PLoS ONE: Curcumin Forbedrer Effekt af kemoterapi mod kolorektal kræftceller ved hæmning af NF-KB og Src Protein kinase Signaling Pathways

Abstrakt

Målsætning

Udvikling af behandling modstand og negativ toksicitet i forbindelse med klassiske kemoterapeutiske stoffer fremhæver behovet for mere sikre og effektive behandlingsmetoder. Heri undersøgte vi effektiviteten af ​​en kombination behandlingsregime af 5-fluorouracil (5-FU) og curcumin i kolorektal cancer (CRC) celler.

Metoder

vildtype HCT116 celler og HCT116 + CH3-celler (suppleret med kromosom 3) blev behandlet med curcumin og 5-FU i en tids- og dosisafhængig måde og evalueres af celleproliferationsassays, DAPI-farvning, transmissionselektronmikroskopi, cellecyklusanalyse og immunoblotting for vigtige signalproteiner.

Resultater

Den enkelte IC

50 af curcumin og 5-FU var ca. 20 pM og 5 uM i HCT116 celler og 5 uM og 1 uM i HCT116 + CH3-celler, henholdsvis (

s 0,05

). Forbehandling med curcumin signifikant nedsat overlevelse i begge celler; HCT116 + CH3-celler var betydeligt mere følsomme over for behandling med curcumin og /eller 5-FU end vildtype HCT116 celler. IC

50 værdier for kombinationsbehandlingen var ca. 5 uM og 1 uM i HCT116 og 5 uM og 0,1 uM i HCT116 + CH3 henholdsvis (

s 0,05

). Curcumin induceret apoptose i begge celler ved at inducere mitokondrie degeneration og cytochrom c-frigivelse. Cellecyklusanalyse afslørede, at anti-proliferative effekt af curcumin og /eller 5-FU blev efterfulgt af akkumulering af CRC-celler i S cellecyklusfase og induktion af apoptose. Curcumin potenserede 5-FU-induceret ekspression eller spaltning af pro-apoptotiske proteiner (caspase-8, -9, -3, PARP og Bax), og nedreguleres anti-apoptotiske (Bcl-XL) og proliferativ (cyclin D1) proteiner . Selvom 5-FU aktiveret NF-KB /PI-3K /Src vej i CRC celler, dette blev nedreguleret ved curcumin behandling gennem hæmning af kBa kinase aktivering og kBa fosforylering.

Konklusioner

kombinere curcumin med konventionelle kemoterapeutiske midler, såsom 5-FU kan give mere effektive behandlingsstrategier mod kemoresistent coloncancerceller. De involverede mekanismer kan medieres via NF-KB /PI-3K /src veje og NF-KB reguleret genprodukter

Henvisning:. Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel A (2013) Curcumin øger virkningen af ​​kemoterapi mod kolorektal kræftceller ved hæmning af NF-KB og Src proteinkinase signalveje. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10,1371 /journal.pone.0057218

Redaktør: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Juli 9, 2012; Accepteret 22. januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Shakibaei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende. dødsårsager hos mænd og kvinder, og blandt de tredje mest almindelige kræftformer globalt [1]. Forekomsten af ​​CRC er stadig stigende på trods af vores forbedrede forståelse af patogenesen af ​​denne sygdom, samt etablering af forbedrede screening strategier for denne malignitet. Det er blevet rapporteret, at næsten 50% af patienterne med CRC, vil udvikle tilbagevendende sygdom, hvilket indikerer, at for tiden tilgængelige behandlingsregimer er ikke i stand til at styre denne dødelige sygdom, og der er en absolut nødvendighed behov for forbedrede terapier [2]. 5-fluorouracil (5-FU) er en af ​​de klassiske lægemidler, der anvendes som kemoterapeutisk middel mod CRC. 5-FU behandling undertrykker tumorcellevækst og inducerer apoptose ved inkorporering af dets metabolitter i DNA og RNA gennem thymidylatsyntase. Imidlertid er gevinst hos det kemoterapeutiske effekt af 5-FU noget begrænset i patienter med kolorektal cancer, primært som følge af erhvervet progressiv modstand af CRC-celler til 5-FU og toksicitet omgivende raske celler [3], [4].

de fleste tumorer aktiverer transskription faktor nukleare faktor-KB (NF-KB), mens naturlige kemoforebyggende midler undertrykker det, hvilket indikerer en stærk sammenhæng mellem tumor biologi og anti-cancer effekter af forskellige naturlige forbindelser [5]. I modsætning til sunde celler, NF-KB i størstedelen af ​​faste og hæmatopoietiske tumorcellelinier er konstitutivt aktiv [6]. Endvidere pro-inflammatoriske cytokiner, kemoterapeutiske midler og strålebehandling, som inducerer apoptose også aktivere NF-KB [7], og dermed kan mediere kemoresistens og radioresistance af tumorceller [8]. Interessant inhibering af NF-KB i tumorceller blokke proliferation, forårsager standsning af cellecyklus, og fører til apoptose, hvilket tyder på en central rolle for denne transkriptionsfaktor i celleproliferation og overlevelse [9]. NF-KB spiller en vigtig rolle i celleproliferation og malign transformation i forskellige celler, binding til DNA målsteder som homo- eller heterodimer at påvirke nedstrøms genekspression [10], [11].

CRC menes at forekomme som en konsekvens af trinvis akkumulering af genetiske ændringer i forskellige gener, der fører til forøget genomisk ustabilitet. Sådanne ændringer har direkte indflydelse på metastase-associerede gener, onkogener og tumorsuppressorgener [12], [13]. Desuden er der øget erkendelse af, at ud over genetiske begivenheder i CRC kan ændringer i genekspression være medieret af epigenetiske ændringer, herunder afvigende methylering af DNA, histon modifikationer og kromatin remodeling [14], [15]. Derudover mismatch repair (MMR) spiller en vigtig rolle i korrekturlæsning DNA-syntese fejl under cellereplikation. Skader på MMR systemet forårsager genetisk ustabilitet, hvilket fører til ændringer i cellens fænotype, gør cellen mere modtagelig for neoplastisk transformation og fremme udviklingen af ​​kemoterapeutiske modstand. DNA MMR proteiner, såsom hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 og hMLH3 spiller en vigtig rolle i både sporadiske og familiær sorter af menneskelig CRC [16], [17], [18], [19]. Faktisk giver det restaurering af MMR defekt ved re-ekspressionen af ​​hMLH1or hMSH2 ved kromosom overførsel øget følsomhed over for de agenser [20], [21].

CRC er en forebygges sygdom, og er stærkt påvirket af miljømæssige , livsstil og kostfaktorer. I denne sammenhæng er der en voksende mængde litteratur antyder, at adskillige naturligt forekommende stoffer som kosttilskud kan reducere risikoen for kræft og er blevet rapporteret til at holde en central rolle i udviklingen af ​​antitumorlægemidler [22], [23]. Naturlige produkter med evnen til at inhibere aktivering af den nukleare transskriptionsfaktor NF-KB kan have terapeutisk potentiale mod tumorudvikling ligesom CRC. Curcumin (diferuloylmethane) er den biologisk aktive fytokemiske komponent til stede i krydderiet gurkemeje (

Curcuma longa

), og har vist sig at være en potent inhibitor af NF-KB-aktivering i flere celletyper ved ikke-toksiske koncentrationer hos mennesker [ ,,,0],24]. Den anti-tumor egenskab curcumin, skyldes dels anholdelsen af ​​kræftceller i S, G2 /M cellecyklus fase og induktion af apoptose. Endvidere curcumin hæmmer væksten af ​​DNA MMR-defekte coloncancerceller [25], [26]. Det er også blevet rapporteret, at curcumin nedregulerer konstitutivt aktiveret kinase PI-3K /AKT pathways i T-celle-leukæmiceller, der hæmmer proliferationen og inducerer caspase-afhængig apoptose [27].

Eftersom kolorektal cancer patienter med DNA fejlparringsreparationsmangel ikke er omfattet af 5-FU baseret kemoterapi, vi brugte et par af isogene cellelinjer, HCT116 (MMR-mangel, på grund af hypermethylering af MLH1 gen) og HCT116 + CH3 (MMR-dygtige på grund af stabil overførsel af kromosom 3 bærende vildtype kopi af MLH1 genet). Formålet med denne undersøgelse var at undersøge chemosensitization potentiale curcumin i 5-FU-baseret kemoterapi i MMR-mangelfulde og -proficient CRC celler.

Materialer og metoder

Antistoffer

Antistoffer mod MMP-9 (MAB 911) og aktiv caspase-3 (AF835) blev opnået fra R Zeiss). For at kvantificere morfologiske evalueringer og definere den tid punkt, hvor 50% af cellerne viste mitokondrielle forandringer (MC) og /eller apoptotiske blev antallet af celler med morfologiske træk ved apoptotisk celledød herunder MC bestemt ved lave 100 celler fra 20 forskellige mikroskopiske områder.

Cell Cycle Analysis ved flowcytometri

HCT116 celler (1 x 10

6) blev forgyldt med 60 mm vævskulturplader og efter ca. 80% konfluens celler behandlet med 20 pM curcumin, 5 uM 5-FU, eller deres kombination (5 pM curcumin og 1 pM 5-FU) for 12 og 24 timer. I et separat eksperiment blev HCT116 + CH3-celler behandlet med 5 pM curcumin, 1 pM 5-FU, eller deres kombination (5 pM curcumin og 0,1 uM 5-FU) for 12 og 24 timer. Efter behandling blev cellerne fikseret ved hjælp iskold 70% ethanol, vasket 2 gange med PBS og derefter resuspenderet med propidiumiodid (10 ug /ml) og ribonuclease A (0,1%) i PBS i 30 min. Celler blev inkuberet i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. Fluorescerende begivenheder fra propidiumiodid-DNA-komplekser blev kvantificeret efter laser excitation af det fluorescerende farvestof ved fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) (Becton Dickinson, CA) med en celletælling på 10.000 celler per prøve. Endelig blev DNA-indhold af cellerne på forskellige faser af cellecyklus bestemt ved hjælp Cell Quest software (Becton Dickinson). Eksperimenter og analyser blev udført i tre eksemplarer.

Udarbejdelse af nukleare og cytoplasmatiske ekstrakter til at evaluere NF-KB-translokation

De nukleare ekstrakter blev fremstillet som tidligere [31] beskrevet. Kort beskrevet blev celler suspenderet i 400 pi hypotonisk lysepuffer indeholdende proteaseinhibitorer i 20 min. Cellerne blev derefter lyseret med 12,5 pi 10% Nonidet P-40. Homogenatet blev centrifugeret i 1,5 minutter, og supernatant (cytoplasmatiske ekstrakter) blev opbevaret frosset ved -70 ° C. Derefter 25 pi iskold nuklear ekstraktionspuffer blev tilsat til pelletene og inkuberet i 30 minutter med periodisk blanding. Ekstrakter blev centrifugeret, og supernatanten (kerneekstrakter) overført til præ-kølet rør til opbevaring ved -70 ° C.

Isolering af mitokondrielle ekstrakter til påvisning af cytochrom c-frigivelse

Celler blev vasket i 1 ml iskold PBS og anbragt i iskold mitokondrier isolation puffer (0,25 M saccharose, 0,2 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl, pH 7,8) i 30 min, efterfulgt af homogenisering ved anvendelse af en for-kølet glashomogenisator. Cellelysater blev centrifugeret ved 1000 g i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten blev centrifugeret ved 12.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Isolerede mitokondrier blev resuspenderet i mitokondrier isoleret buffer indeholdende proteaseinhibitorer (5 ug /ml leupeptin, 5 ug /ml pepstatin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 100 mM natriumorthovanadat, 10 mM natriumfluorid, og 10 mM phenylarsine oxid).

Western blot-analyse

for at bestemme virkningerne af curcumin, 5-FU eller curcumin /5-FU på HCT116 og HCT116 + CH3-celler, helcellelysater, cytoplasmatisk , mitokondrielle og de nukleare ekstrakter af monolagskulturer blev fremstillet og fraktioneret ved SDS-PAGE [29], [32]. Den samlede proteinkoncentration celleekstrakterne blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre assaysystem (Uptima; Interchim, Montlucon, Frankrig) under anvendelse af BSA som en standard. Lige mængder (500 ng protein per bane) af totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (5%, 7,5%, 12% geler) under reducerende betingelser.

Immunkompleks kinaseassay

Immune kompleks kinaseassay blev udført som tidligere beskrevet detaljeret [33]. Kort fortalt, for at teste virkningen af ​​curcumin og PI-3K-inhibitor (wortmannin) på 5-FU-induceret IKK aktivering blev immunkompleks kinaseassays udført. IKK-komplekset blev immunopræcipiteret fra helcellelysater med antistoffer mod IKK-α og IKK-β og efterfølgende inkuberet med protein A /G-agaroseperler (Pierce, Tyskland). Efter 2 timers inkubation blev kuglerne vasket med lyseringspuffer og resuspenderet i et kinaseassay opløsning indeholdende 50 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM MgCl2, 2 mM dithiothreitol, 10 uM umærket ATP og 2 mg IKK substrat GST-kBa ( aminosyre 1-54) og inkuberet ved 30 ° C i 30 minutter. Dette blev efterfulgt af kogning i SDS-PAGE-prøvebuffer i 5 minutter. Proteiner blev separeret under anvendelse af SDS-PAGE under reducerende betingelser som beskrevet ovenfor. Phosphorylering af GST-kBa blev vurderet ved anvendelse af et specifikt antistof mod phospho-specifik kBa (Ser 32/36). For at demonstrere den samlede mængde af IKK-α og IKK-β i hver prøve, blev hel-celleproteiner separeret under anvendelse af SDS-PAGE under reducerende betingelser som beskrevet ovenfor. Påvisning af IKK-α og IKK-β udførtes ved immunoblotting med enten anti-IKK-a eller anti-IKK-β-antistoffer.

Statistisk analyse

Numeriske data er udtrykt som middelværdier ( +/- SD) for en repræsentativt eksperiment udført tre gange. Organerne blev sammenlignet ved anvendelse t-test under forudsætning af ens varianser. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant, hvis p-værdien var mindre end 0,05.

Resultater Salg

Denne undersøgelse blev designet til at undersøge, hvordan curcumin hæmmer proliferation af CRC-celler og potentierer virkningerne af kemoterapeutisk middel 5-FU i en

in vitro

model af humane CRC-celler. Derudover undersøgte vi mekanisme (r), hvorved curcumin øger anti-proliferative virkninger af 5-FU, især om virkningerne på NF-KB og Src aktivering, NF-KB-regulerede genprodukter, og cellevækst i CRC celler. To humane CRC celler (HCT116 og HCT116 + CH3) blev anvendt i denne undersøgelse.

Curcumin sensibiliserer HCT116 og HCT116 + CH3-kolon kræftceller til 5-FU-behandling, der fører til nedsat levedygtighed celle og spredning

virkningerne af 5-FU og /eller curcumin på cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assay i HCT116 og HCT116 + CH3-celler (fig. 1). På grundlag af disse målinger blev IC

50 værdier (50% cellevækst inhiberende koncentrationer) for den enkelte og kombinerede lægemidler på HCT116 og HCT116 + CH3 coloncancer cellelevedygtighed bestemt. Cellerne blev eksponeret for forskellige koncentrationer af curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 og 80 uM) og cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assay som beskrevet i Materialer og metoder (fig 1A . 1C ). Den individuelle IC

50 af curcumin og 5-FU var ca. 20 pM og 5 pM i HCT116-celler og 5 uM og 1 uM i HCT116 + CH3-celler henholdsvis (

s

0,05). Disse resultater antyder, at curcumin og 5-FU har potente anti-proliferative virkninger i CRC-celler, og at disse virkninger er mere udtalt i HCT116 + CH3 end i HCT116 celler

A:. HCT116-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 og 80 uM) i 24 timer og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af MTT-metoden. Koncentrationer af curcumin og 5-FU resulterer i 50% vækstinhibering blev angivet som individuelle IC

50 værdier. B: HCT116-celler blev forbehandlet med curcumin (5 uM i 4 timer), derefter udsat for 5-FU i forskellige koncentrationer (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 og 5 uM) i 24 timer og vurderet ved MTT-assay. IC

50 for 5-FU i kombinationsbehandling blev bestemt ved 50% vækstinhibering af HCT116 celler. De samme forsøg er vist i (A) og (B) blev udført på HCT116 + CH3-celler. IC

50 værdier for enkelt (C) og kombinationsbehandling (D) blev beregnet på grundlag af MTT målinger. Resultaterne er angivet som middelværdier med standardafvigelser fra mindst tre uafhængige forsøg. Værdier blev sammenlignet med kontrolgruppen og statistisk signifikante værdier med p. 0,05

For at undersøge effekten af ​​en kombineret behandling af curcumin og 5-FU, HCT116 eller HCT116 + CH3-celler blev forbehandlet med 5 uM curcumin i 4 timer og derefter co-behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 og 5 uM) i 24 timer (fig 1B . 1D). MTT-assayet blev udført, og IC

50 værdier blev bestemt. Interessant, forbehandling med 5 uM curcumin reducerede IC

50 værdier for 5-FU til 1 uM i HCT116 og 0,1 uM i HCT116 + CH3 (

s

0,05) celler. Disse resultater indikerer, at celler forbehandlet med curcumin var mere følsomme over for 5-FU end celler behandlet med 5-FU alene og indførelsen af ​​kromosom 3 i HCT116-celler viste en øget følsomhed af cellerne til behandling med 5-FU og /eller curcumin sammenlignet med HCT116 vildtype.

kombinationen effekt af curcumin og 5-FU på apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3-celler

for at bestemme om den inhiberende virkning af curcumin og 5-FU på cellelevedygtighed og cellevækst er relateret til induktion af apoptose, HCT116 og HCT116 + CH3-celler blev farvet med Hoechst 33258 (DAPI). Denne fluorescens-baserede farvning metode afslører apoptotiske legemer indeholdende nukleare fragmentering og chromatinkondensering i apoptotiske celler. HCT116 og HCT116 + CH3-celler blev udsat for forskellige koncentrationer af curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) eller en kombination af curcumin (5 uM) og 5-FU (0,1, 1, 2 og 3 uM). Anvendt koncentrationer blev beregnet fra IC

50-værdier på curcumin og 5-FU bestemt ved MTT-assays. Som vist i fig. 2, antallet af apoptotiske kerner blev markant forøget i celler af kombinationen behandlingsgruppe. Dette bekræftede resultaterne i fig. 1B 1D og afslørede, at curcumin sensibiliserer HCT116 colon cancerceller for 5-FU-induceret apoptose. Endvidere genoprettelse af hMLH1 aktivitet i HCT116 celler, ved indføring af kromosom 3, var forbundet med en øget følsomhed over for 5-FU og 5-FU-induceret apoptose.

HCT116 og HCT116 + CH3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) eller en kombination af curcumin (5 uM) og 5-FU (0,1, 1, 2 og 3 uM) i 24 timer. Monolagskulturer blev farvet med Hoechst 33258 (DAPI) at afsløre apoptotiske ændringer i cellekerner.

Curcumin øger 5-FU-inducerede mitokondrie ændringer og apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3-celler

Som vist i fig. 3, HCT116 coloncancer-celler blev behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) eller en kombination af begge (curcumin 5 uM og 5-FU 1 uM) i 12, 24, 36, 48, 60 og 72 t. Levedygtighed og morfologiske ændringer af cellerne blev bestemt ved ultrastrukturel undersøgelse med transmissionselektronmikroskopi. HCT116 tyktarmskræft celler i kontrolkulturer udviste en afrundet /sfærisk morfologi med små cytoplasmatiske processer, store kerner (for det meste euchromatic) med tydelig nucleoli og en velorganiseret cytoplasma under hele behandlingen varighed (Figur 3, Kontrol:. A-F). Behandling af HCT116 kulturer med curcumin eller 5-FU alene op til 36 timer resulterede i degenerative ændringer, såsom fremkomsten af ​​flere vakuoler, hævelse af mitokondrier og ru ER og degeneration af andre cellulære organeller (fig. 3, 5-FU, Cur : A-C). Længere inkubationsperioder med curcumin eller 5-FU (60 og 72 timer) resulterede i mere cellulær degeneration. Dette omfattede områder af kondenseret heterochromatin i cellekerner og flere, autophagic cytoplasmatiske vakuoler; cellerne blev apoptotiske (figur 3, 5-FU:. F, Cur: E-F). Forbehandling af HCT116 kulturer med curcumin (5 uM) i 4 timer, efterfulgt af co-behandling med 5-FU (1 uM) i samme periode viste en stærk virkning. Omfattende morfologiske degenerative funktioner, mitokondriel opsvulmen og apoptose blev fundet så tidligt som 36 timer i HCT116-celler og fortsatte med at akkumulere indtil 72 timer (figur 3, Cur + 5-FU HCT116:. C). I sammenligning med HCT116 celler blev undersøgelser også udført på HCT116 + CH3-celler behandlet med en kombination af 5 pM curcumin og 0,1 uM 5-FU. Her var disse virkninger endnu mere fremtrædende og apoptotiske celler blev allerede opdaget efter 12 timers behandling (figur 3, Cur + 5-FU HCT116 + CH3:. A). Disse resultater bekræftede, at følsomheden over for 5-FU blev styrket ved forbehandling med curcumin og at dette blev forværret i HCT116 + CH3-celler.

HCT116-celler blev behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) eller en kombination af begge (5 uM curcumin og 1 pM 5-FU) for 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer. Anvendes en anden fremgangsmåde HCT116 + CH3-celler blev behandlet med en kombination af 5 pM curcumin og 0,1 uM 5-FU i 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer. Ultratynde snit blev fremstillet og evalueret ved transmissionselektronmikroskopi. Mikrografer viste er repræsentative for alle kulturer evalueret. På det tidligste tidspunkt, hvor apoptose blev først opdaget billeder er fremhævet pile. Mitokondrielle forandringer (pilespidser) er vist. Forstørrelse: X5000, bar = 1 um

Kvantificering og statistisk vurdering af ultrastrukturelle data klart fremhævede de tidsafhængige virkninger af curcumin og /eller 5-FU behandling på mitokondrie ændringer (MC) og apoptose. i HCT116 og HCT116 + CH3-celler. Som vist i fig. 4A B, mere end 50% af cellerne udviste MC eller apoptotiske funktioner ved 24 timer inkubationstid i kombinationseksperimenter med HCT116-celler og på 12 timer i kombinationen eksperimenter med HCT116 + CH3-celler (

s

0,05) . Igen tyder dette på, at curcumin sensibiliserer HCT116 og HCT116 + CH3-celler til 5-FU-induceret apoptose. Resultaterne viser, at en meget lav mængde af 5-FU (0.1 uM) kræves for at undertrykke cellernes levedygtighed, når de kombineres til en moderat dosis af curcumin (5 uM). Desuden disse resultater bekræfter, at indførelsen af ​​kromosom 3 i HCT116 celler øger følsomheden af ​​cellerne til behandling med 5-FU og /eller curcumin i forhold til de HCT116 celler.

For at kvantificere de ultrastrukturelle resultater, HCT116 (A) og HCT116 + CH3 (B) kulturer behandlet som beskrevet i fig. 3 blev undersøgt for apoptotiske og mitokondrielle forandringer (MC) ved at tælle 100 celler fra 20 mikroskopiske felter. Undersøgelsen blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne er givet som middelværdier med standard afvigelser SD (

s

0,05). Fra tre uafhængige forsøg

Virkninger af curcumin og /eller 5-FU på cellecyklus og apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3-celler

for at undersøge de mekanismer, som curcumin og /eller 5-FU hæmmer udbredelsen af ​​HCT116 og HCT116 + CH3-celler, vi undersøgt og sammenlignet deres effekt på vækstraten hæmning og niveauet af apoptose. Vi bestemte derfor opførslen af ​​disse to CRC celler i de forskellige faser af cellecyklussen ved flow cytometrisk analyse (fig. 5A /B). HCT116-celler blev behandlet med 20 pM curcumin eller 5 uM 5-FU eller deres kombination (5 pM curcumin og 1 pM 5-FU) for 12 og 24 timer. I et uafhængigt eksperiment blev HCT116 + CH3-celler behandlet med 5 pM curcumin eller 1 pM 5-FU eller deres kombination (5 pM curcumin og 0,1 uM 5-FU) for 12 og 24 timer. Behandlede celler blev høstet og bearbejdet til flowcytometrisk analyse. Den mest markante virkning i både single og kombineret behandling var en tids- og koncentrationsafhængig reduktion af celler i G1-fasen og akkumulering af celler i S-fasen af ​​cellens cyklus. Denne effekt var endnu mere udtalt i HCT116 + CH3-celler end i HCT116 celler. Efter 12 timer behandlingen, hvilket var det tidligste tidspunkt undersøgte vi virkningerne af curcumin og /eller 5-FU på cellecyklussen var allerede meget tydelig. Udover ændringerne i G1 og S-fasefordeling, blev antallet af celler, som undergår apoptose markant forhøjet med behandling. Interessant, effekten af ​​kombinationsbehandlingen klart oversteg af de enkelte behandlinger. Ved 24 h behandling, indflydelsen på cellecyklussen blev generelt mere udtalt i begge colon cancerceller, men var endnu mere tydelig i HCT116 + CH3-celler end i HCT116 celler. Som vist i fig. Som vist i fig.