PLoS ONE: Kompleks Behavior af ALDH1A1 og IGFBP1 i levermetastaser fra en Kolorektal Cancer

Abstrakt

Ved hjælp af vores datasæt (GSE50760) forudgående er oprettet ved RNA-sekventering, nærværende undersøgelse havde til formål at identificere opreguleres gener associeret med kolorektal cancer (CRC) levermetastaser (CLM) og kontrollere deres biologiske adfærd. De potentielle roller kandidatgener i tumorer blev vurderet ved anvendelse af celleproliferation og invasion-assays. Vævsprøver blev opsamlet fra 18 CRC patienter med synkron CLM og to CRC cellelinjer (SW480 og SW620) blev anvendt til transfektion og kloning. Rollerne af generne identificeret i CLM blev kontrolleret ved hjælp af immunhistokemi i 48 nøgne mus efter milten transplantation af CRC celler. mRNA og protein-ekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-revers transkription polymerasekædereaktion og western blot hhv. Ni gener blev oprindeligt udvalgt efter relevansen af ​​deres molekylære funktion og biologisk proces, og endelig

ALDH1A1

IGFBP1

blev valgt på grundlag af forskellen mRNA udtryk og en positiv korrelation med protein udtryk. Den overekspression af ALDH1A1 og IGFBP1 betydeligt og tidsafhængigt nedsat celleproliferation (

s

≤ 0,001-0,003) og undertrykt invasiv ved ≥3 gange over kontrol celler (

s

0,001) i SW480 cellelinje, mens de havde en svag effekt på reduktion af SW620 celleproliferation. Protein ekspressionsniveauer af E-cadherin, N-cadherin, claudin-1, og vimentin var signifikant højere i CLM end i primære tumorvæv (

s Restaurant 0,05). Imidlertid blev cadherin switch, nemlig N-cadherin overekspression med reduceret E-cadherin ekspression, ikke observeret i CLM væv og transficerede CRC-celler. Uanset reduceret spredning og invasion fundet på

in vitro

celle assays vedvarende overekspression af β-catenin, vimentin, og ZO-1 i IGFBP1-overekspression SW480 celler muligvis bidraget til CLM udvikling hos mus implanteret med IGFBP1-overudtrykkende SW480-celler (CLM forekomster:. SW480 /

IGFBP1

transficerede mus

vs

SW480 /vektorfrie og SW480 /

ALDH1A1

transficerede mus, 4/8

vs

. 0/10,

s

= 0,023). Afslutningsvis er ALDH1A1 og IGFBP1 forskelligt overudtrykt i CLM og kan spille en dobbelt rolle, der fungerer som både tumor undertrykkere og metastase initiativtagere i CRC

Henvisning:. Kim JC, Ha YJ, Tak KH, Roh SA, Kim CW, Kim TW et al. (2016) Kompleks Behavior af ALDH1A1 og IGFBP1 i levermetastaser fra en kolorektal cancer. PLoS ONE 11 (5): e0155160. doi: 10,1371 /journal.pone.0155160

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: December 13, 2015; Accepteret dateret 25. april 2016 Udgivet: 6. maj 2016

Copyright: © 2016 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. En data sæt tidligere genereret af RNA-Seq og fås i NCBI Gene Expression Omnibus offentlig database under tiltrædelsen nummer GSE50760 blev brugt

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Korea Research Foundation (2013R1A2A1A03070986), Ministeriet for Science, IKT, og fremtidige planlægning, og Sydkorea Health 21 R 5 cm fra tumor grænse), primær CRC (PCC), og levermetastaser (CLM) histologisk identificeret som adenocarcinom. MRNA-ekspression blev sammenlignet mellem PCC og CLM af RNA-Seq for at vælge 998 gener med ≥2-fold ændringer i udtryk baseret på en GLM sandsynlighed kvotientkriteriet (

s

0,001) (S2 Table) [13 ]. Efter udelukkelsen af ​​309 lever-specifikke gener baseret på Tiger-databasen [14], blev 689 gener yderligere filtreret for at vælge 97 gener, der blev konsekvent opreguleret i 50% af CRC patienterne undersøgt (S3 tabel). Disse gener blev endelig indsnævret til ni gener ifølge relevansen af ​​deres molekylære funktion og biologisk proces [15], nemlig cellevækst og proliferation, ekstracellulære matrix, epithelial-mesenchymal overgang (EMT), og /eller cancer stamcelle, angiogenese , kemotaksi, og apoptose, som bestemt af Gene ontologi Consortium (https://geneontology.org):

IGFBP1

, hepatocytvækstfaktor aktivator (

HGFAC

), kemokinligand 16 (

CCL16

), inhibin beta E (

INHBE

), aktivering af transskription faktor 5 (

ATF5

), proteoglycan 4 (

PRG4

), cadherin 2 type 1 (

CDH2

),

ALDH1A1

, og erbB receptor tilbagemeldinger inhibitor 1 (

ERRFI1

) (figur 1).

Seks gener viste forskelle i udtryk på mere end 1 gange i PCC (2

ΔCtPCC-ΔCtNCE) i forhold til CLM (2

ΔCtCLM-ΔCtNCE) (indikerer opregulering af relevante gener). *

s

≤ 0,001 mellem PCC og CLM. CLM, kolorektal cancer levermetastaser; PCC, primær kolorektal cancer.

RNA isolering og realtid revers transkription-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra patientprøver og cellelinjer hjælp TRIzol

® reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. CDNA’et blev syntetiseret ud fra total RNA ved amplifikation under anvendelse tilfældige primere og SuperScript II RT (Invitrogen). Primere til målgener er anført i S4 tabel. Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (

GAPDH

) blev anvendt som en intern kontrol. Kvantitativ real-time reverse transcription polymerase kædereaktion (RT-PCR) blev udført på en LightCycler 96 under anvendelse af SYBR Green I Master Mix (Roche, Mannheim, Tyskland). Cykel Reaktionen blev startet med præ-inkubation ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 amplifikationscykler (95 ° C i 10 sek, Tm i 10 sek og 72 ° C i 10 sek). Proceduren Smeltningen omfattede tre betingelser (95 ° C, 65 ° C, og 97 ° C i 10 sek), og afkøling blev endelig udført ved 37 ° C i 30 sek. Det relative niveau af genekspression blev bestemt under anvendelse af -ΔΔCt metode [16]. Den Ct-værdi blev defineret som grænsen PCR cyklus, hvor den forstærkede produkt først blev opdaget.

Kolorektal cellelinjer, transfektion, og kloning

De 10 CRC cellelinier (DLD-1, HCT116, HCT15, HT29, LoVo, LS174T, RKO, SW480, SW620, og WiDr), to normale colon cellelinier (CCD-18Co og CCD841) og 3T3 fibroblaster blev erhvervet fra American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum og 1% (vægt /volumen) penicillin og streptomycin efter udbyderens anbefalinger. De relative mRNA udtryk for

ALDH1A1

IGFBP1

var ubetydelig i forhold til

GAPDH

udtryk i SW480-celler (klonet fra primær CRC) og SW620 celler (klonet fra metastatiske lymfeknuder knudepunkter i samme emne) (S1A Fig).

ALDH1A1

IGFBP1

cDNA (Origene, Rockville, MD) blev opformeret ved PCR og subklonet i DDK-mærkede pCMV6-indtastning for stabil transfektion (Origene). Transient transfektion blev udført i SW480 og SW620 CRC celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kontrol cellelinjer blev oprettet ved tom vektor transfektion. ALDH1A1- eller IGFBP1-udtrykkende celler blev genereret ved G418-selektion i 10 dage, vælge mindst to kloner for hver cellelinie. Stabile udtryk for ALDH1A1 og IGFBP1 blev bekræftet ved Western blot-analyse, som beskrevet tidligere [17].

Western blotting og immunhistokemi (IHC)

Proteiner blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse cellelyse-buffer ( cellesignalering, Beverly, MA, USA). Lige store mængder proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA), der blev blokeret i 5% skummetmælk i TBST. Membraner blev derefter inkuberet med primært antistof og HRP-konjugerede sekundære antistoffer [anti-ALDH1A1, anti-phospho-FAK (Tyr397), anti-FAK, anti-survivin, anti-β-catenin, anti-myc antistoffer og EMT-antistof sampler kit (Cell Signaling); anti-IGFBP1, anti-IGFBP1, anti-CD44 og anti-CD166-antistoffer (Abcam, Cambridge, UK), anti-CD133-antistof (MyBioSource, San Diego, Californien, USA)]. De specifikke komplekser blev detekteret under anvendelse af et SuperSignal West Pico kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Data blev kvantificeret og analyseret under anvendelse af en GS-800 kalibreret densitometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Relativ båndintensitet værdier blev beregnet ved at normalisere den eksperimentelle absolutte intensitet til den for den tilsvarende β-actin band som en loading kontrol. Desuden blev fem CLM prøver i paraffinblokke tilfældigt udvalgt blandt de 18 patienter i den oprindelige RNA-Seq at undersøge graden af ​​forurening af normale levervæv ved IHC under anvendelse Heppar-1 og CK-7 (DAKO, Carpinteria, CA, USA) monoklonale antistoffer mod hepatocytter og galdegangsceller, henholdsvis som tidligere beskrevet [17] (S2 fig).

celleproliferation og cellecyklusfordeling assays Salg

Kontrol og behandlet SW480 og SW620 CRC-celler var podes på plader med 96 brønde. Proliferationen blev målt dagligt i 5 dage under anvendelse af en celleproliferationsassay kit (CCK-8: Dojindo, Kumamoto, Japan) på en mikrotiterpladelæser indstillet til at måle absorbans ved 450 nm (Tecan, Melbourne, Australien). Til flowcytometri assays, 5 × 10

5 celler blev suspenderet i iskold phosphatpufret saltvand (PBS), fikseret med 70% ethanol i 1 time og inkuberet med propidiumiodid (50 ug /ml) (Sigma , St Louis, MO, USA) i 30 min. Efter vask med PBS blev 10.000 fluorescerende celler for hver prøve analyseret af FACSCalibur-systemet (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland) under anvendelse af flow cytometrisk systemsoftware (Becton Dickinson).

Invasion og gelatinezymografi assays

Kontrol og behandlet SW480 og SW620 CRC-celler (2 x 10

5 celler hver) blev podet på det øvre kammer af 24-brønds dyrkningsplader for matrigel invasion assays (BD BIOCOAT

™: BD Biosciences, San Jose , CA, USA) i overensstemmelse med producentens retningslinier. 3T3-fibroblast-konditioneret medium blev anbragt i det nedre kammer som en kemoattraktant. Efter inkubation ved 37 ° C i 24 timer blev celler på den øvre overflade af filteret fuldstændigt udslettet og filtre blev farvet med 0,2% krystalviolet i 10 minutter. Celler bundet til tre forskellige felter blev talt under et lysmikroskop (× 100), og alle assays blev udført tre gange. Matrixmetalloprotease (MMP) -2 og MMP-9 aktiviteter i dyrkningsmedier blev undersøgt ved gelatinezymografi. Alikvoter på 10 × koncentrerede konditionerede medier blev blandet med prøvepuffer og underkastet elektroforese på en 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel med 0,1% gelatine (Invitrogen) inkorporeret som et substrat for gelatinolytiske proteaser under ikke-reducerende betingelser ved 125 V i 2 timer. Geler blev inkuberet ved 37 ° C i 16 timer i en frisk udvikle buffer og farvet med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad). Bands på gelerne blev kvantificeret ved hjælp af et densitometer.

In vivo

transplantation, vækst og metastase af CRC celler

Vi brugte otte mus (6 uger gamle BALB /c-SLC-nu:.. Japan SLC, Shizuoka, Japan) for hver af de seks grupper med forskellig CRC celle transplantation,

jeg

e

, SW480 /vektor, SW480 /ALDH1A1 , SW480 /IGFBP1, SW620 /vektor, SW620 /ALDH1A1, og SW620 /IGFBP1. I alt 5 × 10

6 CRC-celler blev transplanteret ind i milten, og mus blev avlet i 12 uger, hvorefter levermetastaser blev identificeret ved PET-MRI-billeddannelse ved anvendelse af en sekventiel dyr imaging system (Nanoscan PET /MR: Mediso , Budapest, Ungarn). Dyr blev aflivet for at undersøge transplanterede og metastatiske tumorer, samtidigt målt ved anvendelse digital skydelærer (Mitutoyo, Kanagawa, Japan). Alle prøver blev histologisk identificeret ved hæmatoxylin og eosin (H 0,05. Alle beregninger blev udført ved hjælp af SPSS software (ver.21, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Kandidat gener muligvis forbundet med CLM

Den relative mRNA-ekspression af de ni kandidatgener blev vurderet i de 10 CRC patienter med synkron CLM (Fig 1). Den relative mRNA-ekspression var signifikant højere i CLM (2

ΔCtCLM-ΔCtNCE) end i PCC (2

ΔCtPCC-ΔCtNCE) prøver, og ekspression af seks gener afveg af 1-fold (med angivelse opregulering af relevant gener) (

s

≤ 0,001-0,003). Blandt disse seks gener, de mRNA ekspressionsniveauerne af

ALDH1A1

IGFBP1

var tæt korreleret med deres protein udtryk værdier i PCC og CLM væv i den respektive patient (

r

= 0,496 og

s

0,001 henholdsvis) og samtidig viste højere udtryk i CLM end PCC væv (

s

0,001-0,05) (figur 2). Således blev ALDH1A1 og IGFBP1 udvalgt til yderligere biologiske assays. Vores CLM prøver viste 97-99% tumorcelle homogenitet på IHC, og den gennemsnitlige fold stigninger i ALDH1A1 og IGFBP1 efter normalisering til p-actin-ekspression var 6,2 og 3,1, henholdsvis i forhold til de tilstødende normale levervæv (S2 Fig) .

De ekspressionsniveauerne af

ALDH1A1 Hotel (A) og

IGFBP1

(B) var højere i CLM end i PCC væv (specielt i 4 patienter: # 30, 38 , 43, 47). *

s

0,001-0,05 mellem PCC og CLM. IOU (N), normal kolik epitel; PCC (P), primær kolorektal cancer; CLM (M), kolorektal cancer levermetastaser.

Overekspression af ALDH1A1 og IGFBP1 hæmmer CRC celledeling

ALDH1A1- og IGFBP1-overekspression CRC celler blev genereret af cDNA transfektion til at erhverve på mindst to kloner og blev efterfølgende anvendt til at måle effekterne af disse proteiner på proliferation af CRC-celler (figur 3). Overekspression af

ALDH1A1

IGFBP1

dramatisk reduceret spredning på SW480 celler i en tidsafhængig måde, hvilket blev klart efter mellem 4 og 5 dage (

s

0.05 mellem vektor og klon # 1, og

s

0,05 ** mellem vektor og klon # 2.

ALDH1A1 og IGFBP1 hæmme invasion og migration af CRC celler

invasiv blev målt ved hjælp af antallet af CRC celler invaderer Transwell kammer og udtrykt som gange ændring mellem overudtrykkende og kontrolceller (fig 4A). IGFBP1-overekspression SW480 og SW620 celler viste en signifikant 3,0-5,7 gange lavere antal invaderende celler end kontrol celler (

s

0,05). ALDH1A1-overekspression SW480-celler på samme måde viste en 2 gange reduktion i invasiv (

s

0,05), og ALDH1A1-overekspression SW620 celler viste en tendens til reduceret invasionsevne sammenlignet med kontrol- celler. Virkningen af ​​ALDH1A1 og IGFBP1 på MMP-aktivitet blev målt ved gelatinezymografi (Fig 4B), hvilket viste, at de relative aktiviteter af MMP-2 og MMP-9 i ALDH1A1-overekspression SW480 og SW620 kloner blev signifikant reduceret med 1,4 til 3,9 gange sammenlignet med deres respektive kontrol celler (

s

0,05). De relative densiteter af MMP-2 og MMP-9-aktivitetsniveauer bånd blev signifikant reduceret i IGFBP1-overudtrykkende SW480-celler, men ikke i SW620-cellelinien. Ellers blev både fokal adhæsion kinase (FAK) og phospho-FAK (p-FAK) underexpressed i IGFBP1-overudtrykkende SW480-celler, og den reverse tendens blev set i SW620-celler (S3A Fig).

invasivitet blev målt med antallet af CRC-celler invaderer ind i det nedre kammer i brønden (A og C) og af gelatinolytiske aktivitet af MMP-2 og MMP-9 (B og D). Alle behandlede celler viste signifikant reduceret invasivitet i disse assays undtagen IGFBP1-overudtrykkende SW620 celler på gelatinezymografi. *

s

0.05 * mellem vektor og klon # 1 og **

s

0.05 mellem vektor og klon # 2.

Angivelse af molekyler, der er forbundet med epitelial-mesenkymale overgang og CRC stamceller

Vi evaluerede udtryk for 12 epitelial-mesenkymale overgang (EMT ) /CSC-relaterede molekyler under anvendelse tilgængelige vævsprøver, vektor-behandlede celler og ALDH1A1- og IGFBP1-overudtrykkende celler (Fig 5). Ekspressionsniveauerne af E-cadherin, N-cadherin, claudin-1, og vimentin var signifikant højere i CLM end i PCC væv (

s Restaurant 0,05), hvorimod bånd svarende til snegl, slug, ZEB1, og CD133 blev ikke påvist i nogen af ​​de matchede vævsprøver. Udtryk for β-catenin, vimentin, og ZO-1 var signifikant større eller opretholdes i IGFBP1-overekspression SW480 celler end i ALDH1A1-overudtrykkende og kontrol SW480 celler, henholdsvis (

s

0,05). Ellers ekspression af de fire markører herunder claudin-1, ZO-1, og CD166 var signifikant større eller opretholdes i IGFBP1-overudtrykkende celler end i deres ALDH1A1-overekspression og kontrol SW620 celler, henholdsvis (

s Restaurant 0,05). Ekspression af CD44 blev ikke påvist i SW620-celler, hvorimod CD133 ekspression ikke blev identificeret i SW480-celler.

CRC patienter med CLM (A), vektor, ALDH1A1- og IGFBP1-overudtrykkende CRC-celler (B). *

s

0,05 mellem PCC og CLM eller mellem vektor og ALDH1A1- eller IGFBP1-overekspression kloner. IOU (N), normal kolik epitel; PCC (P), primær kolorektal cancer; CLM (M), kolorektal cancer levermetastaser.

IGFBP1 fremmer levermetastaser i SW480-celle transplantation mus

Efter udelukkelsen af ​​8 mus, der døde af tumor-relateret årsager, primær milt tumorer (transplantation websted) og levermetastaser blev identificeret groft og histologisk i 40 mus (Fig 6). Primære tumorer lykkedes implanteret og steg med 20-50% i alle grupper. Levermetastaser udelukkende fandt sted i mus implanteret med IGFBP1-overekspression SW480 celler, mens det ikke blev identificeret i kontrol mus eller mus implanteret med ALDH1A1-overekspression SW480-celler (4/8 mus

vs

. 0/10 mus,

s

= 0,023). På den anden side, levermetastaser forekom hos mus behandlet med kontrol SW620 celler (2/8 mus), hvorimod det ikke blev identificeret i mus behandlet med ALDH1A1- eller IGFBP1-overekspression SW620-celler. Den lange diameter af CLMs var i intervallet 2.0-16 mm. Uanset om SW480 eller SW620 celler blev anvendt, var vektor-transficerede mus ikke udtrykke IGFBP1 i milten eller leveren, mens det blev overudtrykt i milt og lever af

IGFBP1

transficerede SW480 xenotransplanterede mus med CLM (S1B fig). Ellers ALDH1A1 blev overudtrykt i leveren uanset cellelinier. Vi undersøgt yderligere β-catenin og dens mål molekyler såsom c-myc og survivin i vores implanteret i IGFBP1- og ALDH1A1-overekspression SW480-celler. Den tidligere xenograft med CLM viste samtidig overekspression af β-catenin og c-myc, og sidstnævnte en uden CLM også udtrykte dem med undtagelse af c-myc i milten (S3B Fig).

pile angivne tumorer (den milt og lever blev fastsat ved de øvre og nedre dele, henholdsvis) og histologiske visninger (H mikrofotografier af milt og lever blev fastsat til den venstre og højre side, henholdsvis fra rød kvadrerede prøver). CLM, kolorektal cancer levermetastaser. Musene med CLM var i orden (højre og nedad) med lange diameter: A, nr CLM; B, ingen CLM; C, # 2 (2,7 mm) # 3 (2-5,3 mm) # 5 (4,4-6,6 mm) # 7 (4,4 mm); D, # 1 (16,0 mm) # 2 (2,2-8,0 mm); E, ingen CLM; F, ingen CLM.

Diskussion

Forskellige gen klynger effektivt kan høstes fra en enkelt RNA-Seq datasæt i henhold til de specifikke formål og bioinformatiske værktøjer, der anvendes. Vi oprindeligt udvalgt 998 gener viser ≥2 gange forskellen udtryk i PCC og CLM væv. Reproducerbarheden af ​​de udvalgte gener blev undersøgt i henhold til deres RNA-Seq score ved hjælp kvantitativ RT-PCR og western blotting i en anden kohorte. Core gener udvalgt efter differential udtryk ved hjælp RNA-Seq behov for at blive valideret i en anden kohorte hjælp strenge kriterier, som omfatter deres reproducerbarhed og få post-transkriptionelle ændringer [18]. Vi udelukkede leverspecifikke gener fordi deres ekspression tendens til at være labil og påvirkes af metaboliske ændringer og toksiske skader i hepatocytter, uafhængigt af tilstedeværelsen af ​​CLM. Vi yderligere indsnævret markeringen til ni gener på grundlag af funktionelle association med den metastatiske proces med CRC. To gener,

ALDH1A1

IGFBP1

, endelig blev udvalgt til at undersøge CLM-relaterede biologiske vekselvirkninger, fordi de bemærkelsesværdigt var opreguleret i CLM væv og samtidig viste nogle post-transkriptionelle og post-translationelle ændringer. Med hensyn til specificitet af disse gener i metastatiske tumorer, blev ekspressionsniveauerne af ALDH1A1 og IGFBP1 steget med 15,6% og 6,3%, sammenlignet med normale levervæv, overvejer en forurening på 3%. Imidlertid var parakrine effekt af ALDH1A1 og IGFBP1 fra forurenede levervæv overvejes, selv om det var svag.

ALDH1A1 mRNA og protein udtryk var signifikant større i CLM end PCC væv af vores patienter med synkron CLM. One IHC undersøgelse rapporterede, at en lavere forhold mellem ALDH1A1 niveau i tilstødende slimhinde med den for tumorvævet (RA /C 1) positivt korreleret med tumorinvasion og metastase kapaciteter [19]. Uventet ALDH1A1 overekspression reduceret proliferation og invasion af CRC-celler og faldt MMP-2 og MMP-9-aktivitet i vores undersøgelse. MMP-2 og MMP-9 spiller en vigtig rolle i nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix og basalmembranen, fremme tumorinvasion og metastase [20]. Disse resultater antyder, at ALDH1A1 overekspression i CLM kan virke som en metastase-inhibitor snarere end en metastase inducer. Hvis vi betragter ALDH aktivitet for at være kendetegnende for CSCS, besidder ubestemt spredning og metastatisk potentiale [21], overekspression i CLM væv næppe synes at forklare den reducerede proliferation og invasion af ALDH1A1-overudtrykkende celler. ALDH1A1 kan enten være en årsag eller konsekvens af CLM og yderligere arbejde er nødvendigt for at bestemme dens præcise rolle.

På trods af manglen på forsvarlig dokumentation for stimulering af tumorvækst og migration ved IGFBP1, mRNA og protein niveauer af IGFBP1 var signifikant højere i CLM end PCC væv i vores undersøgelse. I modsætning hertil viste IGFBP1-overekspression SW480 celler lavere spredning og invasion end ubehandlede celler i vores celle assays. IGFBP1 har uafhængige hæmmende virkning på kræft cellevækst og metastase i prækliniske undersøgelser, både direkte og gennem lokale graduering af andre komponenter i IGF-aksen [4,22]. Den anden observationsstudie rapporterede, at højere niveauer af plasma C-peptid og lavere niveauer af plasma IGFBP-1 ved levnedsmiddelkontrol, screening var forbundet med øget dødelighed hos patienter med ikke-metastaserende CRC [5].

EMT /CSC er en kritisk tidlig begivenhed i CRC invasion og metastase, og den er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​specifikke markører for hver fænotype [23]. CD133, CD44, CD166, ALDH1A1, og Lgr5 er CRC stamcellemarkører [6]. EMT udløser reversion til en CSC-lignende fænotype. I de fire CRC patienter med CLM inkluderet i den aktuelle undersøgelse, udtrykkene for E-cadherin, N-cadherin, claudin-1, og vimentin var signifikant højere i CLM end NCE og PCC væv, mens sneglen, slug, ZEB1, og CD133 viste ingen detekterbar ekspression i CLM væv. Endvidere blev den såkaldte “cadherin switch”, som består af N-cadherin overekspression og reduceret E-cadherin ekspression og er en integreret bestanddel af EMT [24], ikke påvist i CLM væv eller CRC-celler. Markørerne overudtrykt varieret afhængigt af gener transficeret, og cellerne, selv om deres kloner blev afledt fra den samme patient (SW480 og SW620). Tilsammen alle EMT /CSC markør udtryk afveg i de respektive klon og dermed syntes at spille forskellige roller i løbet af CRC progression. CD44-ekspression blev signifikant reduceret i SW620-celler, hvorimod CD133 ekspressionen blev reduceret i SW480-celler. Knockdown af CD44 resulterede i begrænset kolonidannelse og reduceret tumordannelse i xenotransplantater, kraftigt indikerer en funktionel rolle CD44 i CRC tumorigenese [25]. CD133 er blevet betragtet som en markør for kolon CSCS og en indikator for aggressiviteten og metastase [20]. Nedregulering af disse CSC markører kan påvirke spredning og invasivitet af transficerede SW480 og SW620 celler.

levermetastaser udelukkende fandt sted i mus med milten injektion af IGFBP1-overekspression SW480 celler, som kunne til dels forklares ved den vedvarende udtryk for p-catenin, vimentin, og ZO-1 i disse mus.