PLoS ONE: ribosomprotein S27-Ligesom i kolorektal cancer: en kandidat til Forudsigelse Prognoses

Abstrakt

Baggrund

Udvikling og progression af kolorektal cancer (CRC) indebærer en kompleks proces med multiple genetiske ændringer. Tumorsuppressor p53 er i stand til at bestemme skæbnen for CRC-celler. Men rollen som en p53-inducerbare modulator, ribosomale protein S27-lignende (RPS27L), i CRC er ukendt.

Metoder

Her blev forskellen udtryk for RPS27L undersøgt i fæces og colon væv af CRC patienter, til at udforske dens mulige sammenhæng med patientens overlevelse og til at undersøge de cellulære mekanismer bag deres kliniske resultater. Firs mellemliggende fase CRC patienter (42 på trin II og 38 på stadium III) blev inddelt i to grupper efter deres fecal RPS27L mRNA-niveauer. De overlevelsessandsynligheder af grupperne blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Den RPS27L protein i colon væv af trin III patienter med forskellige prognoser blev yderligere undersøgt immunhistokemisk. RPS27L udtryk i LoVo celler manipuleret til at undersøge de mulige cellulære reaktioner in vitro.

Resultater

Forhøjet RPS27L udtryk, i enten afføring eller væv, var relateret til en bedre prognose. In vitro RPS27L-udtrykkende LoVo celler ophørte DNA-syntese og apoptotisk aktivitet, mens udtryk for deres DNA reparation molekyler blev opreguleret.

Konklusioner

Forhøjet RPS27L kan forbedre prognoser for visse CRC patienter ved at forbedre DNA reparation kapacitet af deres colon celler, og kan bestemmes i fæces. Ved at integrere kliniske, molekylære og cellulære data, vores undersøgelse viser, at fækal RPS27L kan være et nyttigt indeks til at forudsige prognoser og vejlede personlige terapeutiske strategier, især hos patienter med mellemliggende fase CRC

Henvisning:. Huang CJ, Yang SH, Lee CL, Cheng YC, Tai SY, Chien CC (2013) ribosomprotein S27-Ligesom i kolorektal cancer: en kandidat til Forudsigelse Prognoser. PLoS ONE 8 (6): e67043. doi: 10,1371 /journal.pone.0067043

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada og University of Ottawa, Canada

Modtaget: Januar 30, 2013; Accepteret: 13. maj 2013; Udgivet: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NSC96-2320-B-281-001-MY3 og NSC100-2320-B-281-001 fra National Science Rådet, og CGH-MR-9919 fra Cathay General Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen og progressionen af ​​colorektal cancer (CRC), en af ​​de mest almindelige dødelige kræftformer, indebærer en kompleks proces med flere genetiske ændringer [1], [2]. Kirurgi er den optimale behandling for CRC patienter på trin II og III, men adjuverende kemoterapi har forbedret prognosen for nogle af disse mellemliggende stadie patienter [3]. Men på trods af behandling, op til 25% af patienterne på trin II og 30-40% i trin III udvikle en fjern metastase eller lokal tilbagefald [4]. Molekylære markører for CRC kan bruges til at forbedre de beslutninger, der træffes vedrørende adjuverende kemoterapi hos disse patienter [5], men forbliver kontroversiel [3].

Når celler støder understreger tumorsuppressor p53 er i stand til at bestemme deres skæbne ved lette reparation og overlevelse af beskadigede celler eller ved at fjerne alvorligt beskadigede celler [6]. CRC tumorigenese har længe været forbundet med funktionelt tab af p53 og de deraf følgende ændringer i ekspression af p53 responsive gener [7]. Den mest undersøgte af disse p53-responsive virkninger er reparation af beskadiget DNA, som menes at være en vigtig bidragyder til tumorprogression [8]. Påvisning af ændringer i ekspressionen af ​​p53-responsive gener er blevet foreslået at tillade identifikation af patienter med høj risiko for tilbagefald og dem, der bør overvejes til adjuverende kemoterapi [9].

En gruppe af ribosomale proteiner med klinisk betydning for mange humane cancere er blevet identificeret, og de gener, der koder de fleste af disse er reagerer på p53 [10], [11]. I virkeligheden, i tillæg til deres rolle ved samling med rRNA at konstruere ribosomer til ny proteinsyntese, er ribosomale proteiner kendt for at have mange extraribosomal roller [12] – [14]. En af de ribosomale proteiner, ribosomalt protein S27-lignende (RPS27L) blev rapporteret at være nedreguleret i afføring og tumorvæv af nogle sene CRC patienter [15], [16]. Denne ribosomale protein og dets homologe protein, RPS27, er blevet anset for at have udvidet roller i cellevækst regulering og DNA-reparation [17], [18]. Desuden har RPS27L blevet identificeret som en p53-inducerbar modulator af celleskæbne [19], [20]. Derfor undersøgte vi den kliniske betydning og cellulære virkninger af RPS27L udtryk og de mulige mekanismer bag sit engagement i de kliniske resultater af CRC.

Vi brugte kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) til at kvantificere heterogenitet fækal RPS27L niveauer i mellemliggende-trins CRC patienter og den differentierede udtryk for RPS27L var korreleret med deres kliniske resultater. RPS27L udtryk i LoVo celler med vildtype p53 blev manipuleret til at undersøge de mulige cellulære reaktioner in vitro ved at analysere ændringerne i cellefaser, deres apoptotiske funktioner og DNA-reparation.

Materialer og Metoder

Fækal og vævsprøver

Solid fækale prøver fra 80 sporadiske CRC patienter (42 ved trin II og 38 på trin III), opnået på Cathay General Hospital eller Taipei Veterans General Hospital, blev indsamlet før operation eller kemoterapi. Fækal total RNA blev fremstillet ifølge vores tidligere rapporterede protokol, anvendelse af en RNA-ekstraktion kit (bioman Scientific, Taipei, Taiwan) med visse modifikationer [21] (Methods S1). De cellefaser i vævsprøverne CRC (n = 68) og patienten overlevelsesdata (n = 71) blev erhvervet fra patienter, hvis fækale prøver blev analyseret. Yderligere seks trin III CRC væv opsamledes til immunhistokemisk farvning for at bestemme ekspression af p53 og RPS27L proteiner. Undersøgelsen blev revideret og godkendt af Institutional Review Board of Cathay General Hospital. De etiske komitéer, Institutional Review Board of Cathay General Hospital, godkendt denne godkendelsesproceduren. Alle deltagere forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Opfølgende data blev opnået prospektivt, og den gennemsnitlige follow-up tid var 39,0 måneder (SD, 3.1, median, 28,3)

lentivirus-baserede RNA-interferens (RNAi) og overekspression af RPS27L

De lentivirale partikler genereret til tavshed RPS27L (NM_015920) (pLK0.1-RPS27L, TRCN0000117608: GCCTAGTACAAAGTCCAAATT), at lukke munden RPS27 (NM_001030) (pLK0.1-RPS27, TRCN0000117596: GAAGAGGAAACACAAGAAG), eller at overudtrykke RPS27L (pLKO AS3w. puro, som indeholder RPS27L cDNA) blev opnået fra National RNAi Core Facility placeret på Institut for Molekylær Biologi /Genomisk Research center, Academia Sinica, Taiwan. pLK0.1-Luc (TRCN0000072246) blev anvendt som kontrol. Forskellige colon cellelinjer blev inficeret med hver lentivirus ved anvendelse af protokollen af ​​RNAi Core Facility. Kort fortalt, 8,5 × 10

5 colon celler blev dyrket i en 10 cm plade i 24 timer, og derefter inficeret med lentivirus ved en infektionsmultiplicitet på 3. Stabile inficerede celler blev selekteret og opretholdt i medium indeholdende 2 ug /ml puromycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ændringer i ekspressionen af ​​target gener blev bestemt med QRT-PCR eller immunblotting (Metoder s1).

Apoptose Assay

Efter 24 timer før VP16 (også kendt som etoposid eller VP-16 -213; en topoisomerase II inhibitor) behandling blev cellerne udsået i 16-brønds kammerobjektglas i en densitet på 5 x 10

3 celler pr. Enten RPS27L-udtrykkende (shLuc) eller RPS27L-mangler (shRPS27L) LoVo-celler blev behandlet med 10 pM VP16 i 48 timer. For at identificere apoptose-positive celler, blev cellerne farvet med en annexin-V /PI dobbelt farvning-assay, med FITC Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Biosciences), ifølge fabrikantens protokol, med en mindre modifikation. Kort fortalt blev cellerne vasket med vaskebuffer (20 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM CaCI

2) efter inkubation i 15 minutter i bindingsbuffer indeholdende 5 pi annexin V-FITC og 5 pi PI ved stuetemperatur i mørke. Yderligere bevis for forekomsten af ​​apoptose blev opnået ved anvendelse af mitokondrielle membranpotentiale (ΔΨ) og spaltes poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Variationerne i ΔΨ blev afsløret via mikroskopisk fluorescens ved hjælp af en MitoLight Apoptose Detection Kit (Millipore, Billerica, MA), der indeholder 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid (JC 1), i henhold til producentens instruktioner, med mindre modifikationer. Først 6 × 10

4 colon celler per brønd blev inkuberet og behandlet med VP16, som beskrevet ovenfor. Efter inkubation i 24 timer med VP16, blev hver prøve behandlet med fortyndet MitoLight reagens (0,2 pi MitoLight og 180 pi deioniseret vand) og 20 pi 10 × inkubationspuffer i 15 minutter ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Den stærkt negativt membranpotentiale i mitochondrierne producerer orange-rød fluorescens fra JC-1, og tabet af de mitochondriale transmembranpotentialeændringer resultater i grøn fluorescens, med tab af den røde fluorescens. Niveauerne af spaltet PARP protein blev bestemt på immunoblots (Metoder s1).

γ-H2AX Foci Formation Assay

Efter 5 × 10

4 LoVo brønd var blevet inkuberet i 24 timer blev DNA dobbeltstrengede pauser (DSB’er) induceret i disse celler med 10 pM VP16. Cellernes evne til at reparere de DSB’er blev bestemt ved farvning dem med anti-γ-H2AX antistof under anvendelse af OxiSelect DNA Double Strand Break Staining Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner, med nogle mindre ændringer. Kort fortalt blev cellerne lov til at komme ved at fjerne DSB inducer for de angivne perioder. De DSBs afslørede (som γ-H2AX foci) optrådte som grøn fluorescens, og kernerne blev visualiseret ved kontrafarvning dem med DAPI (4′-6-diamidino-2-phenylindol). Den grønne fluorescens indikerer γ-H2AX foci blev visualiseret med Adobe Photoshop CS4 Extended (ver 11,0;. Adobe Systems, San Jose, CA) i 100-200 tilfældigt udvalgte celler. En tærskel blev bestemt ved måling tilsvarende niveauer af grøn farve i celler, der var inddrevet over forskellige perioder (0 timer, 2 timer eller 4 timer). Resultaterne er præsenteret som procentdele af celler, der udsender fluorescens over tærskelværdien.

Statistisk analyse

Survival kurver og overlevelsessandsynligheder blev estimeret ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved hjælp af log-rank prøve. Variable med

P

-værdier ≤ 0,1 i de univariate analyser blev medtaget i den flerdimensionale model af Cox proportionel risiko analyse under anvendelse af en angive fremgangsmåde til overlevelse analyse. Forskelle i genekspression og i antallet af de γ-H2AX foci blev sammenlignet ved anvendelse af Students t-test. Statistiske analyser blev udført med SPSS 13.0 software (SPSS, Somers, NY). Den MedCalc statistisk programpakke (MedCalc, Mariakerke, Belgien) blev anvendt til at generere Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver. De viste her data er repræsentative for mindst tre forsøg med lignende resultater, og

P

-værdier. 0,05 anses betydelige

Resultater

kliniske betydning af RPS27L i CRC

niveauet for fækal RPS27L korreleret positivt med procentdelen af ​​CRC celler af mellemliggende stadier CRC patienter i S-fasen (r

s = 0,259;

P

= 0,033, Pearson korrelation prøve). Vi udførte en ROC-kurve analyse og stratificeret patienterne i to grupper ved hjælp af den fækale RPS27L niveau på 0,0014, for hvilken en følsomhed på 0,80 (95% konfidensinterval [CI], 0,28-0,99) og en specificitet på 0,77 (95% CI, 0,66-0,86) blev nået, at forudsige prognosen for patienter. Arealet under ROC-kurven for fækal RPS27L var 0,733 (

P

= 0,017), med en 95% CI af 0,623-0,826 (figur 1A). De overlevelsesrater blev sammenlignet mellem RPS27L

+ (n = 51; ≥ 0,0014) og RPS27L

– grupper (n = 20; 0,0014); den femårige sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) var højere i RPS27L

+ gruppe (97,1% ± 2,8%) end i RPS27L

– gruppe (69,6% ± 12,9%; P = 0,028, log -rank test). Ingen forhold var tydelig mellem RPS27L

+ gruppe og andre klinisk-patologiske parametre (tabel 1). univariate og multivariate Cox proportionel risiko analyser viste imidlertid, at det fækale RPS27L niveau var en uafhængig prognostisk faktor (hazard ratio, 0,086; 95% CI, 0,009-0,852;

P

= 0,036) til DSS af mellemliggende trin CRC patienter (tabel 2). Desuden tre nonrecurrent patienter (fase III) med gunstige prognoser (overlevelse 8 år), der vises intens immunhistokemisk farvning for p53 og RPS27L i vævssnit (figur 1B, patienter 1-3). Tre andre stadie III patienter, der led tilbagefald inden for et år efter operationen og døde efter den første gentagelse (overlevelse 4 år), var også positive for p53 protein i deres tumorceller, men udtryk for RPS27L protein var svag ved den tilsvarende positioner (figur 1B, patienter 4-6).

(A) Klinisk betydning RPS27L mRNA i afføring. Niveauer af RPS27L mRNA blev kvantificeret ved relativt QRT-PCR. Punkterne på Receiver Operating karakteristiske kurve (sort indsat) repræsenterede følsomhed og (1-specificitet) for DSS. Kaplan-Meier estimeret af DSS afhængig RPS27L mRNA-niveauer (RPS27L-, 0,0014, RPS27L +, (0,0014) i fæces fra CRC patienter (B) Protein niveauer af p53 og RPS27L i CRC væv Hver prøve blev farvet med anti-.. p53 og anti-RPS27L antistoffer fra to tilstødende sektioner Ikke-tilbagevendende patienter: patienter 1 til 3, overlevelse 8 år, tilbagevendende patienter:.. patienter 4 til 6, overlevelse 4 år Alle slides blev modfarvet med hæmatoxylin samme. inden for indsatte ved lav forstørrelse (40 ×) blev vist på højere forstørrelse (200 ×). pile, de tilsvarende positioner for hver patient. Vejviser

Translokation af RPS27L i kolorektal cancer Cells

for at undersøge cellulære funktion af RPS27L, vi inficerede LoVo-celler, en vildtype p53-udtrykkende cellelinie fra et stadium, på trin III CRC, under anvendelse af et lentivirus-medieret korte hårnål RNA (shRNA) til effektivt banke ned RPS27L ekspression (shRPS27L) eller en kontrol shRNA (shLuc) (figur S1). immuncytokemisk farvning for endogen RPS27L var positiv i cytoplasmaet af de shLuc-inficerede LoVo celler, men var negativ i cellerne inficeret med shRPS27L (figur 2A) . Det cytoplasmatiske RPS27L blev translokeret ind kerner af 10 uM VP16-behandlede LoVo celler, og den intense farvning for RPS27L protein i kerner er vist i figur 2B. Denne VP16-induceret ændring blev også observeret under immunodetektion af RPS27L i de oprindelige LoVo celler (Figur 2C).

(A) Cellulær lokalisering af RPS27L. RPS27L var immunofarvet i forskellige LoVo celler. (B) Nuklear induktion af RPS27L anvendelse af 10 (M VP16. Arrows i mellemværker (a og b) angivne kondensere nukleare RPS27L-pletter. (C) Immuno-detektion af RPS27L i forskellige kerneekstrakter. Den nukleare ekstrakt blev fremstillet ud fra synkroniserede LoVo celler med VP16 som angivet shLuc, RPS27L-udtrykkende celler… shRPS27L, RPS27L-mangler celler, overRPS27L, RPS27L-overekspression celler Anti-RPS27L antistof, 1:2000

Cellular Virkninger af Down-regulerede RPS27L i tarmkræft celler

Vi næste analyseret cellulære virkninger af RPS27L ved overekspression RPS27L i LoVo celler (overRPS27L) (Figur S1). Lignende regulering celle-cyklus blev observeret i VP16-fri celler (uafhængig af RPS27L ekspression) som rapporteret i tidligere undersøgelser (figur 3A) [22]. Når DNA fra synkroniserede celler blev beskadiget af VP16 i komplet medium, antallet af celler i S og G

2 /M-faser forhøjet med den udtryk for RPS27L (shLuc eller overRPS27L). Men en anden lignende RP,

RPS27

, ændrede ikke størrelsen på S-fasen befolkning, uanset niveauet af

RPS27

udtryk efter VP16 behandling (figur S2). Samtidige målinger af DNA-indholdet og mængden af ​​BrdU-mærkede DNA viste, at der var færre celler med aktiv DNA-syntese blandt RPS27L-mangler celler (21% i shRPS27L) efter behandling med 10 pM VP16 (figur 3B). I modsætning hertil både RPS27L-udtrykkende og RPS27L-overudtrykkende celler havde en højere andel af celler med aktiv DNA-syntese (32% i shLuc og 37% i overRPS27L) under identiske betingelser (figur 3B).

(A ) Cell cyklus regulering. Cell faser blev bestemt efter en angivet VP16 behandling. (B) Celler med nyligt syntetiserede DNA under VP16 behandling. Procentdelen af ​​BrdU-positive celler (blå pletter) blev bestemt efter en angivet VP16 behandling. (C) Annexin-V /PI double-farvning-assay. Pile angivne annexin V-FITC og PI-positive celler. VL, synligt lys; PI, propidiumiodid. Grøn plet, annexin V-FITC; rød plet, PI. (D) Celler med JC-1 plet. Pile angivet den røde granulære mønster af JC-1 aggregation. (E) Immuno-påvisning af PARP-spaltning. Spaltet PARP, 89 kDa; GAPDH, 36 kDa. shLuc, RPS27L-udtrykkende celler; shRPS27L, RPS27L-mangler celler; overRPS27L, RPS27L-overekspression celler.

apoptotiske aktivitet RPS27L i LoVo celler blev vurderet. Kort beskrevet kontrolcellerne (shLuc) var negative for annexin V-FITC. De RPS27L-mangler celler (shRPS27L) indeholdt mere annexin-V-positive celler og viste en sen apoptotisk (eller nekrotisk) stadium, hvor dobbelt positivt farves (annexin V og PI) (figur 3C). Desuden påvistes levende celler, der udtrykker RPS27L med den røde granulære mønster af JC-1 aggregation i celler behandlet med 10 pM VP16 (figur 3D) og øgede niveauer af spaltet PARP blev observeret med stigende koncentrationer af VP16 (figur 3E). I RPS27L-mangler celler, blev denne røde kornet mønster eksisterede ikke, og det højeste niveau af spaltet PARP observeret (figur 3D og 3E).

DNA Repair funktion RPS27L i kolorektal kræftceller

Vi kvantificeret yderligere mRNA ekspression af E2F transkriptionsfaktoren 1 (E2F1), RAD51, og proteinkinasen, DNA-aktiveret, katalytisk polypeptid (PRKDC) for at identificere den rolle, RPS27L i VP16-inducerede DSB’er. I RPS27L-mangler celler, behandling med 10 pM VP16 inducerede en reduktion 63,6% (1.1- til 0,4 gange) i E2F1-ekspression og en reduktion 54,5% (1.1- til 0,6 gange) i RAD51 ekspression (figur 4A). Tilsvarende reduceret ekspression af PRKDC (0.8- til 0,5 gange) blev også observeret under de samme behandlingsmuligheder betingelser. Procentdelen af ​​celler med intens phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) foci faldt efterhånden som reparationstid steg fra 0 til 4 timer, uanset om LoVo celler udtrykte RPS27L (figur 4B). Imidlertid blev en forsinkelse i kinetikken for den faldende intensitet γ-H2AX foci observeret i celler, der mangler RPS27L udtryk. Op til 61% af RPS27L-mangler celler indeholdt en høj tæthed af γ-H2AX foci efter reparation i 4 timer, mens kun 17% af RPS27L-udtrykkende celler var over grænsen tætheden for γ-H2AX foci dengang (figur 4C) .

(A) Relativ udtryk for DNA reparation gener. De mRNA niveauer af

E2F1, RAD51

, og

PRKDC

blev kvantificeret ved hjælp af QRT-PCR følgende celler med angivne VP16 behandling. Den relative ekspression af hvert gen blev beregnet ved at sammenligne den for shLuc celler uden VP16 behandling. (B) Repræsentative billeder af celler med γ-H2AX foci. Celler lodes komme sig ved at fjerne DSBs inducer i 4 timer (100 ×). En tærskel blev bestemt ved at måle tilsvarende niveauer af grøn fluorescens (γ-H2AX foci, afsløret DSBs) mellem shLuc og shRPS27L celler. Mellemværker (200 ×): 1 og 4, γ-H2AX foci (også indikeret tærsklen); 2 og 5, DAPI; 3, fusionere af 1 og 2; 6, fusionerer på 4 og 5. (C) Statistisk forskel på γ-H2AX foci i celler. Celler blev behandlet med 10 pM af VP16 i 1 time og genvindes til angivne tid. Procentdel af 100-200 tilfældigt udvalgte celler, hvis grøn fluorescens var højere end tærsklen blev angivet. shLuc, RPS27L-udtrykkende celler; shRPS27L, RPS27L-mangler celler. Data er gennemsnit ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01. blev udført To til tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Molekylære markører kan udgøre et bedre grundlag for valg af terapi end kliniske og histopatologiske kriterier [23]. Carcinoembryonisk antigen (CEA) og cancer antigen 19-9 (CA19-9) er de mest anvendte markører af CRC [24]. høje niveauer af enten serum CEA eller CA19-9 er imidlertid anses for at indikere en ugunstig prognose i CRC patienter med mellemliggende stadium sygdom [25], [26].

I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på CRC patienter i de mellemliggende stadier af deres sygdom, fordi adjuverende behandling er vigtigt for disse patienter. Vi har tidligere rapporteret, at ekspressionen af ​​talrige RP’er, herunder RPS27L, afveg markant i fæces af CRC patienter; men ingen signifikant ekspression forskel blev fundet for RPS27, et medlem af den samme familie som RPS27L [15]. Vi har nu vist, at patienter mellemliggende fase med øget fækal RPS27L udtryk havde en højere DSS sats og en meget lavere hazard ratio.

I øjeblikket overvåger vi funktionel p53 ved at bestemme den fækale RPS27L status hos patienter med mellemliggende fase CRC. Den kliniske betydning af RPS27L blev ikke kun påvist i fækale prøver, men også i CRC vævsprøver. I mellemliggende trin CRC blev intens RPS27L farvning, med en stigning i p53 protein, i CRC væv fundet i patienter viser længere overlevelse. Men patienter, hvis p53 protein undladt at aktivere ekspressionen af ​​RPS27L havde dårlige prognoser, med tilbagefald og kortere overlevelse. Dette indebærer, at mellemliggende trin CRC patienter med højere RPS27L niveauer, hvad enten i fæces eller væv, har en mere gunstig prognose, og konsekvent udtryk for p53 og RPS27L blev observeret hos disse patienter med bedre prognoser.

Dette er den første rapport, der viser, at RPS27L er en potentiel prognostisk markør for CRC. I vores kliniske prøver, niveauet af fækalt RPS27L korrelerede positivt med procentdelen af ​​CRC-celler i S-fase. Disse kliniske data er i overensstemmelse med vores resultater fra synkroniserede LoVo celler, der udtrykte RPS27L. RPS27L og dets homologe protein, RPS27, kan interagere med p53-MDM2 akse i forskellige celletyper [20]. I den foreliggende undersøgelse, brugte vi RNA-interferens (shRPS27L) at vælte RPS27L ekspression i LoVo celler. Vi fandt, at nogen forskel i RPS27 ekspression blev detekteret fra cellerne med eller uden RPS27L silencing (vores upublicerede data) og ingen konsistent cellulær virkning blev observeret i RPS27L- og RPS27-mangler LoVo celler. Endvidere har shRPS27L ikke påvirke ekspressionen af ​​andre gener, selv dem (klotho, NM_004795, archaelysin familie metallopeptidasen 1, NM_133463) med mRNA sekvenser, der har delvise matches til shRPS27L (figur S3). Faktisk er klotho og archaelysin familie metallopeptidase 1 udtrykkes naturligt i lave niveauer i vores mål CRC cellelinie LoVo (data ikke vist) [27], [28]. Samlet set vores resultater bekræfter, at virkningerne af shRPS27L er specifikke. Desuden blev proteinet sekvensen af ​​RPS27L kontrolleres mod det humane genom i UCSC genom serveren [29]. Tyve-ni proteinsekvenser med forskellige grader af identitet (61,6% -98,8%) til RPS27L blev identificeret, men ingen af ​​disse blev slået ned af shRPS27L, på grund af dens specifikke sekvens. Det understreger endnu en gang, at ingen anden end RPS27L protein kan slået ned af shRPS27L.

Efter bekræftelse af specificiteten af ​​virkningen af ​​shRPS27L, vi spekuleret på, at p53-responsiv RPS27L forårsager anholdelsen af ​​cellerne i S-fasen når det cellulære DNA er beskadiget. Efter DNA-skader og p53 blev induceret ved tilsætning af VP16, BrdU-positive celler i S-fase akkumuleret blandt RPS27L-udtrykkende LoVo-celler. Disse resultater antyder, at RPS27L forårsager celler til at standse i S fase efter aktiv DNA-syntese, og tillader ikke disse celler til at indtaste M-fasen. Observationen af ​​annexin-V-positive og JC-1-aggregerede celler antyder kraftigt, at det DNA-ødelæggende middel, VP16, inducerer en antiapoptotisk virkning i celler, der udtrykker både vildtype p53 og RPS27L. Denne antiapoptotisk effekt blev også afspejlet i de højere niveauer af spaltet PARP i RPS27L-mangler celler. Aktiveringen af ​​PARP er også vigtigt for regulering af mange cellulære processer, herunder DNA-reparation og celledød [30].

Men den aktive DNA-syntese og antiapoptotisk effekt observeret, selv når det cellulære DNA blev beskadiget, synes uforenelig med vores kliniske data, hvilket indikerer, at patienter med højere niveauer af RPS27L ekspression har en mere gunstig prognose. Vi hypotesen, at nonapoptotic celler med beskadiget DNA skal adgang til en egnet metode til DNA DSB-reparation, og at målretning DNA reparation proteiner bør i vid udstrækning anvendes i behandling af kræft [31]. Dette kan illustreres ved kvantificering af to DNA DSB-reparation gener, RAD51 og PRKDC [32], og et gen, som koder for en komponent af reparation komplekser, E2F1 [33]. Deres reducerede ekspression faldt sammen med RPS27L knockdown efter behandling med lavdosis VP16. Dette stemmer overens med de resultater, E2F1 spiller en funktionel rolle i at undertrykke apoptose og fremme DNA-reparation in vivo efter DNA beskadigelse [34]. Følgelig er RPS27L kræves til at undertrykke apoptose og til DNA DSB-reparation i colon celler, der udtrykker vildtype-p53. Desuden kan VP16-inducerede DSBs inducerer akkumulering af RPS27L protein i kernerne i LoVo celler. Dette antyder, at DNA DSB skade spiller en kritisk rolle ved induktion bevægelsen af ​​RPS27L proteinet fra cytoplasmaet til kernen. Xiong et al. også rapporteret tilsvarende resultater i en undersøgelse af humane lunge adenocarcinom epitelceller [20]. Vi spekulere, at translokation af RPS27L protein kan være afgørende i reguleringen af ​​nogle DNA reparation gener. Dog er yderligere undersøgelser nødvendige for at afklare forholdet mellem RPS27L udtryk og DNA DSB reparation gener.

Det afgørende regulering af RPS27L i DNA DSB-reparation kan også vurderes ved at måle kinetikken af ​​ændringerne i antallet af γ -H2AX foci [35]. I kombination med resultaterne for BrdU inkorporering, foreslår vi, at RPS27L deltager i DNA DSB reparation via en mekanisme af homolog rekombination, fordi de fleste BrdU-positive celler blev begrænset til sen S fase [36]. Det svarer til dels til resultaterne af Miquel et al., Som viste, at en stor andel af CRC celler er i stand til at reparere DNA grund af ændringer i en eller flere komponenter af de to vigtigste DNA-reparation mekanismer, herunder homolog rekombination vej [37 ].

konklusioner

Forhøjet p53-responsiv RPS27L ophobning i kernen kan forbedre prognoser for visse CRC patienter, eventuelt gennem sin virkning på DNA-reparation i colon celler. RPS27L ophobning kan observeres i fæces. Ved at integrere kliniske, molekylære og cellulære data, har vores undersøgelse vist, at fækal RPS27L kan være et indeks over prognose i CRC patienter og kan vejlede personlige terapeutiske strategier, især hos patienter med mellemliggende fase CRC.

Støtte Information

Figur S1. Salg Effektive ændringer af RPS27L ekspression ved at foretage lentivirus-medieret eksperimenter i LoVo celler. Stabil RPS27L-udtrykkende (shLuc), RPS27L-mangler (shRPS27L), og RPS27L-overekspression (overRPS27L) LoVo celler blev erhvervet af forskellige lentivirus infektioner. RPS27L, 9 kDa; . GAPDH, 36 kDa

doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s001

(TIF)

Figur S2.

Effekt af RPS27 udtryk på flowcytometri. LoVo celler, som enten tavshed RPS27 (shRPS27) eller inficeret kontrol virus (shLuc) blev behandlet med DMSO eller 10 uM af VP16. Sortering analyser af propidiumiodid (PI) -stained celler ved flowcytometri. Ca. 104 celler i forskellige faser af cellecyklus blev bestemt ved hjælp FlowJo 8.7 software

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067043.s002

(TIF)

Figur S3.

mRNA sekvenser med delvise matches til shRPS27L. shRPS27L var RNA-interferens til at vælte RPS27L udtryk. Hver prik betød den identiske nukleotid med sekvensen for shRPS27L. Intervaller for matchede sekvenser i hver cDNA blev angivet. Ribosomprotein S27-lignende (RPS27L): NM_015920; klotho: NM_004795; archaelysin familie metallopeptidasen 1 (AMZ1):. NM_133463

doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s003

(TIF)

Methods S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s004

(DOC)

Tak

Forfatterne vil gerne takke Drs. Jen-Kou Lin og Shih-Ching Chang (begge fra Institut for Kirurgi, Taipei-Veterans General Hospital), som informerede os de kliniske data for nogle patienter og Dr. Yih-Yiing Wu for hans overlegne støtte i patologi. Vi takker også National RNAi Core Facility på Institut for Molekylær Biologi /Genomisk Research Center, Academia Sinica at give RNAi reagenser, som blev støttet af National Research Program for Genomic medicin Tilskud af NSC (NSC 97-3112-B-001-016) .