret som differentielt udtrykt. For det andet, en diskriminant analyse til identifikation af sættet af bedste markørgener blev udført baseret på Forudsigelse Analyse af Microarray (PAM) algoritme. Microarray rå datatabeller er deponeret i Gene Expression Omnibus under tiltrædelse antal GSE42998.

MicroRNA QRT-PCR-analyse

Total RNA, som indeholder små RNA, blev ekstraheret fra tumor vævsprøver ved Mirvana miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA) ifølge producentens anvisninger. Det totale RNA udbytte blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Tech, DE, USA). Agilent 2100 Bioanalyzer blev anvendt til at bestemme mængden og kvaliteten af ​​de RNA-prøver (Agilent, Palo Alto, CA). Modne humane miRNA ekspression blev detekteret og kvantificeret ved anvendelse af TaqMan Low Density Arrays (TLDA) baseret på Applied Biosystems ‘7900 HT Micro Fluidic Cards (Applied Biosystems, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. The Human MicroRNA Card Set v2.0 array (Katalognummer 4.400.238) er en to kort sæt indeholder i alt 384 TaqMan miRNA tests per kort for at muliggøre nøjagtig kvantificering af 667 menneskelige microRNA’er, alle katalogiseret i miRBase databasen. TLDAs blev udført i en totrins-proces. Kort beskrevet under det første trin, 450 ng af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse Megaplex RT-primere og TaqMan miRNA revers transkription kit i et samlet volumen på 7,5 pi. De 7,5 pi reaktioner blev inkuberet i en G-Storm Thermal Cycler (Gene Technologies, Essex, UK) i 2 minutter ved 16 ° C, 1 min ved 42 ° C, og 1 min ved 50 ° C i løbet af 40 cykler, holdt i 5 min ved 85 ° C, og derefter holdt ved 4 ° C. I det andet trin blev 6 pi cDNA prøve og TaqMan Universal PCR Master Mix er lagt i fyld porte på TLDA mikrofluid kort. Kortet blev kortvarigt centrifugeret i 1 min ved 331 g til at distribuere prøver i de multiple brønde forbundet til påfyldningsportene og derefter forseglet for at hindre well-til-brønd kontaminering. Reaktionerne blev inkuberet i en plade med 384 ved 50 ° C i 2 sekunder og 94,5 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 97 ° C og 1 minut ved 59 ° C. Endelig blev kortene behandlet og analyseret på en ABIPrism 7900 HT Sequence Detection System. TLDA rå datatabeller er deponeret i Gene Expression Omnibus under tiltrædelse antal GSE43000. Ekspression af target miRNA blev normaliseret til ekspression af RNU48. En ikke-humant miRNA, blev anvendt i hvert eksperiment som en negativ kontrol. Cyklus tærskel (CT) værdier blev beregnet under anvendelse af SDS software V.2.3 anvendelse af automatiske baseline indstillinger og en tærskel på 0,2. Relativ kvantificering af miRNA ekspression blev beregnet af 2

-ΔCt metode (Applied Biosystems bruger bulletin nr. 2 (P /N 4.303.859)). Kun miRNA påviselig i mindst 80% af prøverne blev betragtning ved vurderingen. Betydningen af ​​miRNA udtryk observerede forskelle mellem de to histolofical undergrupper (adenocarcinom og SCC) blev vurderet af t-test.

mRNA og miRNA Expression Correlation Assessment

For at vurdere den potentielle sammenhæng mellem differentielt udtrykt mRNA og miRNA observeret i vores undersøgelse, søgte vi efter de transkriptionelle mål for de identificerede miRNA i tre web-databaser for miRNA target forudsigelse: Miranda [18], Targetscan frigive 6,0 [19], og miRWalk [20]. Formodede målgener som matcher med dem, der findes at være disreguleret i vores patientpopulation blev udvalgt til yderligere validering af qPCR.

Validering af Microarray genekspressionsprofiler af qPCR

Eleven differentielt udtrykte gener blandt de to undersøgelse betingelser (SCC og adenocarcinom NSCLC), er identificeret som formodede mål for flere dis-regulerede miRNA, blev udvalgt til yderligere validering af qPCR i den oprindelige uddannelse kohorte og derefter i en uafhængig validering kohorte. Den RNA blev revers transkriberet til cDNA med høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Kort fortalt blev enkeltstrenget cDNA syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA i 10 pi reaktionsvolumen ifølge producentens protokol. Reaktionen blev inkuberet ved 25 ° C i 10 minutter efterfulgt af 120 minutter ved 37 ° C og inaktivering ved 85 ° C i 5 min. Den TaqMan Gene Expression analysesystem (Applied Biosystems) blev anvendt til at kvantificere transskription niveauer af udvalgte gener (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3

KRT6A ).

Tre endogene kontrol gener (

B2M

,

ACTB

GAPDH

) og en no-template-kontrol (NTC) blev også kørt for hver RNA prøve. Vi valgte

B2M

for normalisering på tværs af forskellige gener, da dette gen viste den mest relativt konstant udtryk på tværs af forskellige vævsprøver (data ikke vist). Genekspressionen for hvert gen blev bestemt under anvendelse midterplan ekspressionsniveauet af de tre tekniske replikater. PCR reaktioner blev udført på et Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection systemet i 10 pi volumener ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Ct-værdier blev opnået med SDS software V.2.3 (Applied Biosystems). Relativ kvantificering af mRNA-ekspression blev beregnet af 2

-ΔCt metode (Applied Biosystems bruger bulletin nr. 2 (P /N 4.303.859)).

Validering af miRNA TLDA Expression Profiles af qPCR

Angivelse af ni udvalgte miRNA (MIR-149, mir-205, mir-375, mir-378, miR-422A, miR-483-5p, miR-494, miR-601 og miR-708) blev vurderet i uafhængig validering kohorte af den særlige TaqMan miRNA tests i overensstemmelse med producentens instruktioner (Applied Biosystems). Kort fortalt, 2 ng /pi totalt RNA blev omdannet til cDNA ved revers transkriptase reaktion, der blev udført ved sekventiel inkubering ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. PCR-reaktionsblanding (10 pi) indeholdt 0,66 pi RT produkt, 5 pi TaqMan 2X Universal PCR Master Mix og 0,5 pi af den passende TaqMan MicroRNA Assay (20X) indeholdende primere og probe til miRNA af interesse (Applied Biosystems). Blandingen blev indledningsvis inkuberet ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder. MicroRNA ekspression blev kvantificeret ved den sammenlignende 2

-ΔΔCt metode, normalisering Ct-værdier til RNU48. I valideringen kohorte, tumor udtryk værdier desuden normaliseret til udtryk værdier parret tilstødende normale lungevæv.

3′-UTR Reporter Assay for miR Target Validering

Bekræftelse af miR-149-bindende til 3’UTR af ABCC3 og mIR-378 og mIR-422-binding til 3’UTR of TMEM45B. HEK 293-celler ved 80% konfluens blev cotransficeret med luciferase reporter plasmider, der huser den komplette 3′-UTR af det ønskede gen (SWITCHGEAR Genomics) sammen med 100 nM af hver MIR-mimic eller miRNA kontrol (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) blev anvendt som transfektionsreagens i

Opti-MEM

(Life Technologies). Luminescens blev analyseret 24 timer senere med LightSwitch assayreagenser (SWITCHGEAR Genomics) ifølge producentens instruktioner. Knockdown blev vurderet ved at beregne luciferasesignal forhold til specifik miRNA /ikke-targeting kontrol, ved hjælp af tomme reporter vektoren som kontrol for ikke-specifikke virkninger. Hvert eksperiment blev udført tre gange. t-test blev udført for brønde fra flere eksperimenter, og vi sammenlignet efterligner transficeret celler med en mimisk kontrol for hvert gen vektor.

Diagnostisk Performance Assessment af udvalgte gener

Diagnostiske ydeevne parametre blev beregnet for udvalgte gener i 2×2-kontingenstabeller. Konfidensintervaller for disse parametre blev beregnet med Pearson metode baseret på F-fordelingen. Som sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi (PPV) og negativ prædiktiv værdi (NPV) er statistiske mål for udførelsen af ​​en binær test klassificering blev genekspression værdier konverteres til binære variable med median udtryk værdi som referenceværdi (høj versus lav ekspression). Disse parametre blev beregnet for hver valideret miRNA /mål-mRNA pair. Den samtidige forekomst af høj miRNA udtryk og lav target mRNA-ekspression i det relevante histologiske tilstand (SCC eller adenocarcinom) blev betragtet som en sand positiv test. Følsomhed eller sande positive sats måler andelen af ​​faktiske positive som er identificeret korrekt. Specificitet eller sande negative rate måler andelen af ​​negativer, som er identificeret korrekt. PPV beskriver sandsynligheden for at have tilstanden givet en positiv screeningstest resultat i den analyserede population. Den NPV beskriver sandsynligheden for ikke at have den betingelse givet en negativ screening testresultat i den analyserede population.

Resultater

Profil udvikling

Gene udtryk profiler ved histologisk undertype.

Hele genom udtryk arrays blev udført i tumor prøver af patienter af uddannelsen kohorten og udtryk profiler af SCC og adenocarcinom tumortyper blev sammenlignet ét gen ad gangen ved hjælp af en stikprøve

t

– prøve. Efter enkelt trin Bonferroni tilpasning, blev 727 gener identificeret til at være differentielt udtrykt af mere end to gange i enten histologisk subtype forhold til reference pool (tabel A, B, C og D i tabel S1). Af disse 727 gener, blev fem opreguleret og 195 nedreguleres i patienter med adenocarcinom, og 13 blev opreguleret og 516 nedreguleres i patienter med SCC.

Derudover en anden uafhængig evaluering af mRNA differentiel ekspression blev udført ved diskriminant microarray dataanalyse at minimere falsk-positive resultater. Den Forudsigelse Analyse af Microarray (PAM) algoritme identificerede 61 gener, der definerede en molekylær signatur i stand til at skelne adenocarcinom fra SCC prøver (figur 1). Af disse 61 gener, 56 matchede dereguleret gener findes ved den tidligere udførte en stikprøve t-test, og blev derfor udvalgt til videre analyse og validering.

Forudsigelse Analyse af Microarray algoritme identificerede 61 gener, der definerede en molekylær signatur for hver histologisk undertype. Modulatorerne ‘dendrogram repræsenterer et uovervåget hierarkisk clustering analyse af 19 adenocarcinom og 25 SCC baseret på deres genekspressionsprofil. Varmen kort var farvekodede hjælp rødt for opregulering og grønt til nedregulering fra et lungekræft henvisning pool. På

toppen af ​​heap kortet,

farver svarer til genekspression profiler af SCC prøver (blå) versus adenocarcinom prøver (rød).

MicroRNA udtryk profil ved histologisk undertype.

MikroRNA’er TLDA arrays blev udført i tumor prøver af patienter af uddannelsen kohorte. Ni miRNA (MIR-149, mir-205, mir-375, mir-378, miR-422A, miR-483-5p, mir-494, miR-601 og MIR-708) blev fundet at være udtrykt forskelligt mellem SCC og adenocarcinoma histologiske undertyper af en FDR-korrigeret tærskel på 0,05. Otte af disse 9 miRNA var overudtrykt i SCC sammenlignet med adenocarcinom, og én (MIR-375) blev overudtrykt i adenocarcinom i sammenligning med SCC (tabel 3).

MicroRNA target forudsigelse.

Elleve af de 56 gener (20%) fundet for deregulering af tumortype i vores undersøgelse fandtes at være formodede mål for mindst en af ​​de 9 miRNA også identificeret til at være differentielt udtrykt i vores undersøgelse population ifølge histologisk undertype (SCC versus adenocarcinom). For de 8 over-udtrykte miRNA i SCC, 8 mRNA (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B

MUC1

) blev forudsagt som mål ved flere algoritmer. Disse gener blev fundet at være nedreguleret i SCC sammenlignet med adenocarcinom i vores undersøgelse (tabel 2). Tre af disse 8 gener (

CEACAM6, MLPH

TMEM45B)

blev forudsagt mål af mere end én af disse miRNA (figur 2). Som det fremgår af tabel 2, tre gener (

DSC3, KRT6A

DMRT2

) blev forudsagt som mål af miR-375, den miRNA opreguleret i adenocarcinom, og disse gener blev konsekvent nedreguleret i denne histologiske subtype.

grafen viser de transkriptionelle mål for forskelligt udtrykte miRNA i SCC og adenocarcinom tumortyper ved hjælp af tre web databaser miRNA target forudsigelse (Miranda, Targetscan og miRWalk). Standard farve ordningen bruges til at repræsentere udtryk niveau er rød /blå (rød for overekspression af mRNA’er eller miRNA i SCC versus adenocarcinom og blå for ned-ekspressionen af ​​mRNA eller miRNA i SCC versus adenocarcinom).

pile

angiver mRNA undertrykkelse af

tilsluttet miRNA

. Squares repræsenterer dereguleret mRNA og ovaler repræsenterer differentielt udtrykte miRNA i lunge adenocarcinom og SCC.

Profil Validering

Validering af gen forskellig ekspression ved kvantitativ RT-PCR.

Elleve deregulerede gener (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2

KRT6A),

identificeret som formodede målgener af deregulerede miRNA i vores undersøgelse , blev derefter udvalgt til yderligere validering af rtPCR både i uddannelsen kohorten og i en uafhængig kohorte af patienter.

i uddannelsen kohorte, 9 af de 11 gener testede blev bekræftet at være forskelligt udtrykt af histologisk undertype ved kvantitativ PCR (figur 3).

CEACAM5

,

CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5

,

MLPH

og

TMEM45B

var signifikant nedreguleret i SCC, og

KRT6A

var signifikant nedreguleret i adenocarcinom.

for at validere gener identificeret som differentielt udtrykt af tumor histologi i microarray data, relative ekspressionsniveauer af mRNA blev kvantificeret ved real-time PCR ved hjælp af ACt metoden af

B2M

som husholdning gen. Graferne viser mediane ACt værdier af validerede gener hos patienter med adenocarcinom versus SCC. Data fra RT-qPCR præsenteres som log

2 2

-ΔCt værdier.

P

værdi under 0,05 blev betragtet som signifikant.

Baseret på resultater opnået i uddannelsen kohorten blev 9 mRNA og 9 miRNA udvalgt til yderligere validering af Taqman-RT-qPCR i tumor og matchet normalt væv fra en uafhængig kohorte af patienter med lungecancer. I denne kohorte, ekspressionsmønstre af mRNA var i overensstemmelse med dem, kvantificeret i uddannelsen kohorte. Ekspressionsmønstre ved histologisk undertype af alle 9 testede mRNA’er lignede dem observeret i uddannelse kohorte, og observerede forskelle blandt undergrupperne var alle statistisk signifikante (figur 4). Med hensyn til de 9 miRNA, fem (MIR-149, MIR-205, MIR-378, MIR-422a og MIR-708) viste sig at være signifikant overudtrykt i SCC og MIR-375 var signifikant overudtrykt i adenocarcinom (figur 5).

Angivelse af ni mRNA blev valideret af real-time PCR i en uafhængig kohorte af NSCLC patienter. mRNA-ekspression blev bestemt i tumorprøver og parret normalt lungevæv fra lungecancerpatienter og relative ekspression ved histologisk subtype blev vurderet. Median ΔΔCt værdier blev bestemt i de validerede gener hos patienter med adenocarcinom og SCC. Data fra RT-qPCR præsenteres som 2

-ΔΔCt værdier.

P

værdi under 0,05 blev betragtet som signifikant.

Angivelse af deregulerede miRNA blev evalueret i valideringen kohorte. MiRNA ekspressionsniveauer blev bestemt i tumor og parret normalt lungevæv af lungecancerpatienter og relative ekspression ved histologisk subtype blev vurderet. Median ΔΔCt værdier blev bestemt i ni miRNA hos patienter med adenocarcinom versus SCC. Data fra RT-qPCR præsenteres som 2

-ΔΔCt værdier.

P

værdi under 0,05 blev betragtet som signifikant.

Sammenhæng mellem miRNA og mRNA-ekspression.

For at studere den funktionelle betydning af miRNA i reguleringen af ​​specifikke mRNA identificeret som potentielle biomarkører, analyserede vi i valideringen kohorten sammenhængen mellem miRNA og forudsagte target-mRNA’er ekspression i hver patient (figur 6). blev observeret en omvendt korrelation mellem

ABCC3, MUC1

CEACAM6

og miR-149 ekspressionsniveauerne. Desuden højere niveauer af

CEACAM6

var forbundet med lavere niveauer af miR-205 og miR-708, er korrelationen signifikant for miR-708 (r = -0362; p = 0,030).

ACSL5

og

KRT6A

havde en statistisk signifikant sammenhæng med miR-205 (r = -0,475, p = 0,003) og miR-375 (r = -0,311, p = 0,065), henholdsvis .

I tilfælde af

TMEM45

B, signifikante korrelationer blev fundet for miR-378 og miR-422a (r =

–

0,394, p = 0,016 og r =

–

0,413, p = 0,015, henholdsvis).

disse resultater tyder på en potentiel rolle miRNA i reguleringen af ​​disse gener. Efterfølgende blev nogle af disse mål testet under anvendelse luciferasereportergen assays. Vi opnåede at overekspression af MIR-149 i HEK 293-celler nedregulerer luciferaseaktiviteten af ​​reporter konstrukt indeholdende ABCC3 3-UTR (figur 7). Dette viser, at MIR-149 binder direkte til dette mål-RNA og hæmmer deres ekspression. Desuden overekspression af MIR-378 og MIR-422a inhiberer signifikant TMEM45B ekspression (figur 7).

Ekspression af de 6 validerede miRNA og af deres formodede målgener blev målt i hver patient i valideringen kohorte. Betydningen af ​​omvendt sammenhæng mellem disse miRNA /mRNA par blev vurderet af Spearman korrelationskoefficient. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. A) Forholdet mellem

ABCC3

,

MUC1

CEACAM6

med miR-149. B) Forholdet mellem

ACSL5

og

CEACAM6

med miR-205. C) Forholdet mellem

TMEM45B

og miR-378. D) Forholdet mellem

TMEM45B

og miR-422a. E) Forholdet mellem

CEACAM6

og miR-7018. F) Forholdet mellem

KRT6A

og miR-miR-175.

HEK 293 celler blev transficeret med luciferase reporter vektor, der indeholder 3’UTR region ABCC3 og TMEM45B. Reporter vektorer blev cotransficeret med en miRN efterligner eller kontrol miRN efterligne. Efter 24 h inkubation blev luciferaseaktivitet målt. * P 0,05 og ** p 0,001 af

t

-test

Diagnostisk Udførelse af udvalgte gener til at skelne SCC fra Adenocarcinom Histologisk NSCLC undertyper

Endelig. evaluerede vi specificiteten og følsomheden af ​​disse seks validerede miRNA i kombination med deres forudsagte mRNA’er til at skelne mellem SCC og adenocarcinom (figur 8). Den bedste præstation blev observeret for

KRT6A,

som et mål for miR-375, med følsomhed og specificitet værdier på 94,1% og 88,9%, hhv. God diagnostisk præstation blev også observeret for

CEACAM6, ACSL5 y MLPH,

som mål for miR-205, med lavere specificitetsværdier (71,4-76,2%), men højere følsomhed (100%). Endelig

TMEMB45B,

som mål for miR-378, viste en følsomhed på 87,5% og en specificitet på 57,7%. De andre miRNA /mRNA par afslørede lavere følsomhed og specificitet værdier, selv om de var større end 75% og 50% i alle tilfælde (tabel S2).

Plot viser specificitet og sensitivitet af validerede miRNA i kombination med forudsagte mRNA til at skelne mellem SCC og adenocarcinom. Farverne repræsenterer nedreguleret mRNA fra seks deregulerede miRNA i SCC eller adenocarcinom.

Diskussion

I denne undersøgelse analyserede vi mRNA og miRNA udtryk underskrifter fra patienter med forskellige undertyper af NSCLC . Dette tillod os at konstruere en robust transskriptionsprofilen af ​​lunge adenocarcinom og SCC. Vores resultater ikke blot angive eksistensen af ​​en mRNA og /eller miRNA ekspressionsmønstre der er i stand til at skelne mellem SCC og adenocarcinom, men også, at den ændrede genekspression signatur er delvist forårsaget af specifikke miRNA deregulering.

Først vi analyseret af to tilgange hele genomet ekspression microarray data for at minimere falske positiver. Vi undersøgte differential genekspression niveauer af diskriminere microarray dataanalyse og af en stikprøve

t

-test. Fifty-seks gener viste sig at være betydeligt dereguleret af både analyser og blev derfor udvalgt til yderligere evaluering og validering. Bemærkelsesværdigt, flere af dem tidligere er blevet impliceret i relevante biologiske processer (ifølge gen ontologi) i lungekræft. For eksempel er nogle gener i

KRT

familie, som blev nedreguleret i adenocarcinom, involveret i flere kritiske cellefunktioner såsom cellemigration, vækst og proliferation [21]. For det andet, miRNA identificeret 9 miRNA, der var forskelligt udtrykte blandt de to histologiske undertyper af NSCLC undersøgt. Seks af dem (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a og miR-708) blev yderligere valideret i en uafhængig kohorte af NSCLC patienter som biomarkører i stand til at skelne adenocarcinom og SCC. For at vurdere, om disse miRNA kunne være direkte regulerer nogle af de 56 deregulerede gener identificeret adskillige bredt anvendte algoritmer blev anvendt. Elleve af disse 56 gener (20%) blev således forudsagt at være formodede mål for mindst en af ​​de seks miRNA fundet at være udtrykt forskelligt i SCC sammenlignet med adenocarcinom.