PLoS ONE: Anti-Cancer Drugs fremkalder Re-ekspression af UDP-glucuronosyltransferaser i melanom Cells

Abstrakt

UDP-glucuronosyltransferase (UGT) familie af enzymer spiller en afgørende rolle i afgiftning af kræftfremkaldende stoffer samt clearance af anti-cancer medicin. Hos mennesker har 19 UGT familiemedlemmer blevet identificeret og er udtrykt på en vævsspecifik måde i hele kroppen. Imidlertid UGT’er er ikke tidligere blevet karakteriseret i melanocytter eller melanom. I den foreliggende undersøgelse blev UGT2B7, UGT2B10, og UGT2B15 identificeres som værende normalt udtrykkes i humane melanocytter. De samme tre UGT familiemedlemmer blev også til udtryk i den primære melanom cellelinie WM115. Ingen UGT ekspression blev detekteret i et andet primært melanom cellelinie, WM3211 eller i nogen metastatisk melanom cellelinie undersøgt. Disse resultater antyder, UGT ekspression går tabt under melanom progression. Behandling af WM3211 eller metastatisk melanom cellelinjer med anticancer-midler (herunder vemurafenib) induceret ekspression af UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 demonstrerer, at melanom celler bevarer evnen til at re-udtrykke disse samme tre UGT’er. Den tilsvarende stigning i glucuronidering aktivitet i melanomceller efter anti-cancer-behandling blev også observeret. Endvidere knockdown af UGT2B7 i WM115 celler sensibiliserede disse celler til behandling af adriamycin og epirubicin indikerer, at UGT2B7 er involveret i resistens over for disse lægemidler. Imidlertid knockdown af UGT2B7 havde ingen virkning på temozolomid toksicitet. Taget sammen viser disse resultater klart en rolle for UGT’er i melanom ætiologi. Da de UGT’er er lægemiddelmetabolisme enzymer, foreslår vi, at re-udtryk for UGT’er udgør en hidtil upåagtede mekanisme til intratumoral resistens i melanom

Henvisning:. Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) kræftmedicin fremkalder Re-ekspression af UDP-glucuronosyltransferaser i melanomaceller. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10,1371 /journal.pone.0047696

Redaktør: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 16. juli 2012; Accepteret: September 17, 2012; Udgivet: 22 oktober, 2012 |

Copyright: © Dellinger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af generøs støtte fra Oxnard og Waltmar Foundations samt tilskud fra National Institutes of Health National cancer Institute [P30CA62330] til FLM og en kræft biologi træning tilskud [T32CA009054] ydet støtte til RWD løn for dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

UGT familie af enzymer katalyserer glukuronidering af en bred vifte af miljøfremmede og endogene forbindelser. UGT’er konjugere en glucuronsyre del til deres substrater, ændring af de biologiske egenskaber af substratet og forbedre dens udskillelse i urinen eller galden [1], [2]. Generelt glukuronidering konverterer substrater i mindre bioaktive, flere vandopløselige produkter, der letter deres fjernelse fra kroppen. På denne måde de UGT’er er integralt involveret i afgiftning af mange kræftfremkaldende stoffer, clearance for lægemidler og metabolismen af ​​en række endogene substrater, såsom bilirubin, steroidhormoner og bioaktive lipider [1], [2]. Der er 19 funktionelle humane UGT’er klassificeret i tre underfamilier baseret på strukturelle og aminosyresekvenshomologi, UGT1A, UGT2A og UGT2B [2].

UGT’er er membranbundne enzymer hovedsagelig lokaliseret til det endoplasmatiske reticulum [1], [3]. Substratspecificitet varierer meget mellem familiemedlemmer, med bred overlapning, og deres substratspecificitet kan ændres ved posttranslationelle modifikationer såsom phosphorylering [4]. Selvom UGT’er primært udtrykkes i leveren, de spiller også afgørende roller i andre væv i kroppen. For eksempel er UGT2B15 og UGT2B17 udtrykt i prostata, hvor de regulerer lokale androgen niveauer gennem glucuronidering [5] og UGT1A10 og UGT2B7 udtrykkes i brystet, hvor de regulerer østrogener [6]. Der er også rigelig dokumentation for, at UGT’er spiller vigtige roller i aerodigestive tarmkanalen, mave-tarmkanalen, lunge, tyktarm, blære, nyrer og hjerne [7], [8], [9], [10], [11]. Men den rolle UGT’er i huden, det største organ i kroppen, er endnu ikke undersøgt.

melanom er en af ​​de hurtigst voksende tumor typer i USA, og antallet af tilfælde på verdensplan er fordoblet i de seneste 30 år [12]. Melanom, som opstår fra melanocytter, er en meget aggressiv tumor, der invaderer vaskulære og lymfesystemet til at danne tumorer andre steder i kroppen [12], [13], [14]. Melanom er en særlig robust kræft, der tegner sig for kun 4% af alle hudkræft, men for 80% af alle dødsfald hudkræft [15]. Yderligere, kun 14% af patienter med metastatisk melanom overleve i 5 år [15].

systemisk terapi tilgange har opnået minimal succes mod metastatisk melanom resulterer i kun få FDA-godkendte behandlinger [16]. Interferon-a2b, interleukin-2 og temozolomid har alle vist, begrænset effekt med responsrater generelt under 15% på kort sigt med nogen klar effekt på melanom dødelighed [16]. Men den seneste succes af den specifikke BRAF mutant inhibitor vemurafenib i et klinisk fase 1 spor er meget lovende [17]. En estimeret progressionsfri overlevelse af 7 måneder blev rapporteret blandt alle patienter, der huser BRAF V600E mutation [17], som er til stede i ca. 50% af alle melanomer [18]. Imidlertid har begejstring for vemurafenib som enkeltstof dæmpet noget siden er allerede observeret erhvervet resistens [17]. Således at forstå mekanismen (r) af resistens over for kemoterapi, melanom celler ansætte er altafgørende at bekæmpe denne dødelige sygdom.

Målet med dette studie var at karakterisere udtryk og funktion UGT’er i melanocytter og melanom og at undersøge potentielle rolle UGT’er i lægemiddelresistens. Beviser præsenteres her afslører tre UGT familiemedlemmer, UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15, som værende normalt udtrykt i humane melanocytter isoleret fra neonatale forhud. De samme tre UGT’er viste sig at blive udtrykt i den primære melanom cellelinie WM115. Interessant nok blev der ikke UGT ekspression observeret i et andet primært melanom cellelinie, WM3211, eller i nogen af ​​de tre metastatiske melanomcellelinier undersøgte linier, hvilket antyder, at UGT ekspression går tabt under melanom progression. Men behandling af melanomceller med anti-cancer stoffer medfører fornyet ekspression af disse samme tre UGT’er. Denne roman re-udtryk for UGT’er i melanom undersøges yderligere heri.

Materialer og metoder

Reagenser og Cell Culture

Temozolomide, adriamycin, epirubicin og alamethicin blev opnået fra Sigma . Vemurafenib blev købt fra Selleck (Houston, TX). Normale humane melanocytter blev isoleret fra de-identificeret nyfødte forhuden fra omskæring kirurgi i overensstemmelse med en protokol godkendt af UC Irvine interne Review Board. I overensstemmelse med denne godkendt protokol er der ingen rekruttering af forsøgspersoner, der kun kasseres omskåret væv opsamlet. Ingen identificere oplysninger indsamles om dette væv, der ellers ville blive kasseret. Melanocytter blev isoleret som tidligere beskrevet [19], [20] og dyrket i MCDB153 medium suppleret med 2% føtalt bovint serum, 10 ng /ml 12-O-tetradecanoylphobol-13-acetat og 0,15% bovin hypofyse. De melanom cellelinier WM115, WM3211, Lu1205, SKmel28 og A375 blev dyrket som tidligere beskrevet [21], [22], [23]. Kun WM3211 har WT B-Raf, alle andre havnen V600E mutationer. Alle cellelinier blev testet negative for mycoplasma.

Total RNA Isolation, revers transkription og PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af Arum total RNA mini kit (BioRad) ifølge selskabers protokol. RNA blev kvantificeret under anvendelse af en NanoDrop 1000 (Thermo /Fisher) cDNA blev derefter foretaget fra 1,0 ug RNA under anvendelse af revers transkriptase iScript Kit (BioRad) i overensstemmelse med standardprotokoller. PCR blev derefter udført under anvendelse af en Quick belastning Taq (2X) Master Mix (New England Biolabs) og kørt på en Applied Biosystems GeneAmp System 2700 thermocycler anvendelse af den følgende protokol: Trin 1 = 94 ° C i 5 minutter; Trin 2 (40 cyklusser) = 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 68 ° C i 1 min; Trin 3 = 68 ° C i 10 min. Tabel S1 i supplerende data viser de anvendte primere til at forstærke enkelte UGT familiemedlemmer.

Real-Time PCR

At analysere UGT mRNA-ekspressionsniveauer i melanomaceller real-time PCR blev udført som tidligere beskrevet [3], [24]. Kort fortalt præ-konstruerede TaqMan Gene Expression Assays [Applied Biosystems (ID’er Hs02383831_s1 for UGT2B4; Hs00426592_m1 for UGT2B7; Hs02556282_s1 for UGT2B10; Hs03008769_g1 for UGT2B15 og Hs99999905_m1 for GAPDH)] blev anvendt i overensstemmelse med producentens protokol. Real-time PCR blev udført ved anvendelse af et samlet volumen på 20 pi indeholdende 50 ng cDNA ved anvendelse GAPDH som normaliserende ‘housekeeping’ gen. Real-time PCR blev udført på en CFX96 Real-Time PCR maskine (BioRad). Rapporterede mRNA ekspression værdier er gennemsnittet af mindst 3 uafhængige forsøg med standardafvigelse.

shRNA

Ready-klonet shRNA målrettet mod UGT2B7 og styre tomme ekspressionsvektorer blev købt Origene. Hver shRNA vektor blev transficeret i WM115 celler under anvendelse Biot transfektion middel (Bioland Scientific) ifølge producentens protokoller og stabil ekspression blev udvalgt til ved tilsætning af puromycin (Invivogen).

MTT assay

Sådan bestemme virkningerne af lægemidler på celleproliferation udførte vi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assays (Sigma Aldrich). Kort fortalt, blev cellerne udpladet natten over ved 2000-4000 celler /brønd (afhængig celle fordoblingstider) i plader med 96 brønde, og behandlet med enten adriamycin, epirubicin eller temozolomid ved serielle fortyndinger af lægemidlet. Efter den tredje dag efter behandling, er MTT fortyndet i farvestof-frie medier tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer. Når MTT metaboliseres ved aktivt prolifererende celler i vand uopløselige formazen derefter, er dimethylsulfoxid (Sigma Aldrich) tilsat, og kolorimetriske ændringer analyseres og kvantificeres med et spektrofotometer ved 590 nm. Resultater fra MTT’er blev analyseret ved anvendelse af Graphpad Prism hvor doseringen af ​​lægemidlet versus dens virkning på proliferation er tegnet; en ikke-lineær regression kurve under anvendelse af sigmoidale dosis-respons ligning blev monteret på grafen og halvmaksimal inhiberende koncentration opnås (IC

50). Rapporterede IC

50 værdier er gennemsnittet af mindst 3 uafhængige forsøg med standardafvigelse.

UGT Activity Assay

UGT aktivitet blev undersøgt ved hjælp af UGT-Glo assay (Promega) i henhold til producentens protokoller. Cellehomogenater blev fremstillet ved at resuspendere pelleterede celler i Tris-saltvand (25 mM Tris-base, 138 mM NaCl og 2,7 mM KCI; pH 7,4) og underkaste dem tre runder af fryse-tø før homogenisering ved anvendelse af en glas dounce homogenisator . Cellehomogenater (5-20 mg protein /ml) blev opbevaret ved -70 ° C i 100 pi prøver. Total cellehomogenat Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af BCA-assayet fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL) efter proteinekstraktion anvendelse af standard protokoller. Humane levermikrosomer (Xenotech, Lenexa, KS) blev anvendt som en positiv kontrol. Homogenater blev inkuberet med Alamethicin i 10 minutter på is. Hver reaktion bestod af 50 ug homogenat, UGT-Glo puffer, 50 pM UGT multienzymkoblede Substrat og vand til i alt 30 fil. Derefter enten 10 pi vand eller 10 pi 16 mM UDPGA (slutkoncentration 4 mM) blev tilsat. Hver af disse reaktioner blev udført tre gange (i alt 6 reaktioner for hver homogenat). Reaktioner blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 90 min. Kun reaktioner med co-substrat UDPGA tilføjede kan glucuronidate substrat. Efter 90 minutter sættes 40 pi Luciferin Detection Reagent plus D-cystein tilsat til alle brønde og det luminescerende signal tillades at stabilisere sig ved stuetemperatur i 20 minutter. Plate blev så læs videre et luminometer (Turner Biosystems modul mikroplade). Som en negativ kontrol ét sæt af seks reaktioner blev udført uden nogen UGT’er stede. Den UGT multienzymkoblede Substrat vil generere luminescens, men glucuronideret UGT multienzymkoblede substrat vil ikke. Således er gennemsnittet af de tredobbelte reaktioner med co-substrat UDPGA subtraheret fra gennemsnittet af de tredobbelte reaktioner uden UDPGA at bestemme UGT aktivitet. Grafer er sammensat af flere uafhængige forsøg med standardafvigelse.

Resultater

UGT Expression i Human Melanocytter og melanom

Mens UGT udtryk tidligere er blevet rapporteret i huden [25 ], UGT udtryk i melanocytter ikke var blevet specifikt. I den foreliggende undersøgelse blev humane melanocytter isoleret fra de identificerede neonatale forhud analyseret for UGT ekspression med RT-PCR. Primersæt designet til individuel UGT2B familiemedlemmer blev anvendt såvel som et fælles primersæt til at detektere enhver UGT1A familiemedlem. De UGT2As blev ikke målt, da de i høj grad findes i lugtesystemet [26]. Som vist i figur 1A, UGT2B7 blev UGT2B10 og UGT2B15 sig at blive udtrykt i humane melanocytter. PCR-produkterne angivet med sorte pile (figur 1A) løb på de forudsagte størrelser, blev udskåret og individuelle UGT sekvenser blev bekræftet. Bandet i UGT2B4 lane (figur 1A, bane 1) blev også skåret ud og fast besluttet på at blive UGT2B7 ved sekventering. Dette er ikke så overraskende, da UGT2B familiemedlemmer deler høj homologi. Faktisk UGT2B4 og UGT2B7 deler mere end 90% identitet på DNA-niveauet og strategier for specifikke primere er vanskelig. Som kontrol blev RT-PCR udført med lever-RNA for at demonstrere, at de UGT primere sæt var funktionelle og show forudsagt størrelser for hver UGT amplikon (figur 1B). Ekspression af disse samme tre UGT familiemedlemmer blev også observeret i humane melanocytter fra en anden de identificerede neonatal forhud (tabel 1; bemærke, at tallene 322 og 423 blot angiver dato forhuden blev opnået fra kaukasiske spædbørn). Dernæst blev UGT ekspression undersøgt i flere primære og metastatiske melanomcellelinier ved RT-PCR. I overensstemmelse med den UGT ekspressionsmønster observeret i melanocytter, den primære melanomacellelinie WM115 udviste kun UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 ekspression (figur 1C). På grund af den høje homologi mellem familiemedlemmer, og svarende til fig 1A blev »UGT2B4 ‘band i figur 1C bestemt til at være UGT2B7 efter DNA-sekventering. Desuden blev det øvre bånd i UGT1A lane udskåret og sekventeret (selvom det var mindre end forventet størrelse) og blev bestemt ikke at være nogen UGT familiemedlem. Ingen UGT ekspression blev observeret i en anden primær melanom cellelinie, WM3211 (figur 1 D), eller i nogen af ​​de tre metastatiske melanomcellelinier undersøgte linier (opsummeret i tabel 1; afbildet i fig S1). Disse resultater antydede, at UGT ekspression går tabt under melanom progression.

(A) RT-PCR-analyse af totalt RNA fra humane melanocytter for UGT familiemedlemmer. Primersæt for UGT2Bs blev designet til at være specifikke for hver isoform mens en enkelt primersæt rettet mod den fælles region af alle UGT1As anvendtes til påvisning UGT1A ekspression. Totalt RNA fra human lever blev anvendt som kontrol med UGT2B7 primere. Pile viser DNA-bånd af den forventede størrelse, hvis sekvens blev bekræftet. (B) Styring RT-PCR-analyse af totalt RNA fra lever under anvendelse angivne primere sæt. (C) RT-PCR-analyse af totalt RNA fra den humane melanoma cellelinie WM115 hjælp angivne primere sæt. Pile indikerer bånd, der blev udskåret og sekventeret. Bånd i UGT2B4 lane viste sig at være UGT2B7 ved sekventering mens UGT2B10 og UGT2B15 bånd blev bekræftet at forventes UGT’er. (D) RT-PCR-analyse af totalt RNA fra den humane melanoma cellelinie WM3211. GAPDH blev anvendt som en positiv kontrol her at sikre cDNA kvalitet. (E) Real-time PCR ved hjælp TaqMan analyser mod angivne UGT’er. ND = ikke påvist.

For at forbedre følsomheden og specificiteten af ​​UGT mRNA afsløring, TaqMan genekspression assays blev anvendt til resten af ​​denne rapport. Disse assays er blevet optimeret til at være specifikke for individuelle UGT’er anvendelse af en probe og en primer sæt. For at illustrere dette punkt, og igen at bekræfte, at UGT2B7 er til stede i melanocytter i modsætning til UGT2B4 blev real-time PCR under anvendelse TagMan assays udført på melanocyt cDNA. Figur 1E viser klart, at UGT2B7 faktisk udtrykkes i humane melanocytter og UGT2B4 blev ikke påvist.

Re-ekspressionen af ​​UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 i melanom i Reaktion på kræftmedicin

betragtning af, at de UGT’er er fase II metabolisme enzymer og en af ​​deres vigtigste funktioner systematisk er at fjerne stoffer, undersøgte vi, om UGT’er kan spille en rolle i iboende modstand af melanomceller til kemoterapeutiske midler. Således blev melanoma cellelinien WM3211 behandlet med forskellige anti-cancermidler og UGT ekspression blev analyseret ved real-time PCR. WM3211 blev valgt til disse eksperimenter, da det ikke har nogen påviselig UGT ekspression som bestemt ved RT-PCR (figur 1D).

Først behandlede vi WM3211 celler med temozolomid, som i øjeblikket indiceret til behandling af metastatisk melanom. En dosis på 100 uM blev valgt til dette eksperiment, da offentliggjorte rapporter for temozolomid behandling af cellekultur almindeligt brug mindst 100 pM [27], [28]. Som vist i figur 2a, UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 blev re-udtrykt i WM3211 celler som reaktion på temozolomid. Interessant nok blev der ikke UGT’er inducerede (data ikke vist), kun de tre UGT familiemedlemmer, der normalt udtrykkes i melanocytter (tabel 1). Induktionen af ​​UGT ekspression i respons på temozolomid optrådt på en tidsafhængig måde med maksimal ekspression toppede på 8 timer efter behandling (figur 2A). For alle tre UGT’er deres ekspression falder efter 8 timer, men deres ekspression stadig forhøjet 24 timer efter behandling (figur 2A).

forhåndsudformede Taqman genekspression assays blev anvendt til at visualisere individuel UGT ekspression ved realtids-PCR efter behandling af WM3211 celler med (A) 100 uM temozolomid, (B) 1,0 uM adriamycin eller (C) 0,1 uM epirubicin. I alle tilfælde blev UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 ekspression undersøgt for det angivne anticancermiddel ved 0, 8, 16 og 24 timer efter behandlingen. * Angiver anden skala for y-aksen.

For at belyse, om re-ekspressionen af ​​disse tre UGT familiemedlemmer var specifik for temozolomid eller hvis dette observerede respons kan være en generel ordning for melanom at forsvare sig mod kemoterapeutika blev de anti-cancer agenter adriamycin og epirubicin også undersøgt. Disse to forbindelser blev valgt, da de er nært beslægtede anthracycliner, der almindeligvis anvendes til behandling af forskellige typer af faste tumorer, selv melanom har vist sig at være resistente [29], [30]. Endvidere er epirubicin kendt for at være primært metaboliseres af UGT2B7 [31], mens metabolismen af ​​adriamycin er meget mere kompleks og involverer flere forskellige fase II-enzymer (herunder UGT’er) og ABC transportører [30]. WM3211 melanomceller var enten ubehandlet eller behandlet med 0,1, 1,0 eller 10 uM adriamycin (figur S2A) eller epirubicin (fig S2B) og UGT ekspression blev undersøgt ved realtids-PCR efter 8 timer. I begge tilfælde UGT2B7, blev der observeret UGT2B10 og UGT2B15 at være re-udtrykkes. Svarende til temozolomid, ingen andre UGT familiemedlem blev induceret (data ikke vist). Tidsforløb undersøger UGT ekspression efter behandling af WM3211 celler med 1,0 pM adriamycin (figur 2B) eller 0,1 uM epirubicin (figur 2C) blev derefter udført. I begge tilfælde UGT2B7 er UGT2B10 og UGT2B15 induceret i en tidsafhængig måde, med det højeste udtryk observeret ved 24 timer.

Re-ekspressionen af ​​UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 i metastatisk melanom celler som respons på epirubicin og Vemurafenib

for at sikre, at den observerede induktion af UGT-enzymer ikke var begrænset til WM3211 celler blev to metastatisk melanom cellelinier (SKmel28 og A375) undersøgt for induktion af UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 som reaktion på epirubicin. Tidsforløb undersøger UGT ekspression efter behandling af SKmel28 (figur 3A) eller A375 (figur S3) med 0,1 uM epirubicin blev derefter udført. Igen, induktion af alle 3 UGT’er blev observeret i begge disse metastatiske melanomcellelinier med maksimal ekspression ved 24 Hrs. Da er blevet observeret resistens i kliniske forsøg med lovende nye stof vemurafenib, undersøgte vi, om UGT’er kunne fremkaldes efter vemurafenib behandling. SKmel28 celler, som huser BRAF V600E mutation, blev behandlet med 1 uM vemurafenib, indsamlet efter 0, 8, 16 og 24 timer efter behandling og analyseret for UGT ekspressionsniveauer. Som vist i figur 3B, blev UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 alle induceret som reaktion på vemurafenib.

forhåndsudformede Taqman genekspression assays blev anvendt til at visualisere individuel UGT ekspression ved real-time PCR efter behandling af SKmel28 celler med (A ) epirubicin eller (B) vemurafenib. Tidsforløb for UGT2B ekspression efter epirubicin (100 nM) eller vemurafenib (1 uM) behandling blev undersøgt ved 0, 8, 16 og 24 timer. * Viser anden skala for y-aksen. ND = ikke påvist.

Øget Glukuronidering i melanomaceller Efter Behandling med en anti-cancer Agent

Efter at påvise, at UGT’er kan genbruges udtrykkes i melanom celler efter behandling med anti- cancer, det oplagte spørgsmål var, om UGT aktivitet blev restaureret så godt. Derfor glucuronidering blev undersøgt under anvendelse UGT-Glo Assay i melanomcellelinier, der mangler UGT ekspression og sammenlignet med de samme cellelinjer efter behandling med epirubicin. Dette assay anvender et UGT multienzymkoblede substrat, som reagerer med luciferin påvisningsreagenset at give lys, der kan kvantificeres på et luminometer. Men hvis substratet er glukoronideret så vil det ikke længere reagere med luciferin påvisningsreagenset til at give lys. Således er to reaktioner sat op per prøve, en med co-substrat UDPGA og den anden uden. Kun reaktionen med UDPGA vil producere glucuronideret substrat hvis UGT’er er til stede og aktive. På denne måde den samlede UGT aktivitet for prøven kan kvantificeres ved forskellen i udsendte lys mellem de to reaktioner.

Først de primære melanom WM3211 celler blev undersøgt for UGT aktivitet. Celler blev enten efterladt ubehandlede (FN) eller behandlet med epirubicin ved angivne koncentrationer. Celler blev høstet 24 timer senere og analyseret for UGT aktivitet. Som vist i figur 4A, blev UGT aktivitet øges som reaktion på epirubicinbehandling sammenlignet med ubehandlede celler. Interessant var der nogle basale glucuronidation aktivitet i de ubehandlede WM3211 celler indikerer, at UGT’er udtrykkes i denne cellelinje, men på et niveau under detektering af vores RT-PCR forsøg (figur 1D). Humane levermikrosomer blev anvendt som en positiv kontrol, da de har meget høje koncentrationer af UGT’er og der var ingen Homogenatet stede i den negative kontrol til beregningen for hver baggrundssignal. Lignende resultater blev observeret, når dette forsøg blev gentaget i to metastatiske melanomceller linjer, SKmel28 (figur 4B) og A375 (figur 4C). I begge disse cellelinjer UGT aktivitet blev dramatisk forøget efter behandling med epirubicin. I modsætning til WM3211 celler, hverken metastatisk cellelinie udviste UGT aktivitet i fravær af behandling. Igen humane levermikrosomer blev anvendt som en positiv kontrol og den negative kontrol manglede cellehomogenat

Glukuronidering aktivitet blev undersøgt af UGT-Glo Assay ved anvendelse af 50 ug af homogenat pr reaktion i tre melanomcellelinier.; (A) WM3211 (B) SKmel28 og (C) A375 uden behandling og sammenlignet med behandling med epirubicin (EPI) i de angivne koncentrationer i 24 timer. (-) Angiver en negativ kontrol, hvor der ikke homogenat var til stede. (+) Angiver anvendelse af humane levermikrosomer (kendt for at have høje koncentrationer af næsten alle UGT familiemedlemmer) som en positiv kontrol.

UGT2B7 Knockdown sensibiliserer WM115 melanomaceller til kræftmedicin

for at sikre den funktionelle bidrag glukuronidering til melanom modstand, blev UGT2B7 slået ned i WM115 celler. shRNA rettet mod UGT2B7 blev stabilt transficeret ind WM115 celler. Denne cellelinje blev opkaldt WM115-2B7KD. Real-time PCR blev dernæst udført for at bekræfte, at UGT2B7 mRNA-niveauer var blevet reduceret. Figur 5A viser tydeligt, at UGT2B7 mRNA-niveauer i WM115-2B7KD cellelinie var -60% mindre end den af ​​WM115 celler stabilt transficeret med tom vektor (WM115-PRS). Dernæst halvmaksimal hæmning koncentrationer (IC

50) som bestemt ved MTT-assays blev udført for at undersøge om knockdown af UGT2B7 sensibiliserede WM115 celler til anti-cancerbehandling. IC

50 værdier for WM115-2B7KD blev bestemt og sammenlignet med WM115-Prs (stabil cellelinie lavet med tom vektor som kontrol) og den parentale cellelinje mod temozolomid, adriamycin og epirubicin. I overensstemmelse med en rolle for glukuronidering i melanom modstand, blev WM115-2B7KD sig at have en signifikant lavere (p 0,01) IC

50 værdi for adriamycin og epirubicin behandling i forhold til både WM115 og WM115-PRS (figur 5B), hvilket indikerer at, ja, knockdown af UGT2B7 sensibiliserer melanom celler til disse anti-cancer medicin. Ingen effekt på IC

50 værdier blev observeret for temozolomid eller vemurafenib behandling på WM115-2B7KD cellelinje i forhold til de to kontrol cellelinjer (figur 5B).

(A) Real-time PCR af UGT2B7 mRNA niveauer sammenligner melanomcellelinier stabilt udtrykker shRNA mod UGT2B7 (WM115-2B7KD) eller tom vektor (WM115-PRS). (B) IC

50 værdier bestemt fra MTT-analyser til vurdering af bidrag UGT2B7 til melanom modstand efter behandling af temozolomid, adriamycin, epirubicin eller vemurafeninb. (C) IC

50 værdier bestemt fra MTT-analyser til vurdering af følsomheden af ​​melanom cellelinjer med (WM115) og uden (WM3211) UGT udtryk for anti-cancer lægemidler, der metaboliseres af UGT’er. Alle data grafer er gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg analyseret af GraphPad Prism. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse og * angiver signifikans p. 0,01 sammenlignet med enten kontrol

Hvis vælte en UGT med -60% sensibiliserede melanom celler til adriamycin og epirubicin så er det indlysende, at den IC

50 for WM3211 melanom celler (som mangler UGT udtryk) ville være væsentligt lavere end WM115 parentale celler (som har UGT udtryk). Således har vi sammenlignet IC

50’erne for WM115 og WM3211 direkte til disse lægemidler. Som forudsagt, WM3211 celler var 7 gange og 9 gange mere følsomme over for adriamycin og epirubicin, (figur 5C).

Diskussion

rolle UGT’er i melanom ætiologi var ikke blevet undersøgt tidligere på trods af de UGT’er bliver en vigtig mekanisme til regnskabsafslutning for anti-cancer. I den foreliggende undersøgelse UGT2B7 blev UGT2B10 og UGT2B15 identificeres som værende normalt udtrykkes i humane melanocytter. De samme tre UGT’er viste sig at blive udtrykt i den primære melanom cellelinie WM115. Der blev imidlertid ikke UGT ekspression detekteres i en anden primær melanom cellelinie, WM3211, eller i nogen af ​​de tre metastatiske melanomcellelinier undersøgte indikerer, at UGT ekspression går tabt under melanom progression. Interessant vi vise, at UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 kan genbruges udtrykkes i melanom celler som reaktion på de anti-cancer. Den tilsvarende stigning i UGT aktivitet blev også demonstreret efter behandling. Således re-udtryk for de UGT’er ville formentlig beskytter kræftceller mod anti-cancer medicin gennem øget metabolisme og efterfølgende clearance. Vigtigt er disse observationer var overensstemmende i begge B-Raf vildtype melanomceller (WM3211) og B-Raf mutante cellelinier (A375 og SKmel28).

Desværre har ingen kommercielt tilgængeligt antistof blevet vist at detektere endogen UGT2B protein og dermed vores forsøg på at visualisere endogent UGT2B protein var forgæves. Dette er mest sandsynligt på grund af det faktum, at UGT’er er membranbundne, uopløselige proteiner. Følgelig har ingen fuld længde human UGT blevet oprenset og /eller krystalliseres. Faktisk er den eneste krystalstruktur rapporteret for et humant UGT er den C-terminale halvdel af UGT2B7 siden den N-terminale halvdel skulle skæres ud for at solubilisere proteinet [32]. Langt størstedelen af ​​offentliggjorte UGT Westerns cellelinier (sædvanligvis insekt), som overudtrykker rekombinante UGT’er. Endvidere viser en nylig rapport klart, at en stor procentdel af disse overeksprimeres, rekombinante UGT’er er inaktive [33]. Man kan nemt forestille sig, at de rekombinante UGT proteiner, der er synlige på westerns er ikke fuldt modne, aktive enzymer. Omvendt kan fuldt modne, aktive UGT’er ikke være synlige på westerns selv når overudtrykt. Således i overensstemmelse med adskillige tidligere publikationer i UGT felt, den nuværende undersøgelse fokuserede på mRNA ekspressionen af ​​de UGT2B familiemedlemmer kombineret med analyse af UGT aktivitet. Vi udnyttede RNA-interferens og glukuronidering analyser for at undersøge hvilken rolle UGT2B7 på melanom celleoverlevelse [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].

for at teste rolle glukuronidering i melanom resistens direkte, blev UGT2B7 slået ned i WM115 celler, den eneste melanomacellelinie vi har identificeret med UGT udtryk hidtil. Knockdown af UGT2B7 sensibiliserede melanomceller til epirubicin og adriamycin behandling, men havde ingen virkning på temozolomid eller vemurafenib behandling. Disse resultater giver bevis for princippet om, at glukuronidering er involveret i modstanden melanom stof

in vitro

. Den mest logiske antagelse er, at UGT2B7 glukuronider epirubicin og adriamycin metabolitter direkte resulterer i clearance før disse stoffer kan udøve deres giftighed. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at epirubicin primært metaboliseres af UGT2B7 [31], og at glucuronideringen også involveret i adriamycin clearance [30]. Den iagttagelse, at toksiciteten af ​​temozolomid og vemurafenib var uændret efter UGT2B7 knockdown var ikke helt uventet, da UGT’er aldrig har været impliceret i metabolismen af ​​disse lægemidler.

Det er vigtigt at bemærke, at blev gjort disse eksperimenter ved hjælp af en UGT2B7 vælte cellelinie, så der stadig var nogle UGT2B7 stede. Desuden UGT2B10 og UGT2B15 er stadig til stede.