PLoS ONE: Somatiske LKB1 Mutationer Fremme Livmoderhalskræft Progression

Abstrakte

Human Papilloma Virus (HPV) er den ætiologiske agent for livmoderhalskræft. Endnu, infektion med HPV er ikke tilstrækkelig til at forårsage livmoderhalskræft, fordi de fleste inficerede kvinder udvikler forbigående epitel dysplasier som spontant relatere. Progression til invasiv cancer er blevet tilskrevet forskellige vært faktorer som immune eller hormonelle status, da ingen tilbagevendende genetiske ændringer er blevet identificeret i livmoderhalskræft. Således har presserende spørgsmål om det biologiske grundlag for livmoderhalskræft progression forblevet uløst, hæmmer udviklingen af ​​nye behandlingsformer og prognostiske tests. Her viser vi, at mindst 20% af livmoderhalskræft havnen somatisk-erhvervede mutationer i

LKB1

tumor suppressor. Ca. halvdelen af ​​tumorer med mutationer nærede enkelt nukleotidsubstitutioner eller mikrodeletioner identificerbare ved exon-sekventering, mens den anden halvdel husede større monoallelisk eller biallele deletioner påvises ved multiplex ligering probe amplifikation (MLPA). Biallele mutationer blev identificeret i de fleste cervikale cancercellelinier; HeLa, den første humane cellelinie, huser en homozygot 25 kb sletning, der fandt sted

in vivo

.

LKB1

inaktivering i primære tumorer var forbundet med accelereret sygdomsprogression. Median overlevelse var kun 13 måneder for patienter med

LKB1

deficiente tumorer, men 100 måneder for patienter med

LKB1

-Wild typen tumorer (

P

= 0,015, log rank test; hazard ratio = 0,25, 95% CI = 0,083-0,77).

LKB1

er således en stor cervikal tumor suppressor, demonstrerer, at erhvervede genetiske ændringer drive progression af HPV-inducerede dysplasier til invasive, dødelige kræftformer. Desuden

LKB1

status kan udnyttes klinisk til at forudsige recidiv

Henvisning:. Wingo SN, Gallardo TD, Akbay EA, Liang M-C, Contreras CM, Boren T, et al. (2009) Somatic

LKB1

Mutationer Fremme livmoderhalskræft Progression. PLoS ONE 4 (4): e5137. doi: 10,1371 /journal.pone.0005137

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Februar 20, 2009; Accepteret: 10 Marts 2009; Udgivet: 2 April, 2009

Copyright: © 2009 Wingo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret gennem Sidney Kimmel Translationelle Science Awards til DHC, KKW, NB, og NES, en NIH NRSA F31 stipendium til CMC, en ung Investigator Award fra American Cancer Society /UT Southwestern Simmons Comprehensive Cancer center til DHC, og National center for forskningsressourcer (K26RR024196) (DHC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er blandt de mest almindelige kræftformer i hele verden, med over 500.000 nye tilfælde og 250.000 dødsfald hvert år. I udviklingslandene, livmoderhalskræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald hos kvinder [1]. Infektion af cervikale epitelceller med en overførbar agent-Human Papilloma Virus (HPV) -er nødvendig for udvikling af livmoderhalskræft, som HPV-DNA-sekvenser kan påvises i 99% af cervikale tumorer [2], [3]. Infektion med “høj-risiko” HPV-undertyper initierer tumorprogression ved ophævelse cellecykluskontrol og apoptose checkpoints gennem de virale oncoproteiner E6 og E7, som inaktiverer p53 og RB tumor suppressor veje henholdsvis [2]. Dette fører til dannelsen af ​​noninvasiv (

in situ

) livmoderhalskræft dysplasier kendt som High-grade Pladecellekræft intraepitelial Læsioner eller HSILs) [3], [4], [5]. Men disse HPV-inducerede dysplasier er asymptomatiske og mest relatere, hvilket viser, at HPV er ikke tilstrækkelig til at resultere i livmoderhalskræft [2]. Progressionen af ​​livmoderhalskræft dysplasier til invasive, dødelige livmoderhalskræft er blevet tilskrevet forskellige faktorer såsom immun, hormonelle, og ernæringstilstand, eller co-infektion med andre seksuelt overførte midler, men understøttende data har været tvetydige [2]. Insertionsmutagenese ved HPV er anden foreslået tumorfremmende mekanisme, men nylige undersøgelser har ikke understøttet denne hypotese [6]. Ingen fælles, tilbagevendende genetiske ændringer, der samarbejder med HPV for at fremme livmoderhalskræft progression er blevet identificeret siden Harald Zur Hausen først identificeret HPV som den kausale overførbare agent for livmoderhalskræft over tredive år siden [7]. Således har det presserende spørgsmål om det biologiske grundlag for livmoderhalskræft progression endnu ikke løst.

kimcellelinje mutationer i

LKB1

tumorsuppressorgen (aka

STK11

) resultat i Peutz-Jegher syndrom (PJS), en arvelig tilstand karakteriseret ved godartede gastrointestinale polypper og en forhøjet ( 15 ×) risikoen for maligne epiteliale cancere på forskellige anatomiske steder [8].

LKB1

genet blev for nylig vist, at gennemgå somatisk mutation i 30% af ikke-småcellet lungekræft [9], [10], hvilket tyder på, at

LKB1

kan spille en bred tumor suppressor rolle. Dette, kombineret med vores seneste resultater, der

LKB1

inaktivering i mus livmoder eller epidermis fremmer aggressiv endometrie og planocellulært karcinom [11], [12] fik os til at udforske den rolle

LKB1

i livmoderhalskræft progression.

Resultater

somatisk-erhvervet

LKB1

Mutationer er fælles i livmoderhalskræft Across Histologiske undertyper

Sekventering af

LKB1

gen i primære cervikale tumorer identificeret somatisk-erhvervet (ikke-kimlinie) mutationer i 8/86 (9%) prøver (tabel 1, tabel S1, figur 1a). Ud over andre resultater, der præsenteres nedenfor, flere observationer hævder, at disse mutationer er som gruppe inaktiverende,

bona fide

kræftfremkaldende mutationer. Først 4/8 tumorer nærede nonsense mutationer, deletioner eller insertioner resulterer i rammeskift og for tidlig terminering. De resterende fire tumorer nærede kinasedomæmemutationer i rester bevaret i hvirveldyr, og to af disse tumorer nærede en kendt PJS mutation (p.Arg304Trp), der ophæver LKB1-aktivitet [13], [14], [15]. Endelig kun 1/9 kodning varianter var af germlinie oprindelse, vs. 7/7 kodende varianter, en forskel, der er statistisk signifikant (p = 0,0014, Fishers eksakte test), da enkelt kønscellelinie kodning variant

c.2077C G Hotel (p.Phe354Leu) er en kendt ikke-patologisk neutral variant til stede i normale individer [16]. Sekventering identificerede også en homozygot

LKB1

kinasedomæne mutation i livmoderhalskræft cellelinie C4I (figur 1B, tabel S1).

(A) Repræsentative kromatogrammer af primære tumorer. (B) C4I cellelinie. Lavere paneler, kontrol DNA-prøver fra hver patient (for C4I, humant perifert leukocyt DNA). Vildtype-sekvenser er vist nedenfor. Kromatogrammer repræsenterer fremad streng undtagen tilfælde # 41, hvor reverse komplement er vist at mere tydeligt at illustrere sletningen. Mutationer er heterozygote medmindre andet er angivet. (C)

LKB1

deletioner i primær cervikale tumorer ved MLPA. Bars = relativ signalintensitet pr probe. Seksten prober (sort) svarer til

LKB1

locus på kromosom 19. Probe id’er vist nedenfor. Probes 0.9M5 ‘og 0.6M5’ er ~900 og 600 kb 5’af locus (telomert), mens 10M3 ‘er ~10000 kb 3’ (centromerregionen); resterende 13 sonder svarer til

LKB1

kodende /kodende exoner. Hvide søjler svarer til tilfældigt udvalgte sonder fra andre kromosomer.

Selvom én lille (26 bp)

LKB1

sletning repræsenterer et fuldstændigt tab af funktion blev identificeret ved sekventering (tabel S1, figur 1A), ville større sletninger have været savnet. For systematisk at screene for sletninger, blev multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) for alle 10

LKB1

exons og tre flankerende sonder ansat. Ud fra følgende betragtninger normale menneskelige DNA kontrolprøver (n = 3) konsekvent viste tilsvarende signalstyrker for alle sonder, MLPA identificeret særskilt

LKB1

deletioner i 10/86 tumorer (tabel S1, figur 1C). I fem tumorer, deletioner syntes at være homozygote fordi signaler fra tilgrænsende prober blev reduceret med 50% (figur 1C, sager 60 og 22); residuale signal i disse tilfælde afspejler sandsynligvis stromal kontaminering. Af tumorer med tilsyneladende heterozygote deletioner, man også indeholdt en signifikant mutation identificeret ved sekventering (sag 41, som huser en 26 bp deletion, tabel S1). Disse resultater er i overensstemmelse med de menneskelige og mus undersøgelser, der viser, at selv om tabet af den anden allel kan accelerere tumor progression, mutation af et enkelt

LKB1

allel er i sig selv tumorigen (dvs.

LKB1

kan være haploinsufficient ) [9], [17]. Det er imidlertid også muligt, at nogle mutationer ikke blev opdaget, eller at forurening stromale førte til en undervurdering af homozygositet. Sammenfattende biologisk signifikant

LKB1

mutationer, herunder deletioner karakterisere mindst 20% (17/86) af invasive livmoderhalskræft. Kun ét tilfælde i vores undersøgelse (sag 20, der husede en somatisk-erhvervet

LKB1

mutation) blev diagnosticeret som en minimal-afvigelse adenocarcinom (MDA), en sjælden, ekstremt godt-opdelte variant af livmoderhalskræft adenokarcinom i forbindelse med Peutz-Jegher syndrom [18]. Således

LKB1 Salg mutationer i livmoderhalskræft var ikke begrænset til denne sjældne histologisk subtype men var til stede på tværs af de vigtigste histologiske undertyper af livmoderhalskræft-adenocarcinom, pladecellecarcinom, og adenosquamøst carcinom (figur 2, tabel S1) [ ,,,0],4]

(A) Histologi repræsentative tilfælde med

LKB1

mutationer (SCC = planocellulært karcinom, Adeno = adenocarcinom, AdenoSq = adenosquamøst karcinom, MDA = minimal afvigelse adenocarcinom).. Scale bar = 20 mikron. (B) Relativ fordeling af de tre vigtigste histologiske undertyper blandt

LKB1

-mutant (rød) vs.

LKB1

-Wild type (sort) sager (totaler = 100%) viser, at histologiske spektrum er næsten identisk i

LKB1

null vs. vildtype-tumorer.

sletninger af

LKB1

karakterisere Most livmoderhalskræft cellelinier

primære tumorer er klonalt forskellige og indeholde variable antal celler såsom fibroblaster og lymfocytter, som kan skjule disse og andre analyser. For at overvinde denne begrænsning og få yderligere indsigt ind i rollen som

LKB1

i livmoderhalskræft, et panel af syv livmoderhalskræft cellelinier (HeLa, HT3, SiHa, MS751, CaSki, C33A, og C4I) blev analyseret. Slående, fem af disse syv cellelinjer nærede

LKB1

deletioner, som gjorde HeLa-derivat HeLaS3 (figur 3A). Kun CaSki (figur 3A) og C33A (ikke vist) cellelinier udviste ikke

LKB1

deletioner. Størstedelen (4/7), indeholdt homozygotiske deletioner, mens den ene cellelinie med en heterozygot deletion (C4I) også rummede et punktmutation (figur 1B, tabel S1) rationalisering tab af heterozygositet for denne mutation i C4I. Southern-analyse bekræftede tab af

LKB1 Salg sekvenser (figur 3B) og som forventet, LKB1-protein kunne ikke påvises i cellelinierne huser homozygote deletioner (figur 3C). Denne hyppige homozygoti af

LKB1

mutationer i cellelinjer understreger yderligere den patogenetiske betydning af

LKB1

tab i livmoderhalskræft. Selv om antallet af linier til rådighed og dermed analyseret var lille, er det bemærkelsesværdigt, at flertallet af livmoderhalskræft cellelinjer nærede endelig bialleleic

LKB1

mutationer. Det er også muligt, at etableringen af ​​primære cervikale tumor kulturer er forudindtaget mod

LKB1

deficiente tumorer

(A) MLPA.; se figur 1 for probe detaljer. HeLa, MS751, SiHa og HT3 (og HeLa subklonen HeLaS3) indeholder markante homozygote sletninger. C4I huser et monoallelisk deletion, som det fremgår af sammenhængende prober med halv intensitet signaler. (B) Southern-analyse af kontrol-DNA, ovenfor cellelinier, C33 (ingen deletion af MLPA) og HPV16 /E6E7-immortaliserede endocervikale celler fra en normal patient (Endo = End1 /E6E7; ATCC # CRL-2615). (C) Western-analyse. LKB1 protein ikke påvises i linjer huser homozygote deletioner og faldt med -50% i C4I overensstemmelse med monoallelisk tab.

Fraværet af LKB1 protein i HeLa og HeLaS3 er tidligere blevet bemærket [19].

LKB1

genet er forbundet med en fremtrædende CpG ø, og manglen på LKB1-protein og mRNA i HeLa-celler var tidligere blevet tilskrevet promotor hypermethylering [20]. Vi fandt imidlertid ingen tegn på

LKB1

hypermethylering ved methylering-specifik PCR i enhver cellelinie eller primære tumorprøver. Tværtimod vore data viser, at HeLa og andre cervikale cancercellelinier ikke udtrykker

LKB1

grund af homozygote deletioner, snarere end som følge af epigenetisk inaktivering. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser gennemført i HeLa [19] og andre cellelinjer [9], tvungen udtryk for vildtype LKB1 førte til cellecyklusstop og væksthæmning, demonstrerer, at

LKB1

tab i disse cellelinjer er funktionelt signifikant (data ikke vist).

for at definere sletning breakpoints, PCR reaktioner, der producerer små amplikoner (100-200 bp) blev designet til at spænde over locus (figur 4A, B). Scoring (+/-) forstærkning af hvert produkt, efterfulgt af yderligere PCR-reaktioner for gradvis smallere intervaller baseret på resultaterne af den første scanning tilladt os at kortlægge breakpoints til inden for et par kb (figur 4C). Hver af de fire cellelinjer nærede en særskilt sletning (~20-110 kb) at fjerne dele af

LKB1

højst én andre flankerende locus (

SBNO

2).

(A)

LKB1

locus (kromosom 19p13.3). (B) 140 kb region (Ensembl50, 1.050.000 til 1.190.000) spænder

LKB1

og straks flankerer loci; intervaller = 10 kb. (C) Sletning breakpoints for cellelinjer huser homozygote sletninger. I MS751, deleterede sekvenser er diskontinuerlig, som vist, i overensstemmelse med en mere kompleks omlejring. Pile = PCR-primere for HeLa specifik PCR (400 bp). (D) HeLa specifik PCR (400 bp) bekræfter tilstedeværelsen af ​​deletion i HeLaS3. (E) HeLa intragenisk

LKB1

sletning opstod

in vivo

. Archival Blokkene blev kernehus til DNA-fremstilling. Banerne er følgende: (-) kontrol = ingen skabelon kontrol; tumor = metastatisk adrenal indskud; ikke-tumor = normal adrenal (samme væv blok); (+) Kontrol = HeLa-cellelinje-DNA.

Molecular Cloning af HeLa

LKB1

Sletning Junction og

In Vivo

Oprindelse af sletning

for at klone hele HeLa junction, primere flankerer 5′- og 3′-breakpoints kortlagt ved ovenstående PCR scanning strategi blev designet til at amplificere et specifikt breakpoint produkt. En 2,8 kb junktionel fragment blev klonet og sekventeret, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​en deletion (24.662 bp, fig S1, figur 4C). Begge breakpoints ligger inden Alu gentagelser (Figur S1), hvilket tyder på, at inter-Alu homolog rekombination produceret sletningen. For at skabe en effektiv PCR-analyse for denne sletning, blev primere umiddelbart flankerer de repetitive Alu-sekvenser på hver breakpoint designet (400 bp) (figur S1).

HeLaS3, en klonal derivat af HeLa først rapporteret i 1955 [21 ], nærede den samme

LKB1

sletning (figur 4D), om oprettelse 1955 som en

endestation ante quem

for oprindelsen af ​​sletningen. Men forblev formelt muligt, at

LKB1

sletning opstod

in vitro

efter oprettelsen af ​​HeLa fra en primær cervikal adenokarcinom i 1951 [22]. At løse dette spørgsmål blev HeLa tumor-DNA isoleret fra en arkiv paraffinindlejret væv blok fremstillet i løbet af patientens obduktion på Johns Hopkins Hospital i 1951. En 400 bp HeLa-specifikke PCR-produkt blev amplificeret fra tumoren (figur 4E ), der godtgør, at

LKB1

sletning opstod

in vivo

.

forekomsten af ​​

LKB1

HeLa sletning mens patienten var i live foreslog, at

LKB1

inaktivering kan have bidraget til den notorisk aggressive vækst i hendes tumor både

in vivo

in vitro

(se nedenfor og diskussion). At udforske muligheden for, at

LKB1

mutationer påvirke sygdomsforløbet, blev progressionsfri overlevelsesrater kurver genereret for patienter, hvis tumorer nærede

LKB1

mutationer identificeret ved sekventering eller MLPA (heterozygot eller homozygot) og patienter, hvis tumorer var vildtype for

LKB1

. Slående, den mediane overlevelse var kun 13 måneder for patienter med

LKB1

deficiente tumorer, men 100 måneder for patienter med

LKB1

-Wild typen tumorer (figur 5) (P = 0,015 , log-rank test, hazard ratio = 0,25, 95% CI = 0,083-0,77).

LKB1

deficiente tumorer ikke var mere avanceret på tidspunktet for iscenesættelse, fx 28% af

LKB1

-Wild typen tumorer blev oprindeligt Fase I (begrænset til livmoderen), vs. 43 % for

LKB1

deficiente tumorer eller af højere lønklasse (dvs. mere dårligt differentierede). Således

LKB1

mutationer i cervikale tumorer giver en scene-for-scene øget risiko for tilbagefald, hvilket tyder på, at analyser af

LKB1

status vil være af klinisk anvendelighed i at identificere patienter med øget risiko for sygdom progression. Salg

Kaplan-Meier-kurver viser procentdelen af ​​patienter med sygdomsprogression over tid. Kurverne sammenligne patienter, hvis tumorer var heterozygote eller homozygote for mutationer /sletninger (

LKB1

) vs. patienter uden mutationer /sletninger (WT). Patienter med 1 opfølgende besøg indgik i analysen. P-værdi pr log-rank test.

Diskussion

Vores undersøgelse er den første til at vise, at tilbagevendende genetiske mutationer forekommer i livmoderhalskræft. En tidligere undersøgelse, der undersøgte dette spørgsmål ikke identificere

LKB1

mutationer i sporadiske livmoderhalskræft, men kun minimale afvigelse adenocarcinomer blev analyseret, da målet med undersøgelsen var at fastslå,

LKB1

mutationsfrekvenser i gynækologiske maligniteter vides at være forbundet med PJS. Men denne tidligere undersøgelse, udføres før fremkomsten af ​​MLPA, identificeret LOH af

LKB1

19p13.3 region i 3/8 tilfælde, hvilket tyder på, at

LKB1

sletninger kan have været til stede [ ,,,0],23]. En anden undersøgelse, hvor 26 cervikale tumorer blev analyseret ved en enkelt-streng konformationel polymorfisme analyse identificeret

LKB1

mutationer i kun ét tilfælde [24]. Men denne undersøgelse også i høj grad undervurderet hyppigheden af ​​

LKB1

mutationer i lungekræft, nu vides at forekomme i 20% af tilfældene. Fremkomsten af ​​MLPA nu letter den endelige identifikation af

LKB1

sletninger, som tegner sig for ca. 50% af mutationer i lunge- og livmoderhalskræft (dette og andre undersøgelser) [9]. En anden faktor potentielt tilslører tidligere sekvens analyser er usædvanligt højt GC-indhold af

LKB1

exoniske regioner. Det er vores erfaring, automatiseret basis opkald software overset en høj procentdel af mutationer, hvilket nødvendiggør direkte inspektion af kromatogrammer.

Opdagelsen af ​​en homozygot

LKB1

deletion i HeLa er bemærkelsesværdigt på grund af den historiske betydning af denne cellelinje til biomedicinsk forskning. HeLa blev afledt i 1951 fra en cervikal adenokarcinom. Som den første udødeliggjort humane cellelinie isoleret og med succes foreviget

in vitro

, HeLa stærkt fremskyndet udviklingen af ​​biomedicinsk forskning i anden halvdel af det 20

århundrede [25]. HeLa-celler var usædvanligt i vokser så hurtigt i kultur, men den primære tumor var også aggressiv. Den primære tumor var begrænset til livmoderhalsen på tidspunktet for diagnosen, men det spredt tidligt og bredt på trods aggressiv behandling inklusive strålebehandling, hvilket fører til patientens død blot seks måneder efter den første diagnose [26], [27], [28] . Vores resultater tyder på, at homozygot deletion vi har dokumenteret inden

LKB1

bidraget til denne aggressive vækst fænotype, rationalisere nogle af de usædvanlige funktioner i HeLa primær tumor og cellelinie. I overensstemmelse med denne idé, tvungen udtryk for

LKB1

cDNA i HeLa og andre HeLa-mangelfulde cellelinjer inducerer vækst anholdelse (upublicerede data, se også [9], [19]).

Dette er også den første rapport, der

LKB1

mutationer giver en dårligere prognose for et bestemt human cancer. Men denne observationer er i overensstemmelse med gensplejsede musemodeller af

LKB1

mangel, har konsekvent fundet, at LKB1 tab fremmer invasiv /metastatisk vækst. I

K-ras

drevet musemodeller for lungekræft,

LKB1

inaktivering forudsat den stærkeste samarbejde i form af tumor ventetid og hyppigheden af ​​metastaser (i forhold til klassiske tumorsuppressorer såsom

p53

og

INK4a /ARF

). Det er også bemærkelsesværdigt, at

LKB1

tab i lungen var forbundet med et bredt histologisk spektrum (planocellulære carcinomer til adenocarcinomer), minder om, at

LKB1

inaktivering karakteriserer cervikale karcinomer af forskellige histologiske undertyper [9 ]. Tilsvarende mus med målrettet inaktivering af

LKB1

i endometrie epitel udvikle meget invasive (endnu paradoksalt ekstremt godt differentierede) endometrie adenokarcinomer [11]. Tilsammen er disse og andre resultater [12], [29] hævder, at LKB1 undertrykker invasion og metastase og foreslå, at assays baseret på LKB1 kan vise sig nyttige til prognosticering i en række forskellige cancere. Det vil være af interesse at bestemme, om

LKB1

mutationer er også nyttige prognostisk i andre kræftformer [9].

Det faktum, at 99% af livmoderhalskræft indeholder HPV-DNA [2], som er den tilfældet for de fleste af de livmoderhalskræft cellelinjer, hvor vi demonstrerede homozygote

LKB1

sletninger (f.eks HeLa havne integreret HPV-18-sekvenser) [30] tyder på, at

LKB1

og HPV samarbejder på nogle måde . HPV-infektion fremmer dannelsen af ​​

situ

læsioner i, fører os til at foreslå, at yderligere mutationer i gener, herunder

LKB1

skal konvertere

in situ

dysplasier til invasive karcinomer, en idé i overensstemmelse med de forskellige dyremodeller beskrevet ovenfor. Yderligere undersøgelser vil sige med gensplejsede dyremodeller vil være forpligtet til at forstå det biologiske grundlag for samspillet mellem HPV og LKB1. Det biologiske og biokemiske grundlag af LKB1-medieret carcinogenese stadig at blive fuldstændigt belyst. Fejlagtig regulering af AMPK-mTOR pathway bidrager sandsynligvis LKB1 rolle som tumorsuppressor, men sandsynligvis ikke helt forklare dens rolle ved mediering invasion [31]. Ikke desto mindre kan fejlagtig regulering af mTOR i LKB1-mangel tumorer præsentere muligheder for målrettet terapi (f.eks ved brug af metformin eller rapamycin analoger) hos kvinder, hvis cervikale tumorer har bekræftet

LKB1

mutationer /sletninger, en idé, som fortjener yderligere undersøgelse i fremtiden.

det biologiske grundlag af progressionen af ​​HPV-inducerede precancers er udefineret. Denne undersøgelse præsenterer den første endelige bevis på, at tilbagevendende mutationer i diskrete værtsgener forekomme i invasiv livmoderhalskræft. Selv om andre faktorer sandsynlige indflydelse progression, denne undersøgelse viser, at en proces vil sandsynligvis være stokastisk-nemlig erhvervelse af diskrete genetiske mutationer-drev progression af livmoderhalskræft dysplasier til invasive dødelige carcinomer, og at disse mutationer har potentiale til at tjene som nyttige prognosticators.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board af UT Southwestern og Johns Hopkins hospitaler.

Patient Prøver og cellelinier

Patienterne blev en undergruppe af patienter diagnosticeret med primær livmoderhalskræft ved UT Southwestern University Hospitals mellem 2000-2007 og som forudsat informeret samtykke. Histopatologiske diagnoser blev foretaget pr standard kriterier [4]. Tilstrækkelige mængder af væv fra den primære tumor skulle være til rådighed for at tillade isoleringen af ​​DNA til sekventering og MLPA; ellers var der ingen udelukkelseskriterier. For de fleste patienter, kontrol-DNA blev fremstillet ud fra blod; for et lille antal patienter, for hvem blod var utilgængelig, blev DNA fremstillet fra paraffinindlejrede kontrol væv. Tumor fase blev bestemt pr figo kriterier. Data for sygdomsprogression analyse pr RECIST-kriterierne blev opnået fra opfølgende besøg. Vi anbefaler, at patienter har opfølgningsbesøg hver 3. måned i 2 år, så hver 6. måned i 3 år, og derefter årligt. For progressionsfri overlevelse, tid fra afslutningen af ​​den primære behandling til tilbagefald eller død blev optaget. Data for patienter uden tumortilbagevenden blev censureret på tidspunktet for den sidste opfølgningsbesøg. For HeLa tumor studie blev en paraffin blok opnået fra arkiverne i Johns Hopkins Hospital. Cellelinier blev indkøbt fra ATCC.

DNA Sequencing

DNA blev fremstillet ved anvendelse af Qiagen genomisk DNA kolonner. En to-trins “boost /reden” PCR strategi blev anvendt, hvor det løft reaktion genererede et større fragment anvendt som en skabelon for reden reaktion. Reden produkter blev to retninger sekventeret på ABI 3730 XL sequencere med ABI Big Dye Terminator 3.1 kemi. Base calling blev udført med Agent systemet (Paracel). Sequence tracings blev visuelt at bekræfte nøjagtig variant detektering af base-ringer software. PCR primer sekvenser /betingelser er tilgængelige efter anmodning. Kodning varianter blev bekræftet på gentagne PCR-reaktioner til at udelukke PCR artefakter. Genbank NM_000455 blev brugt som reference cDNA for nukleotidpositioner.

Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) og Southern /vestlige Analyse

MLPA blev udført som beskrevet [9]. For Southern-analyse, 10 ug genomisk DNA var

Xbal

-digested før gelelektroforese, overført til en membran og hybridiseret med radioaktivt mærket-prober (1-2 kb) genereret ved PCR og bekræftet ved udgangen-sekventering. Membranen blev hybridiseret til probe A, underkastet autoradiografi, strippet i kogende 0,1% SDS og rehybridiseret til probe B. Til Western analyse blev proteinekstrakter fremstillet fra adhærente celler ved homogenisering i lysepuffer + proteaseinhibitorer på is, underkastet SDS PAGE og immunoblottedes med et LKB1 antistof (# 3047, Cell Signalling Technology) pr producentens anbefalinger.

Tissue Farvning og Immunhistokemi

Paraffin blok 5 um sektioner blev afparaffineres /hydreret i en ethanol-serien . Objektglas blev farvet med H P63 antistof (# MS1081, LabVision) blev anvendt ved 1:400 med Immpress detection system (Vector).

PCR Scanning til Definer sletninger og HeLa-specifikke PCR

PCR-primere (producerer 100 -200 bp amplikoner) der spænder over

LKB1

region blev designet ved hjælp Primer3. Primerpar fremstille produkter af korrekt størrelse, når normalt humant DNA blev anvendt som template blev anvendt til at kortlægge deletioner ved at score tilstedeværelse /fravær af amplifikation med cellelinie DNA’er som template. Yderligere bivirkninger at give produkter svarende til gradvis mindre intervaller blev designet som nødvendigt. Primer sekvenser og PCR-betingelser er tilgængelige efter anmodning. Archival vævsblok DNA blev fremstillet som beskrevet [32]. Primersekvenser for HeLa-specifik PCR (400 bp) blev For (5′-GGTTGCGATCAAGGCCCCGA-3 ‘) og Rev (5′-GCCTGTGGATGCCACACATG-3’). PCR-betingelserne var 95 ° C × 10 ‘; 94C × 30 “, 58C × 30”, 72 ° C x 30 “(38 cyklusser); 72C × 7 ‘.

Statistisk analyse

Til sammenligning af mutanthyppighed, Fishers (to-halet) uparrede eksakte test blev anvendt. Overlevelseskurver blev dannet i GraphPad Prism5, med sammenligning af kurverne udført med log-rank (Mantel-Cox) test. Den hazard ratio og dens konfidensinterval blev beregnet ved hjælp af Mantel-Haenszel metoden. P-værdier mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

Støtte oplysninger

figur S1.

Kloning og karakterisering af

LKB1

intrageniske sletning breakpoints i HeLa /HeLaS3. En 2,8 kb fragment, der spænder over deletion breakpoint blev klonet fra HeLa DNA ved PCR som beskrevet i teksten; 974 bp af denne sekvens er vist. Sekvens med fed røde bogstaver svarer til Alu repeat hvori den formodede homologe rekombinationsbegivenhed resulterer i HeLa deletion forekom. Nukleotidpolymorfier i de to native Alu sekvenser (ikke vist) var i overensstemmelse med en rekombinationshændelse som viser sig i 5 bp boxed sekvens (dvs. de flankerende G baser var polymorfe og informativ). Sekvens i blå svarer til en unik sekvens i det humane genom (Ensembl 50 19: 1145482 til 1.145.865). Denne sekvens er ~11 kb fra 5′-enden af ​​

LKB1

gen (transskriptionelle start-). Sekvens i grøn (Ensembl 50 19: 1.170.845 til 1.171.115) ligger inden

LKB1

intron 3-4. Pilene viser placeringen af ​​primerne designet til HeLa-specifik PCR (400 bp amplikon). Det genomiske placering af disse primere på det genomiske kort er vist i figur 4C

doi:. 10,1371 /journal.pone.0005137.s001

(0,01 MB PDF)

tabel S1.

Komplet liste over LKB1 mutationer påvises ved sekventering eller MLPA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0005137.s002

(0,01 MB PDF)

Tak

Vi er i gæld til Grover Hutchins (Johns Hopkins University School of Medicine) og Juanita Valenciana (UT Southwestern) for at få hjælp med modellen indkøb og teknisk rådgivning. Vi takker også Jennifer Sayne og UT Southwestern Tissue Management Ressource af Simmons Comprehensive Cancer Center for assistance med modellen indkøb og klinisk informationsstyring.