PLoS ONE: Methylering af APC og GSTP1 i ikke-neoplastisk væv Støder op til Prostata Tumor og dødelighed fra prostatakræft

Abstrakt

Baggrund

Markører, der kan skelne mellem er brug for indolent og aggressive prostata tumorer. Vi studerede gen methylering i ikke-neoplastisk væv ved siden af ​​prostata tumor (NTAT) i forbindelse med dødelighed af prostatacancer.

Metoder

Fra to kohorter af konsekutive patienter med prostatacancer diagnosticeret på en patologi afdeling i Torino, Italien, valgte vi 157 patienter med tilgængelige NTAT og fulgte dem op i mere end 14 år. Vi opnåede DNA fra NTAT i paraffinindlejrede prostata tumorvæv og anvendte probe realtids-PCR til at analysere methylering af glutathion S-transferase (GSTP1) og adenomatøs polyposis coli (APC) genpromotorer.

Resultater

Udbredelsen af ​​APC og GSTP1 methylering i NTAT var mellem 40 og 45%. Det blev forbundet med methylering i prostata tumorvæv for de samme to gener samt med en høj Gleason score. Den hazard ratio (HR) for dødelighed prostatakræft var 2,38 (95% konfidensinterval: 1,23-4,61) for APC methylering, og 2,92 (1,49-5,74) for GSTP1 methylering i NTAT. Det ændres til 1,91 (1,03-3,56) og 1,60 (0,80-3,19) efter justering for Gleason score og methylering i prostata tumorvæv. Sammenligning af 2 vs. 0 methylerede gener i NTAT afslørede en HR på 4,30 (2,00-9,22), hvilket faldt til 2,40 (1,15-5,01) efter justering. Resultaterne var stærkere i de første 5 år af follow-up (justeret HR: 3,29, 95% CI: 1,27-8,52).

Konklusioner

Ændringer i gen methylering er en tidlig begivenhed i prostata carcinogenese og kan spille en rolle i cancer progression. Gene methylering i NTAT er en mulig prognostisk markør, der skal evalueres i kliniske undersøgelser

Henvisning:. Richiardi L, Fiano V, Grasso C, Zugna D, Delsedime L, Gillio-Tos A, et al. (2013) Methylering af APC og GSTP1 i ikke-neoplastisk væv Støder op til Prostata Tumor og dødelighed fra prostatakræft. PLoS ONE 8 (7): e68162. doi: 10,1371 /journal.pone.0068162

Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA

Modtaget: November 26, 2012; Accepteret: 29 maj 2013; Udgivet: 9 jul 2013

Copyright: © 2013 Richiardi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev delvist støttet af den italienske forening for Cancer Research (AIRC), og regionen Piemonte. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, i indsamling, analyse og fortolkning af data, i skrivning af manuskriptet, og i beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige tumor hos mænd i mange befolkninger, med en rå forekomst af 120-130 pr 10

5 i Europa og USA [1]. Mere end 65% af prostatacancere er diagnosticeret efter 70 år, og de fleste af disse patienter vil dø af konkurrerende begivenheder. Forekomsten af ​​prostatakræft er steget dramatisk siden indførelsen af ​​prostata-specifikt antigen (PSA) test i slutningen af ​​1980’erne [1]. Opportunistisk PSA-screening for prostatakræft er udbredt, selv om dens evne til at sænke dødeligheden stadig debatteres. Konklusionerne af en nylig gennemgang af de amerikanske Forebyggende Services Task Force støttede ikke PSA-screening, da fordelene ikke blev bedømt til at opveje de skader [2].

Den høje forekomst af indolent prostatakræft og brug opportunistisk PSA-screening for prostatakræft kan føre til over-behandling. Der er i øjeblikket ikke enighed om, hvorvidt radikal prostatektomi eller aktiv overvågning bør tilbydes som behandling af valg, især når det kommer til patienter med prostatacancer lav risiko [3], [4]. Det er derfor nødvendigt for bedre at forstå de determinanter for prostatakræft progression, og identificere prognostiske markører for aggressiv prostatakræft, der kan påvises ved en første diagnostisk biopsi. En række grupper, herunder vores, har undersøgt epigenetiske ændringer i prostata tumor væv i et forsøg på at identificere mulige prognostiske markører [5] – [8]. Især har flere undersøgelser evalueret tilstedeværelsen af ​​CpG øen (klynger af dinukleotider af en cytosin og en guanosin) methylering i promotoren for nogle specifikke gener i forbindelse med biokemisk gentagelse eller dødelighed af prostatacancer. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at APC (adenomatøs polypose coli) methylering i prostata tumorvæv var forbundet med en 50% øget risiko for dødelighed af prostatacancer. Et par undersøgelser støtter dette fund [9] – [12], og andre fandt en prognostisk rolle for methylering i andre gener [13], [14]. Methylering af GSTP1 (glutathion-S-transferase) promotor er mest omfattende undersøgt epigenetisk forandring i prostatacancer. Det kan findes i mere end 80% af prostatakræft, med en lavere forekomst i godartet væv [15]; den er stærkt forbundet med Gleason score, men dens prognostiske rolle uafhængig af Gleason score er uklar [5].

I dette papir vi undersøgt, om methylering ændringer i ikke-neoplastisk væv støder op til prostata tumor (NTAT) er forbundet med prostatakræft prognose. Prostatatumorer er ofte multifokale, og en række undersøgelser observerede felt cancerisation (dvs. ændringer i normalt væv støder op til tumor) i prostatacancer. Undersøgelser der sammenligner NTAT med benign prostata væv og /eller kræftvæv identificerede ændringer i genekspression [16] – [20], telomer DNA-indhold [21], mitokondrie-DNA [22], og forekomsten af ​​methylering i nogle gener, herunder APC [23 ], GSTP1 [24], [25] og RARβ2 [23], [24]. Mekanismerne for disse ændringer er ikke klart forstået (enten udvides virkninger af kræftfremkaldende, lateral udvidelse af tumoren, eller indflydelse af tumoren på den tilstødende væv), men felt cancerisation sandsynligvis har klinisk relevans. Men nogle af de tidligere undersøgelser om dette emne omfatter opfølgning for dødelighed, hvilket hæmmer evalueringen af ​​den prognostiske betydning af ændringer i NTAT. Denne undersøgelse fokuserer på methylering af GSTP1 og APC i den ikke-neoplastisk væv. Det tager sigte på at vurdere, om disse molekylære ændringer er potentielle kandidater som prognostiske markører ved at evaluere deres tilknytning til dødelighed af prostatakræft.

Patienter og metoder

Undersøgelse Befolkning

Undersøgelsen er indlejret i to kohorter af i alt 459 konsekutive prostatakræft patienter, som gennemgik biopsi, radikal prostatektomi eller transuretral resektion af prostata (TURP) mellem 1982 og 1988, eller mellem 1993 og 1996, ved patologi afdeling af San Giovanni Battista Hospital, Torino , Italien. Nærmere oplysninger om disse to kohorter er tidligere blevet publiceret [5]. Vi opnåede DNA fra lagrede paraffinindstøbte prostata tumorvæv for alle 459 patienter. DNA blev derefter analyseret for APC, GSTP1 og RUNX3 (Runt-relateret transkriptionsfaktor 3) genet methylering under anvendelse bisulfit modifikation og methylering-specifik PCR [5]. Oplysninger om alder, kilde til prostata tumorvæv, bopæl og tumor klasse var tilgængelige fra patologi rapporter. Alle originale diagnostiske dias svarer til de teknologier, der anvendes til de molekylære analyser blev sporet og re-evalueret af en enkelt uropathologist (LD) for at tildele en ensartet Gleason score i henhold til gældende retningslinjer. Vi havde ikke oplysninger om PSA niveauer eller andre kliniske karakteristika. I første omgang blev de to kohorter fulgt frem til 2007 [5], men for den foreliggende undersøgelse, vi udvidet opfølgningen indtil den 8. august 2010. Vi brugte oplysninger fra dødsattester at klassificere dødsårsagen som enten prostatakræft, eller andre årsager.

Diagnostiske slides fra patienter i de to kohorter blev analyseret for at identificere NTAT. Vi ekskluderede

a-priori

patienter fra 1980’erne, hvis diagnostiske slides inkluderet hovedsageligt neoplastisk væv og var forbundet med betydelige tekniske problemer i at isolere NTAT uden forurening fra prostata tumorvæv. Alle andre væv kilder, nemlig turps (n = 11) og radikale prostatektomi (n = 23) fra 1980’erne, og biopsier (n = 164), turps (n = 45) og radikale prostatektomi (n = 34) fra 1990’erne, blev indbefattet i den foreliggende evaluering. Den uropathologist identificeret og fremhævet ét område af NTAT på hver diagnostisk dias. Områder i prostata intraepitelialneoplasi blev udelukket. Hvis mere end ét område af NTAT var til stede, patologen valgte længst fra tumoren. Hvis der var mere end et område, der mødte dette kriterium, blev det største område valgt. De udvalgte dele af NTAT havde mindst 1,5 mm afstand fra tumorceller, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af epigenetisk felt effekt i prostatakræft [23]. Denne minimale afstand blev opretholdt også når vævet materiale var forholdsvis ringe (dvs. i biopsier); ellers patienten blev udelukket fra undersøgelsen. For objektglas herunder fysisk adskilte vævsfragmenter (97 patienter), som begge NTAT og tumorvæv, in vivo afstanden mellem fragmenterne var ukendt, selv om de fleste sandsynligt det var større end 1,5 mm. For nogle patienter, nogle af objektglassene inkluderet NTAT kun; disse slides blev inkluderet i undersøgelsen.

Ved afslutningen af ​​denne proces, blev NTAT identificeret i 157 patienter, som alle indgik i den foreliggende undersøgelse. Udvælgelsesprocessen fra de oprindelige 459 patienter handlet anderledes afhængigt af kilden af ​​tumor væv og på den kohorte (1980 eller 1990 kohorter). Konkret valgte vi 91% af de oprindelige patienter, som gennemgik en TURP eller en radikal prostatektomi i nogen af ​​de to kohorter, 33% af dem, der gennemgik en biopsi i kohorten 1990 og, i overensstemmelse med vores a-priori kriterier, ingen af ​​dem der gennemgik en biopsi i 1980-kohorten. Dette valg, bliver ved baseline (dvs. før forekomsten af ​​resultatet), er usandsynligt, at have indført skævhed i de foreningsmæssige skøn ([26]).

Fire-fem (10 um tyk) sekventielle sektioner blev skåret fra paraffinindstøbt væv af de 157 udvalgte diagnostiske dias. Skiverne overlappede nøjagtig med dias, som uropathologist fremhævet den valgte NTAT området. De blev manuelt dissekeret, fjerne den del af NTAT med en disponibel tynd klinge, som blev ændret mellem hvert individ. DNA blev derefter held udvindes for alle forsøgspersoner

Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité San Giovanni Battista Hospital -. CTO /CRF /Maria Adelaide Hospital i Torino (Prot N. 0.021.727, 19. marts 2007. ). Anonymiserede data om gen-methylering er tilgængelige efter anmodning til kvalificerede forskere med henblik på akademiske, ikke-kommerciel forskning.

Molekylære analyser

Den kommercielle QIAamp ® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt til ekstraktion og oprensning af genomisk DNA. Tilstrækkelighed af DNA blev kontrolleret ved hjælp af PCR-amplifikation af β-globin husholdning gen [27].

De genomiske DNA-prøver, herunder positive kontroller for methyleret og umethyleret status, undergik bisulfit modifikation hjælp Epitect Bisulfite Kit (Qiagen , Hilden, Tyskland).

Efter bisulfit modifikation, et PCR-assay med specifikke prober for at bestemme status for methylering af APC og GSTP1 promotorer blev anvendt. Dette assay muliggør påvisning af methyleret cytosin med høj følsomhed (1 methyleret cytosin ud af 10.000 ikke-methylerede cytosiner [28]). Hver PCR reaktion indeholdt: 1 × PCR-buffer, 5,5 pM MgCl2, 200 pM dNTP’er, 600 nm på begge primere, 200 nM og 80 nM af specifik probe til methylering af APC og GSTP1 promotorer, henholdvis 5 U Taq, 2 pi modificeret DNA med natriumbisulfit og destilleret H

2O til opnåelse af et slutvolumen på 25 pi. Reaktionen blev udført i en thermocycler (iCycler, BioRad, CA, USA) med følgende PCR-betingelser: 1,30 minutter ved 95 ° C, 15 sekunder ved 95 ° C, 1 minut ved en primer-specifik annealing temperatur (60 ° C ) for 50 cykler, og 10 minutter ved 72 ° C. Den universelle methylerede DNA CpGenome (Intergen Co., Oxford, UK) blev anvendt som en positiv kontrol. Negative kontroller blev indbefattet i alle reaktioner.

Primere og prober blev valgt ud fra offentliggjorte sekvenser (tabel 1) [29], [30]. Sonder målrettet fire CpG øer i hvert gen.

Oplysninger om APC, GSTP1 og RUNX3 methylering i prostata tumorvæv var allerede tilgængelige fra vores tidligere undersøgelse [5]. Men i den tidligere analyser vi brugte methyleringsspecifik PCR i stedet for probe realtids-PCR. Eftersom sidstnævnte metode har en højere følsomhed, vi testes igen alle prostata tumor vævsprøver, hvor APC eller GSTP1 var umethyleret, at gøre resultaterne fra prostata tumorvæv og NTAT mere sammenlignelige. Methylering i RUNX3 blev ikke revurderes, fordi analyser i NTAT involverede kun APC og GSTP1 og potentialet yderligere forstyrrende effekt af RUNX3 methylering i tumorvæv forventedes at være begrænset. Konsekvent, har tumorvæv methylering i RUNX3 ikke blevet overvejet yderligere i dette dokument.

Statistiske Analyser

Brug multivariable logistisk regression, vi skønnede de prævalens odds ratioer af APC eller GSTP1 methylering i NTAT for udvalgte karakteristika (Gleason score, methylering i prostata tumorvæv). Salg

virkningen af ​​NTAT methylering i hver af de to gener på kumulativ dødelighed af prostatacancer blev undersøgt under hensyntagen konkurrerende risici, og forskelle i mortalitet blev undersøgt med Gray test [31]. Vi brugte Cox proportional hazard regressionsmodeller til at estimere hazard ratio (HR) for dødelighed af prostatakræft i forbindelse med methylering i NTAT. Opfølgning varighed blev anvendt som tidsrum og alder ved diagnose blev indført som en kontinuert variabel. Både grafiske kontroller og formelle tests, baseret på Schoenfeld residualerne (p 0,14), viste, at den proportionale hazard antagelse var opfyldt. APC og GSTP1-methylering i NTAT blev analyseret i separate modeller, såvel som i en model undersøge antallet af methylerede gener, fra 0 til 2. Alle modeller blev udført både ikke tilpasning og justering for Gleason score og tilstedeværelsen af ​​GSTP1 eller APC . methylering i prostata tumorvæv

Da prognostiske markører er brug primært for lav- og mellemaktivt risiko tumorer, og på tidspunktet for diagnosen, før de beslutter om prostatektomi, gennemførte vi to undergruppe analyser begrænset til: i) forsøgspersoner med en Gleason score på 7 eller derunder, eller ii) forsøgspersoner, der undergik biopsi. Vi vurderede også sammenslutningen af ​​methylering i NTAT med kortsigtet dødelighed ved at foretage separate analyser begrænset til de første 5 år af follow-up.

Resultater

Valgte karakteristika for de 157 forsøgspersonerne er rapporteret i tabel 2. de fleste forsøgspersoner blev diagnosticeret i 1990’erne, med en median overlevelse på 6,79 år. Af de 128 patienter, der døde under opfølgningen, 43 mænd døde af prostatacancer. Kilden til væv blev ligeligt fordelt blandt biopsi, TURP og radikal prostatektomi. Der var en høj forekomst af både APC methylering (82,2%) og GSTP1 methylering (84,1%) i prostata tumorvæv.

Forekomsten methylering i NTAT var 43,9% for APC og 42% for GSTP1. Som opsummeret i tabel 3, mønstret for methylering i NTAT korreleret med det i prostata tumorvæv: methylering på en af ​​to gener i prostata tumorvæv var forbundet med methylering af det samme gen i NTAT. Gleason score var også en vigtig determinant for både APC og GSTP1-methylering i NTAT.

Som vist i figur 1 NTAT methylering både i APC (fig. 1a) og GSTP1 (fig. 1b) var forbundet med en øget risiko for langvarig mortalitet af prostatacancer. Hazard ratio for tilstedeværelsen af ​​methylering blev øget med omkring tre-folder (tabel 4). Disse blev svækket efter justering for methylering i prostata tumorvæv, og efter justering for Gleason score (HR = 1,91, 95% CI: 1,03-3,56 for APC og HR = 1,60, 95% CI: 0,80-3,19 for GSTP1). Analyse af antallet af methylerede gener i NTAT afslørede en positiv sammenhæng med dødelighed af prostatakræft (p-værdi for trend = 0,001): den rå HR dødelighed fra prostatakræft for 2 vs. 0 methylerede gener var 4,30 (95% CI: 2,00 -9,22), som faldt til 2,40 (95% CI: 1,15-5,01) efter justering for både gen methylering i prostata tumorvæv og Gleason score (tabel 5). Lignende foreninger er fundet, da analyserne var begrænset til at undersøge patienter med Gleason score på 7 eller derunder. Vi fandt ikke tegn på effekt ændringen ved kilden tumorvæv (p-værdi = 0,37). Resultater er begrænset til personer, som gennemgik biopsi er rapporteret i tabel 5. Tabel 5 viser også resultaterne for analyserne begrænset til de første 5 år af follow-up. Sammenligningen af ​​2 vs. 0 denatureret gener gav en rå HR på 5,71 (95% CI: 2,23 til 14,6), og 3,29 (95% CI: 1,27-8,52) efter justering for gen methylering i prostata tumorvæv og Gleason score

diskussion

Vi fandt en stærk sammenhæng mellem tilstedeværelse af APC og GSTP1 methylering i NTAT og dødelighed langsigtet og dødelighed 5-år fra prostatakræft. Foreningen tilbage efter justering for Gleason score og i analyser begrænset til at studere individer med en Gleason score på syv eller mindre, og i patienter, som gennemgik biopsi.

Disse resultater understøtter den hypotese, at DNA hypermethylering er en tidlig begivenhed i carcinogenese der kan påvises før tumoren bliver morfologisk indlysende; de støtter også idéen om feltet cancerisation i prostatakræft og dens rolle i prostatakræft progression. Den omstændighed, at mønstret for methylering ligner i NTAT og i prostata tumorvæv antyder at ændringerne findes i disse væv er en følge af lignende mekanismer, herunder en lateral udvidelse eller indflydelse af tumoren eller diffuse virkninger af de samme kræftfremkaldende stoffer.

Vi studerede methylering i GSTP1 og APC på grund af deres involvering i afgørende pivotale celle kontrol veje. GSTP1 er en “vicevært” gen, forebygge genomisk skade medieret af kræftfremkaldende stoffer eller oxidanter. Fejl i “vicevært” gener (dvs. hypermethyleringsassocierede) kan begunstige modtagelighed for udvikling af kræft. Desuden GSTP1 kan forstyrre vækst eller overlevelse signaleringsveje ved at fungere som et tumorsuppressorgen [32]. Analogt APC er en velkarakteriseret tumorsuppressorgen, oprindeligt identificeret i kolorektal cancer, der spiller en integrerende rolle i Wnt-signalvejen og i intercellulær adhæsion. Det interagerer med beta-catenin, et protein involveret i cellulær vedhæftning og motilitet. Regulering af beta-catenin forhindrer gener, der stimulerer celledeling og celle tilgroning [33].

I vores undersøgelse, vi brugte dødelighed af prostatakræft som resultatet (i modsætning til biokemisk recidiv) og vi havde en meget lang follow-up tid. Vi inkluderede både forsøgspersoner med en lav risiko for prostatakræft, og dem med en mere aggressiv prostatakræft. Kilden til prostata tumorvæv inkluderet biopsier, turps og radikale prostatektomi.

Forekomsten af ​​methylering i NTAT at vi har fundet er tilsvarende eller højere for at der påvist i tidligere undersøgelser, som dog viser betydelig inter-studie variation [23] – [25], [34], [35]. Alle disse skøn er ikke direkte sammenlignelige, da de undersøgelser, der anvendes forskellige protokoller til væv prøvetagning og forskellige molekylære teknikker. Vores molekylære metoder formål at maksimere følsomhed og vi fulgte en simpel protokol til opnåelse skiver NTAT med nedsat risiko for kontaminering fra prostata tumorvæv. Selvom vi ikke kan udelukke

a-priori Hoteller, som forureningen fandt sted i nogle prøver, hyppighed var på de fleste, begrænset, hvilket fremgår af, at sammenhængen mellem methylering i NTAT og prostatakræft dødelighed forblev stort set uændret efter justering for methylering i prostata tumorvæv. Havde tilstedeværelsen af ​​methylering i NTAT været på grund af forurening fra methylering i prostata tumorvæv, sammenhængen mellem methylering i NTAT og dødelighed af prostatacancer ville være blevet kraftigt reduceret efter justering.

Den vigtigste begrænsning af vores undersøgelse er manglen på kliniske og patologiske oplysninger andre end Gleason score. Derudover undersøgte vi en befolkning med i gennemsnit en højere dødelighed af prostatakræft end typiske moderne patient-serien. Disse begrænsninger hæmmer muligheden for at vurdere den faktiske yderligere prognostiske værdi af methylering i NTAT sammenlignet med for tiden anvendte nomogrammer. Vores undersøgelse er således i stand til at foreslå en mulig rolle methytlation i NTAT i prostatakræft progression, selv om muligheden for kliniske oversættelse af dette fund kræver yderligere undersøgelser i en bedre defineret klinisk miljø. Vi manglede også oplysninger om behandling ved indskrivningen, hvilket indebærer, at vores kohorte omfatter en heterogen gruppe af patienter, hvilket yderligere vanskeliggør direkte klinisk oversættelse af vores resultater. det faktum, at kilden til tumorvæv (biopsi, radikal prostatektomi, TURP) ikke var en effekt modifikator tyder dog på, at vores resultater på methylering i NTAT ikke forklares ved confounding fra patienternes heterogene og /eller indledende behandling.

størrelsen af ​​sammenhængen mellem methylering i NTAT og dødelighed af prostatacancer, som vi har fundet er stærkere end normalt fundet for methylering i prostata tumorvæv [5], [8] – [14]. Selv om de to gener, som vi studerede blev udvalgt

a priori

på grundlag af væsentlig dokumentation for deres potentielle rolle i prostata carcinogenese, er det sandsynligt, at yderligere prognostiske oplysninger kan fås ved studiet af et større antal gener .

som konklusion, vores fund af hyppig APC og GSTP1 methylering i NTAT og deres forbindelse med dødelighed af prostatakræft understøtter forestillingen om, at ændringer i gen-methylering er en tidlig begivenhed i prostata carcinogenese og spiller en rolle i cancer progression . Styrken af ​​association med dødeligheden af ​​prostatacancer og det faktum, at foreningen forbliver hos patienter med en Gleason score under 8 antyder, at methyleringsmønsteret i NTAT kunne være en mulig prognostisk markør for prostatacancer, der skal testes i fremtidige kliniske studier.