PLoS ONE: Pim kinaser Fremme Migration og metastatisk Vækst af prostatakræft Xenografts

Abstrakt

Baggrund og metoder

Pim familiens proteiner er onkogene kinaser impliceret i flere typer af kræft og er involveret i reguleringen af celleproliferation, overlevelse samt motilitet. Her har vi undersøgt evnen hos Pim kinaser til fremme metastatisk vækst af prostatacancerceller i to xenograftmodeller til human prostatacancer. Vi har også evalueret effekten af ​​Pim-selektive inhibitorer til at modvirke disse effekter.

Resultater

Vi viser her, at tumorigen vækst af både subkutant og orthotopisk inokuleret prostatakræft implanteret forstærkes af stabil overekspression af enten Pim-1 eller Pim-3. Desuden Pim-overudtrykker ortotopisk prostatatumorer er meget invasiv og i stand til at migrere ikke kun til de nærliggende prostata-drænende lymfeknuder, men også i lungerne for at danne metastaser. Når xenotransplanterede mus dagligt behandlet med Pim-selektiv inhibitor DHPCC-9, både de dele samt den metastatiske kapacitet af tumorerne er drastisk reduceret. Interessant er det Pim-forfremmet metastatisk vækst af ortotopisk xenografter forbundet med øget angiogenese og lymfangiogenese. Desuden tvang Pim ekspression øger også phosphorylering af CXCR4 kemokinreceptor, som kan gøre det muligt for tumorceller at migrere til væv, såsom lungerne, der udtrykker CXCL12 kemokinligand. Salg

Konklusioner

Vores resultater viser, at Pim overekspression forbedrer invasive egenskaber af prostata kræftceller

in vivo

. Disse virkninger kan reduceres ved at Pim-selektiv inhibitor DHPCC-9, som kan nå tumorvæv uden alvorlige bivirkninger. Således Pim målretning behandlinger med DHPCC-9-lignende forbindelser kan medvirke til at forebygge progression af lokale prostata carcinomer til dødeligt metastatiske maligniteter

Henvisning:. Santio NM, Eerola SK, Paatero I, Yli-Kauhaluoma J, Anizon F, Moreau P, et al. (2015) Pim kinaser Fremme Migration og metastatisk Vækst af prostatakræft Xenografter. PLoS ONE 10 (6): e0130340. doi: 10,1371 /journal.pone.0130340

Academic Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA

Modtaget: 20. november 2014 Accepteret: 19 maj 2015; Udgivet 15. juni, 2015

Copyright: © 2015 Santio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Finlands Akademi (tilskud 121.533 til PJK indrømme 269.541 til PH), Tuli Program ved universitetet i Turku (PJK), Sigrid Juselius Foundation (PH), FinPharma ph.d.-program (NMS), Emil Aaltonen Foundation (NMS), Cancer Organisationer for Vest Finland (NMS), Orion-Farmos Research Foundation (NMS), finsk Kulturfond (NMS), Turku University Foundation (SKE), og Walter och Lisi Wahls Stiftelse för Naturvetenskaplig Forskning (JYK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Johanna Tuomela var ansat af Pharmatest Services Ltd i en periode i løbet af undersøgelsen. Pharmatest havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle JT er artikuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Johanna Tuomela var ansat af Pharmatest Services Ltd i en periode i løbet af undersøgelsen. Der er ingen patenter, produkter i udvikling, eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke JT tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Pirkko Härkönen er en PLoS ONE Editorial Board medlem, men det ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

pim

familie-generne blev først identificeret som provirale integration sites for Moloney leukæmivirus [1], men har senere vist sig at være involveret i udviklingen af ​​humane lymfoide maligniteter samt faste tumorer [2]. Proteinerne kodet af de tre

pim

familie gener er serin /threonin-specifikke kinaser, der har vist sig at fremme tumorigenese ved at øge både proliferation og overlevelse af celler [2,3]. På det seneste har vi og andre også impliceret dem i reguleringen af ​​migration og invasion af vedhængende cancerceller [4-6], mens resultaterne fra kliniske studier viser sammenslutning af unormalt højt indhold af Pim kinaser med flere ondartede kræft i epitel oprindelse [7 -9].

på grund af deres nye roller i udviklingen af ​​kræft, Pim kinaser er blevet særdeles attraktive som terapeutiske mål [10-12]. Der er også fysiologiske og strukturelle grunde til at retfærdiggøre Pim kinaser som lægemiddelkandidater. Først forventes ikke inaktivering af Pim kinaser til at forårsage alvorlige bivirkninger, da mus mangelfuld for alle tre Pim familiemedlemmer er levedygtig [13]. For det andet er unikke strukturelle træk inden hængselregionen der forbinder N- og C-terminale lapper omkring ATP-bindende lomme gøre PIM kinaser konstitutivt aktiv og muliggøre design af stærkt selektive inhibitorer [14]. Vi har for nylig identificeret potente og selektive Pim kinase hæmmere inden for to strukturelt uafhængige grupper af forbindelser, tetracykliske pyrrolocarbazoler [15] og tricykliske benzo [

cd

] azulener [16]. Vi har også funktionelt valideret dem i både

in vitro

og cellebaserede assays [6, 17].

tumorxenoplantater levere fremragende fysiologiske indstillinger til prækliniske proof-of-concept studier, både til identificere terapeutiske mål og evaluere

in vivo

effekten af ​​forbindelser rettet mod dem. Subkutan inokulation af PC-3 prostatacancerceller overudtrykker enten Pim-1 eller Pim-2 i immundefekte mus er tidligere blevet vist at resultere i større tumorer [18], men sammenlignelige data om Pim-3 har manglet som også direkte bevis for evne Pim kinaser at bidrage til dannelsen af ​​metastaser. Alligevel oplysninger fra cellebaserede motilitet analyser samt kliniske data forbinde opregulering af Pim kinaser til kræft celle migration, invasion og mere ondartet adfærd [4-9]. Desuden har Pim-1 vist sig at regulere CXCR4 /CXCL12 kemokin pathway, som spiller en vigtig rolle i migration og invasion af både leukæmiske [4, 19] og prostatacancerceller [20-23].

I denne undersøgelse har vi vurderet virkningerne af Pim kinaser og deres hæmmere bruger både subkutane og ortotopisk mus xenograftmodeller til human prostatacancer. Vi viser, at overudtrykte Pim-1 eller Pim-3 kinaser fremmer ikke kun vækst af PC-3-celle-afledte xenotransplantater, men også metastatiske egenskaber af orthotopisk inducerede tumorer, og at Pim-inhiberende forbindelser kan forhindre disse virkninger. Vi viser også, at Pim-forfremmet metastatisk vækst er forbundet med øget angiogenese, lymfangiogenese og CXCR4 fosforylering.

Resultater

Pim-3-kinase øger vækst og metastatiske egenskaber af prostatacancer-xenotransplantater

for at undersøge muligheden for Pim-3 for at fremme tumorvækst og metastase under

in vivo

betingelser, vi etableret en stabil PC-3 /Pim-3 prostatakræft cellelinje udtrykker human Pim-3 sammen med Tomat som en fluorescerende opfølgende markør. For at vurdere den tumorigene potentiale PC-3 /Pim-3 cellelinie sammenlignet med mock-transficerede PC-3 kontrol cellelinie blev celler subkutant inokuleret i athymiske nøgne hanmus. Under opfølgningen periode på op til 24 dage blev tumorvolumener målt både med en skydelære og ved fluorescerende billeddannelse af tomat udtryk. Efter aflivning blev tumorer og vævsprøver udtaget til fluor og morfometriske analyser. Disse viste, at Pim-3-overudtrykkende xenotransplantater var vokset betydeligt hurtigere end de mock-transficerede celler, selvom tumorer var forblevet lokale uden tegn på metastaser (fig 1A og 1B). De manuelt målte tumor volumen korreleret med arealerne fastlagt af fluorescerende billeddannelse (S1 Fig). For yderligere at analysere vækst egenskaber af disse tumorer blev mitotiske celler farves fra paraffinindlejrede væv prøver. Interessant nok er andelen af ​​mitotiske celler var klart højere i Pim-3-overekspression tumorvæv end i kontrollerne (fig 1C og S1 Fig). Forskellene i tumorvolumener kunne også detekteres fra de hele tumor scanninger, der anvendes til analyse af de mitotiske celler (S1 Fig). Samtidigt til de subkutane eksperimenter blev celler dyrket i tre uger uden antibiotisk selektion for at bekræfte stabiliteten af ​​Pim-3 overekspression (S1 Fig).

PC-3-afledte cellelinier, som var blevet stabilt transficeret med et tomt vektor (C) eller en vektor der udtrykker Pim-3 (P3) blev subkutant eller orthotopisk injiceres i athymiske nøgne mus. Tumorer og isolerede væv blev farvet med hematoxylin og eosin til visualisering af deres struktur. Yderligere farvninger blev udført med anti-phospho-histon H3-antistof for at visualisere antallet af mitotiske celler. I de subkutane eksperimenter blev tumordannelse efterfulgt af fluorescens billeddannelse af Tomat-ekspression (A) og omtrentlige tumorstørrelser blev målt ved palpering på forskellige tidspunkter (B). Efter 24 dage blev musene aflivet, og deres tumorer og væv blev opsamlet. Vist er gennemsnitsværdier fra alle fuldt afbildes tumorsnit fra angivne tal (

n

) af mus efter farvning af mitotiske celler (C). I de ortotopisk eksperimenter blev de stabile PC-3-celler lov til at vokse i prostata i tre uger. Derefter mitotiske celler (brune) blev analyseret fra prøve billeder (D), mens metastaser (angivet med pile) blev talt fra prostata-drænende lymfeknuder og lunger (E).

Da de subkutane xenotransplantater havde ikke invaderet i kroppen, fortsatte vi vores studier med en ortotopisk prostatakræft model, hvor tumor mikromiljø var forventet at være mere positive over for metastatisk vækst [24-26]. I den første pilot sæt eksperimenter, bekæmpelse eller Pim-3-overudtrykkende celler blev orthotopisk inokuleret i prostata af nøgne hanmus. Tumorvækst blev fulgt i løbet af en periode på tre uger, hvorefter dyrene blev aflivet, og tumorer sammen med udvalgte organer blev indsamlet. I denne undersøgelse blev der ikke påvist store forskelle i tumor volumen. Imidlertid analyse af paraffinindlejrede vævsprøver ikke kun afslørede højere mitotiske potentiale Pim-3-overudtrykkende celler, men også deres evne til at invadere i lungerne (fig 1D og 1E). I modsætning hertil mildere metastatisk adfærd mocktransfekterede kontrolceller bekræfter vores tidligere observationer på evnen hos parentale PC-3-celler at invadere i prostata-drænende lymfeknuder, men sjældent til mere fjerntliggende organer [25-26].

Pim hæmning tolereres af zebrafisk embryoner og voksne mus

de lovende resultater med invasiv Pim-3-overekspression ortotopisk tumorer fik os til at udføre et andet sæt af eksperimenter, hvor vi også testet effekten af ​​Pim hæmning af tetracykliske pyrrolocarbazolforbindelse DHPCC-9 [6] og tricykliske benzo [

cd

] azulen BA-1a [17]. Til sammenligning har vi også etableret en anden stabil PC-3 cellelinie overudtrykker human Pim-1.

Før dyreforsøg, effekten og toksicitet af Pim-selektive inhibitorer blev testet i cellebaserede assays og

in vivo

. Begge inhibitorer effektivt antagoniserede pro-migrerende virkninger af Pim-1 og Pim-3, og nedsat vandring af alle stabile cellelinjer i et tilsvarende omfang (S2 Fig). Inden for 24 timer opfølgningsperiode af sårheling assayet blev cellelevedygtighed kun svagt påvirket, mens begge inhibitorer dramatisk reduceret den i alle cellelinjer ved et senere 72 h time-point. Når

in vivo

sikkerheden af ​​hæmmere blev analyseret med zebrafisk embryoner i deres vandmiljø, både DHPCC-9 og BA-1a var veltolereret, mens vores cytotoksiske kontrol sammensatte BA-2c [17] førte til massiv udviklingsmæssige problemer og død (S3 Fig og S1 tabel). Imidlertid blev let buede haler og forstørrede perikardial sække observeret i embryoner behandlet med 10 pM DHPCC-9 (S3 Fig), tyder på, at der er behov for ordentlig Pim aktivitet for normal embryonal udvikling. Alligevel disse data ikke mulighed for pålidelige konklusioner om sikkerheden for de inhibitorer i voksne organismer.

Ekstra sikkerhed tests blev derefter udført med voksne mus. Men med de høje koncentrationer er nødvendige for disse tests, kun DHPCC-9 kan suspenderes i DMSO, mens BA-1a var opløseligt kun i N, N-dimethylacetamid (DMA).

Under en indledende ti-dages follow-up periode, DHPCC-9 behandlinger (50 mg /kg) forårsagede ingen større ændringer i mus adfærd, injektion område eller kropsvægt (S4 fig). Derimod DMA-baserede behandlinger (25 mg /kg) forårsagede uro adfærd og lidt nedsat legemsvægt. Desuden DMA syntes at inducere arvævsdannelse i injektionsområdet. Derefter blev sikkerhedstest fortsatte med mindre mængder af DMA (10-20 mg /kg), som ikke forårsager nogen synlige ændringer i injektionsstedet, mus adfærd eller vægtøgning i løbet af 17-dages opfølgning (S4 Fig). Baseret på disse resultater, 50 mg /kg DHPCC-9 i 20 pi DMSO og 20 mg /kg af BA-1a i 10 pi DMA blev besluttet at anvendes dagligt for at teste deres virkning på orthotopisk Pim-3-overudtrykkende prostata xenografter.

Pim hæmning reducerer Pim-afhængig metastatisk vækst af ortotopisk prostata xenografter

i det andet sæt af ortotopisk eksperimenter, mocktransfekterede PC-3 celler eller celler, som stabilt overudtrykker Pim-1 eller Pim -3 blev orthotopisk inokuleret i prostata af nøgne hanmus. Mus med Pim-3-overudtrykker xenotransplantater blev randomiseret i 4 grupper og administreres med daglige doseringer af inhibitorer eller lige store volumener af DMSO eller DMA som kontroller. Mus adfærd og vægtøgning blev fulgt under forsøget, men der blev ikke konstateret væsentlige inhibitor-relaterede ændringer (S5 Fig). Efter aflivning blev tumorer udskåret og mus uden tumorer blev udelukket fra yderligere analyser (S2 tabel). For at bekræfte stabiliteten af ​​cellelinierne,

ex vivo

scanning blev udført for at detektere Tomato signaler i tumorer (S6 Fig), mens immunohistokemi blev anvendt til at visualisere xenotransplanterede tumorceller, der udtrykker Pim proteiner fra V5-mærkede konstruktioner ( S7 fig).

Når tumorvolumener blev beregnet, Pim-overudtrykkende tumorer blev igen betydeligt større end de, der dannes ved mock-transficerede celler (fig 2A og 2D). Men Pim-1-xenografter kunne ikke direkte sammenlignes med andre, da mus, der bærer dem ikke havde opnået nogen kemiske behandlinger. DHPCC-9 behandling faldt betydeligt mængden af ​​Pim-3-overudtrykker tumorer, hvilket antyder, at denne forbindelse havde kunnet nå tumorvævet og inhiberer Pim-3-aktivitet der (Fig 2B og 2D). Derimod har BA-1a ikke viser nogen effekt med hensyn til reduktion tumorvolumen (fig 2C og 2D). Tilsyneladende dette stof ikke havde nået sit målvæv, som også foreslået ved tilstedeværelsen af ​​et gult bundfald omkring injektionsstedet.

PC-3-afledte stabilt transficerede celler (Mock = C, Pim-1 = P1, pim-3 = P3) blev orthotopisk inokuleret i prostata af athymiske nøgne mus. Mus blev behandlet dagligt med enten DMSO eller DMA (kontrolbehandlinger) eller med Pim inhibitorer (50 mg /kg af DHPCC9 i DMSO eller 20 mg /kg af BA-1a i DMA). Efter tre ugers behandling blev mus aflivet, og deres tumorvolumener blev målt. Først volumenerne blev sammenlignet mellem angivne numre (

n

) af mus uden inhibitor behandlinger (A). Så de mængder af tumorer afledt af inhibitor-behandlede dyr blev sammenlignet med tumorer fra dyr med en hensigtsmæssig kontrol behandlinger DMSO (B) eller DMA (C). Før tumor fiksering blev repræsentative billeder taget (D). Senere paraffinindlejrede tumor- snit blev farvet med anti-phospho-histon H3-antistof for at visualisere mitotiske celler (brun). Vist er gennemsnitsværdier kombineret fra alle fuldt afbildet tumor vævssnit fra DHPCC-9-behandlede og DMSO eller DMA-behandlede kontrolgrupper samt repræsentative billeder fra Pim-3-overekspression tumorer (E).

mitotiske satser blev også målt fra vævssnit afledt af ortotopisk tumorer. Mens der i de subkutane eksperimenter og i det første sæt af ortotopisk eksperimenter, der havde været klart mere mitotiske celler i tumorer dannet af Pim-3-overudtrykkende celler sammenlignet med mock-transficerede celler (Fig 1C og 1D) i det andet ortotopisk sæt forskellene var mindre (fig 2E). Men behandling med DHPCC-9 var faldet af antallet af mitotiske celler i Pim-3 xenotransplantater (figur 2E).

Da Tomat-afledte fluorescens ikke var stærk nok til tydeligt afslører mikrometastaser (S6 Fig), histologiske analyser blev udført med vævssnit fra nyrer, milt, lever, lunger samt prostata-drænende lymfeknuder. Efter farvning med hæmatoxylin og eosin, blev der søgt metastaser i fra forskellige vævsprøver, men især fra lymfeknuder og lunger. Interessant nok mens mere end halvdelen af ​​mock-transficerede og de fleste Pim-1 eller Pim-3 xenotransplantater havde kunnet metastaserer i prostata-drænende lymfeknuder, havde kun Pim-overudtrykkende celler invaderet så langt som ind i lungerne (fig 3a- 3C, S3 tabel). Endnu mere interessant, DHPCC-9 behandling havde effektivt inhiberede dannelsen af ​​metastaser i begge organer. Både metastatiske og nekrotiske områder blev målt, men der var ingen klar forbindelse til Pim aktivitet (S6 Fig), hvilket antyder, at når en metastatisk tumor er dannet, kan tumorcellerne erhverve andre egenskaber udover Pim aktivitet for at støtte deres vækst.

Forskellige organer blev indsamlet fra mus med ortotopisk prostata tumorxenotransplantater dannet af PC-3-celler, der stabilt overudtrykker en tom vektor (C), Pim-1 (P1) eller Pim-3 (P3). Paraffinindlejrede vævssnit blev farvet med hematoxylin og eosin og analyseret for tilstedeværelsen af ​​metastaser. Vist er repræsentative billeder (A) fra lymfeknude og lungesnit (tumorceller angivet med pile). De metastatiske egenskaber af xenotransplantater fra mus behandlet med DHPCC-9, blev også analyseret BA-1a eller deres opløsningsmidler. Vist er procentdele af mus positive for enten lymfeknudemetastaser (B) eller lungemetastaser (C) i hver gruppe.

For at visualisere vaskulaturen af ​​de ortotopisk tumorer, blodkar og lymfekar blev plettet. Efter kvantitative analyser, blev en betydelig stigning detekteret i de områder af blodkar per tumor i xenotransplantater dannet af de Pim-overudtrykkende celler i sammenligning med kontrolcellerne (figur 4A). Lidt mindre forskelle blev påvist også i de områder af lymfekar (Fig 4B). Men efter behandling med Pim inhibitor DHPCC-9, områderne både blod samt lymfekar blev signifikant reduceret (figur 4A-4D).

Angiogene egenskaber af de ortotopisk prostata xenografter (Mock = C, pim-1 = P1, Pim-3 = P3) blev analyseret ved immunhistokemisk farvning af paraffin-indlejrede vævssnit med anti-CD34 (blodkar) og anti-m-Lyve-1 (lymfekar) antistoffer. Vist er gennemsnitlige områder af alle analyserede blod (A) og lymfekar (B) sammen med de repræsentative billeder (skibe i brun) (CD) fra fuldt afbildet tumor vævssnit.

Pim-1 og Pim -3 forbedre phosphorylering og celleoverfladeekspression af CXCR4

CXCR4 kemokinreceptor protein er tidligere blevet impliceret i PC-3 cell migration og interaktion med endotelceller [20-23]. Desuden er der i hæmatopoietiske celler Pim-1 har vist sig at phosphorylere CXCR4 på Ser339, og derved fremme celleoverfladeekspression af CXCR4 og dens interaktion med CXCL12 kemokinligand [4]. Desuden har vi tidligere vist Pim inhibering eller dæmpning til effektivt at reducere invasion af PC-3-celler dybt MG-63 osteosarcom celle-konditioneret medium, hvor størstedelen kemoattraktant er CXCL12 [6, 23]. For at finde ud af, om Pim /CXCR4 interaktion spiller en rolle også i vores prostatakræft xenograftmodel, vi først vurderes, om der var forskelle i phosphorylering status CXCR4 mellem vores stabile cellelinier. Ved Western blotting, observerede vi en markant stigning i de Ser339-phosphoryleret CXCR4 niveauer i både Pim-overudtrykker stabile cellelinier i sammenligning med kontrolgruppen cellelinien (Fig 5A). Derudover blev et fald i phosphorylerede CXCR4 niveauer ses efter behandling af parentale PC-3 celler med Pim inhibitoren DHPCC-9 (Fig 5B).

Phosphorylering af CXCR4 på S339 samt Pim niveauer blev analyseret ved western blotting i stalden Pim-1 (P1), Pim-3 (P3) eller kontrol vektor (C) overekspression PC-3-celler eller den parentale PC-3-cellelinjen blev behandlet med 0,1% DMSO eller 10 uM DHPCC-9. Vist er resultaterne fra et repræsentativt eksperiment med lastning kontroller og molekylvægt (kDa) markører (A-B). Evnen af ​​Pim familiemedlemmer til at phosphorylere CXCR4

in vitro

blev analyseret ved at inkubere GST-mærket Pim-1 (P1), Pim-2 (P2) eller Pim-3 (P3) proteiner med GST-mærket fragmenter af vildtype (WT) eller Ser339 Ala (SA) mutant human CXCR4. Phosphoryleret CXCR4 blev opdaget af phospho (Ser339) -CXCR4 antistof og protein lastning af Ponceau S farvning. Vist er resultaterne fra et repræsentativt forsøg (C). Lokalisering og signalintensitet af phosphoryleret versus samlede CXCR4-ekspression blev analyseret ved immunofluorescens (IF) farvning af stabilt transficerede celler behandlet med enten 0,1% DMSO eller 10 uM DHPCC-9. Eksperimentet blev kontrolleret af parallelle prøver farvet kun med det sekundære antistof (-ab). Farvninger blev gentaget to gange, og stakke af billeder blev taget ved konfokal mikroskopi fra mindst 30 celler pr prøve pr eksperiment. Vist er de signalintensiteter af phospho-CXCR4 farvninger i forhold til de samlede CXCR4 niveauer sammen med repræsentative billeder fra phospho-CXCR4 og CXCR4 farvninger (D-E). Phosphorylering og lokalisering af CXCR4 blev også analyseret ved immunhistokemisk farvning af paraffin-indlejrede vævssnit fra orthopic prostatatumorer. Vist er den relative stigning i mængden af ​​phospho-CXCR4-positive celler versus samlede CXCR4 ekspression målt ved hele tumor scanning. PBS i stedet for det primære antistof blev anvendt som en negativ kontrol. Repræsentative billeder blev taget for at visualisere forskellene i phospho-CXCR4 (mørkebrun) farvninger (F).

Siden stabil overekspression af enten Pim-1 eller Pim-3 klart forbedret CXCR4 fosforylering, vi ønskede at sammenligne

in vitro

aktiviteter alle tre Pim familiemedlemmer mod CXCR4. Derfor inkuberede vi GST-mærket Pim proteiner sammen med GST-mærket C-terminale 46 aa fragmenter af CXCR4 (WT) eller dens muterede S339A formen (SA), hvor serinresten var blevet erstattet af en alaninrest. Når

in vitro

phosphorylerede fragmenter blev påvist med anti-phospho (Ser339) -CXCR4 antistof, blev det klart, at både Pim-1 og Pim-3, men ikke Pim-2 kan phosphorylere CXCR4 på Ser339 ( fig 5C). Lignende forskelle blev også påvist i PC-3 celler efter forbigående Pim overekspression, mens Pim inhibitor DHPCC-9 effektivt hæmmede CXCR4 fosforylering der (S8 Fig).

Derefter vi udført immunofluorescens farvninger at visualisere lokalisering af CXCR4 protein i de stabile PC-3-cellelinjer, der var blevet behandlet i 24 timer med DMSO eller DHPCC-9. Mens CXCR4 blev ubikvitært, dens phosphorylerede form genkendes af anti-phospho (Ser339) -CXCR4 antistof fremvist mere membranassocieret ekspression i DMSO-behandlede prøver, men snarere spredt og svagere cytoplasmatisk ekspression i DHPCC-9-behandlede prøver (Fig 5D og 5E). Mens både Pim-1 og Pim-3 forbedret de phospho-CXCR4 signaler i forhold til de samlede CXCR4 niveauer, Pim hæmning effektivt reducerede dem, hvilket resulterer også i lidt stærkere nukleare udtryk for CXCR4 (Fig 5D og 5E).

at analysere den rolle, CXCR4 phosphorylering i vores

in vivo

eksperimenter anvendte vi immunhistokemi til at måle de relative mængder af ortotopisk prostatatumorceller positive for phosphoryleret CXCR4. Sammenligning af phospho-CXCR4 signaler til de gennemsnitlige CXCR4 signaler i hver tumor afslørede, at både Pim-1 og Pim-3 havde signifikant forøgede de relative mængder af phospho-CXCR4, mens Pim inhibering med DHPCC-9 var faldet det endda under niveauet observeret i mocktransfekterede prøver (figur 5F). Alt i alt, både

in vitro

in vivo

data antyder, at tumorer overudtrykker Pim-1 eller Pim-3 kan drage fordel af CXCL12 /CXCR4-kemokin vej til at sprede til andre organer såsom lungerne.

diskussion

Her viser vi, at PC-3 prostatacancerceller overudtrykker enten Pim-1 eller Pim-3 kinaser danne større xenotransplantattumorer end forældrenes PC-3 celler. Disse resultater er i god overensstemmelse med tidligere observationer på evnen af ​​Pim-1 og Pim-2 at øge væksten af ​​PC-3 celle-afledt subkutane prostatacancer-xenotransplantater [18], mens vi her vise, at Pim-3 er også lige så effektive . Flere interessante, når orthotopisk inokuleret i mus prostata, celler overudtrykker Pim-1 eller Pim-3 har en øget kapacitet til at metastasere fra prostata-baserede tumorer til andre organer, såsom lungerne. Desuden udviste et af de testede Pim-inhiberende forbindelser, DHPCC-9, er i stand til at sænke Pim-afhængig tumorvækst samt dannelsen af ​​metastaser uden alvorlige bivirkninger, hvilket antyder, at den er i stand til at trænge ind i tumorceller for at inaktivere Pim kinaser der.

Mens vi tidligere har vist, at Pim kinaser er i stand til at fremme motilitet af prostata kræftceller [6] den foreliggende undersøgelse er den første til at demonstrere lignende virkninger også under

in vivo

betingelser . Dette er af interesse, eftersom orthotopisk inokulerede PC-3-celler, der tidligere har vist sig at migrere fra prostata til de lokale prostata-drænende sakrale og iliaca lymfeknuder, men sjældent andre steder [24-26]. Disse fund blev bekræftet i vore studier, hvor der blev observeret metastatisk vækst i prostata-drænende lymfeknuder fra de fleste tumorbærende mus. Men kun de Pim-overekspression xenografter kunne metastaserer i lungerne, mens der ikke metastaser blev påvist i andre indsamlede væv.

For at løse de tumorigene mekanismer drevet af Pim kinaser og imod af Pim hæmning, vævsprøver fra de primære xenotransplantattumorer blev analyseret ved immunohistokemi for markører af mitotisk aktivitet, angiogenicity og invasionsevne. Lette Pim-afhængige stigninger i andelen af ​​mitotiske celler og i de områder af lymfekar, medens større opregulering blev detekteret ved dannelsen af ​​tumorvaskulatur og i phosphorylering og celleoverfladeekspression af CXCR4. Derimod blev alle disse parametre stærkt nedsat af Pim-selektiv inhibitor DHPCC-9. Således kan disse observationer forklarer ikke kun øget vækst af tumorer overekspression Pim kinaser, men også deres metastatiske egenskaber.

CXCL12 /CXCR4-kemokin vej er afgørende for lymfocyt menneskehandel og især til homing af hæmatopoietiske stamceller ind i knoglemarv [19, 27]. Desuden er det CXCL12 chemokin konstitutivt udtrykt i flere andre organer, herunder lymfeknuder og lunger og kan dermed tiltrække ikke kun hæmatopoietiske celler, men også migrerende kræftceller, der ofte viser høje ekspressionsniveauer af CXCR4-receptoren på deres celleoverflade. Endvidere kan CXCR4 understøtte tumoroverlevelse fx ved at fremme tumorvaskularisering.

Pim-1 overekspression er blevet forbundet med opreguleret celleoverfladeekspression af CXCR4 i hæmatopoietiske maligniteter såsom akut myeloid leukæmi [4], diffust storcellet B-celle lymfom [28] og kronisk lymfatisk leukæmi [29]. Den intracellulære hale af CXCR4 kan phosphoryleres

in vitro dele på Ser339 af Pim-1-kinase [4] og Pim-3, som vist her, men ikke af Pim-2. Interessant, Ser339 er blandt flere serinrester er mål for G-protein receptor kinaser (GRK’er), hvilket resulterer i receptor endocytose [30]. Derimod har Pim-afhængig phosphorylering af CXCR4 blevet rapporteret at føre til øget eksternalisering af receptoren, hvilket tillader celler at migrere til en CXCL12 gradient [4]. I PC-3-celler, CXCR4 overflade er relativt lave, medmindre cellerne behandles med CXCL12 ligand, hvilket også tydeligt øger invasive egenskaber af disse celler [20-23]. Således, mens yderligere undersøgelser af virkningen af ​​Pim kinaser på CXCR4 i PC-3 celler dyrket i fravær eller tilstedeværelse af CXCL12 ville være af interesse, kan man allerede spekulere i, at Pim-CXCR4 interaktionen har hjulpet vores Pim-overekspression ortotopisk tumorceller til dannelse metastaser i prostata-drænende lymfeknuder og lungerne, mens tumormikromiljøet omkring subkutane tumorer måske ikke været eftergivende nok til at fremme invasion.

Da CXCL12 /CXCR4-vejen er et attraktivt terapeutisk mål flere forbindelser med små molekyler er blevet udviklet, der enten blokerer interaktionen af ​​kemokin med dets receptor eller inhiberer signalering nedstrøms fra receptoren [19, 27]. Lovende resultater er allerede blevet indhentet fra kliniske forsøg, der har til formål at øge kemosensitivitet af hæmatopoietiske maligniteter, men CXCL12 /CXCR4-hæmmere kan også bidrage til at reducere den metastatiske potentiale solide kræftformer. Et problem med disse inhibitorer er, at de inducerer en modreguleret opregulering af CXCR4 på celleoverfladen, hvilket resulterer i kun kortvarig responser. Derfor kan det være mere effektivt at blokere eksternalisering af CXCR4-receptoren af ​​Pim-selektive inhibitorer, der også kan have mindre skadelige bivirkninger.

Her har vi vist foreløbig

in vivo

sikkerhed og effekt af data for én Pim-selektiv hæmmer, pyrrolocarbazolforbindelse DHPCC-9, mens benzo [

cd

] azulen BA-1a viste sig at være for uopløseligt. DHPCC-9 viste ingen cytotoksiske effekter i mus, selv om nogle misdannelser blev påvist i de tidlige fase zebrafisk embryoner. Disse resultater antyder, at i det mindste en kortsigtet inhibering af Pim aktivitet kan være veltolereret hos voksne organismer og at det kan endda være muligt at anvende højere doser af denne inhibitor til at forstørre de observerede virkninger. Det kan også være fordelagtigt at kombinere Pim inhibering med andre behandlinger, der påvirker celleoverlevelse eller motilitet.

Data fra cellebaserede sårhelende forsøg indikerer, at DHPCC-9 er i stand til at blokere motilitet af PC-3 prostatacancerceller [ ,,,0],6]. Som også vist i denne undersøgelse, er det ikke blot skyldes nedsat proliferation, eftersom cellelevedygtighed ikke er væsentligt reduceret i løbet af 24 timer såret recovery opfølgningsperiode.