PLoS ONE: En syntetisk Lethal Screen Identificerer DNA Reparation Veje, der bevidstgøre kræftceller til at Kombineret ATR Hæmning og cisplatin behandlinger

Abstrakt

DNA skade responset kinase ATR kan være en nyttig cancer terapeutisk target. ATR hæmning synergistisk med tab af ERCC1, ATM, XRCC1 og DNA skade kemoterapeutiske stoffer. Kliniske forsøg er begyndt at bruge ATR-inhibitorer i kombination med cisplatin. Her rapporterer vi den første letalitet skærmen syntetisk med en kombinationsbehandling af en ATR-inhibitor (Atri) og cisplatin. Kombinationsbehandling med Atri /cisplatin er syntetisk dødelig med tab af TLS polymerase ζ og 53BP1. Andre DNA-reparationsveje herunder homolog rekombination og mismatch reparation udviser ikke syntetiske dødelige interaktioner med Atri /cisplatin, selv om tab af nogle af disse reparationsveje sensibiliserer celler til cisplatin som enkeltstof. Vi rapporterer også, at Atri stærkt synergistisk med PARP hæmning, selv i homologe rekombination-dygtige baggrunde. Endelig ATR inhibitorer kunne resensitize cisplatin-resistente cellelinier til cisplatin. Disse data giver en omfattende analyse af DNA-reparation veje, der udviser syntetisk letalitet med ATR-hæmmere, når det kombineres med cisplatin kemoterapi, og vil hjælpe med at guide patienten selektionsstrategier som ATR-hæmmere fremskridt i kræft klinik

Henvisning:. Mohni KN, Thompson PS, Luzwick JW, Glick GG, Pendleton CS, Lehmann BD, et al. (2015) En syntetisk Lethal Screen Identificerer DNA Reparation Veje, der bevidstgøre kræftceller til at Kombineret ATR Hæmning og cisplatin behandlinger. PLoS ONE 10 (5): e0125482. doi: 10,1371 /journal.pone.0125482

Academic Redaktør: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: November 16, 2014 Accepteret: 18 Marts 2015; Udgivet: 12. maj 2015

Copyright: © 2015 Mohni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health [CA102792 til DC, T32CA093240 til KNM, CA95131 til JAP], Susan G. Komen [SAC110030 til JAP, PDF14302198 til KNM] og Breast Cancer Research Foundation [DC]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA-ødelæggende kemoterapeutiske stoffer såsom cisplatin er standard for pleje behandlinger for mange faste tumorer, herunder tredobbelt-negative brystkræft (TNBC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Disse agenter arbejder ved at placere en øget afhængighed af DNA-skader svar til overlevelse og spredning. Mutationer i DNA reparation gener er hyppige i TNBC og NSCLC, og genomiske studier tyder på betydelig genom ustabilitet i en delmængde af TNBC tyder defekter i DNA-reparation [1-5]. TNBC har ofte en god første reaktion på kemoterapi, herunder platin narkotika, men patienterne næsten altid tilbagefald og kan udvikle resistens [6, 7]. NSCLC patienter får platin som en første-line narkotika og typisk overlever mindre end et år [8].

DNA skade responset kinase ATR (ATM- og Rad3-relateret) koordinerer mange af de cellulære reaktioner på DNA-skader ATR er nødvendige for at stabilisere gået i stå replikationsgafler og tillade gaffel genstart efter skade [9]. I mangel af ATR, gået i stå replikation gafler sammenbrud af dobbelte strengbrud, hvilket kan føre til genomiske omlejringer eller celledød [10, 11]. ATR-aktivering er også nødvendigt at bremse cellecyklussen at give tid til reparation, gennem phosphorylering af dets effektor kinase CHK1 [9]. ATR er en væsentlig kinase, og mange cancerceller har en øget afhængighed af ATR at kompensere for onkogen-induceret replikation stress [12-14].

Selektiv ATR inhibitorer er blevet beskrevet af Vertex Pharmaceuticals [15, 16] og AstraZeneca [17] og er i øjeblikket i fase i kliniske forsøg i kombination med DNA skadelige kemoterapi narkotika eller strålebehandling. At identificere, hvor genomisk kontekst ATR hæmmere kan bedst anvendes som en monoterapi vi tidligere gennemført et syntetisk letal siRNA skærmen for at identificere gener, som når inaktiveret sensibiliserede celler til ATR inhibering. Inaktivering af ERCC1-XPF endonuclease samt tab af kendte ATR pathway proteiner og DNA replikationsproteiner stærkt sensibiliserede celler til ATR inhibering [18]. ATR hæmning er også syntetisk dødelig med tab af XRCC1 og ATM samt overekspression af cyclin E [18-21].

ATR hæmning synergistisk med DNA ødelæggende kemoterapi narkotika, såsom cisplatin og gemcitabin til at dræbe kræftceller [15 , 19]. ATR-inhibering har vist effekt i en musemodel af pancreascancer i kombination med gemcitabin, og i patient-afledt lunge tumor xenografter i kombination med cisplatin [16, 22]. Således vil kliniske forsøg omfatter kombinationsbehandlinger med et ATR-hæmmer og cisplatin, gemcitabin, eller etoposid (ClinicalTrials.gov: NCT02157792). Her rapporterer vi den første systematiske siRNA syntetisk letalitet skærm kombinerer ATR hæmning og cisplatin behandling for at søge mere målrettet anvendelse af ATR-hæmmer, når det kombineres med kemoterapi. Som forventet, identificerede vi ATR pathway, DNA replikationsgenerne, og ERCC1-XPF. Der var ingen ekstra fordel at kombinere Atri og cisplatin i enten homolog rekombination (HR) deficiente eller mismatch repair (MMR) deficiente celler. Vi fandt, at tabet af translesion DNA-polymeraser og 53BP1 hyper-sensibiliserer celler til Atri /cisplatin kombinationsbehandling. Da inaktivering mutationer findes i disse gener i kræft, vores data tyder terapeutisk værdi for kombineret Atri /cisplatin i disse indstillinger.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

U2OS og HCT-116 blev opnået fra Stephen Elledge, august, 2002. MDA-MB-468 (HTB-132), HCC1806 (CRL-2335), BT549 (HTB-122), H157 (CRL-5802), og A549 (CCL -185) blev opnået fra ATCC og opretholdt som tidligere beskrevet [18]. Følgende cellelinjer blev beskrevet tidligere: BRCA2 defekte og suppleres VC8 celler [23], HCT-116 + kromosom 3 [24], hec59, og hec59 + kromosom 2 [25]. MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler blev genereret ved kontinuerlig selektion i cisplatin, og opretholdt i medium suppleret med 3 uM cisplatin. De cisplatin-resistente celler blev dyrket uden cisplatin i 7 dage før starten af ​​hvert forsøg til kontrol for virkningerne af cisplatin-behandling. ATR-inhibitor (Atri) VE-821 [19] blev syntetiseret ved Vanderbilt Institute for Chemical Biology Kemisk syntese Facility. PARP-inhibitor (PARPi) BMN673 [26] blev indkøbt fra Selleck Chemicals. Cisplatin blev indkøbt fra Calbiochem.

Syntetisk letal siRNA skærm

Den syntetiske letale siRNA skærm blev udført som tidligere beskrevet [18]. Kort fortalt, vi udnyttet en brugerdefineret siRNA bibliotek målretning 240 kendte DNA-reparation og replikationsgenerne med 4 siRNAs pr gen i en 96-brønds format. U2OS celler blev transficeret med siRNA biblioteket og opdelt i fire 96-brønds plader 72 timer efter transfektion. Celler blev derefter enten venstre ubehandlet eller behandlet med 1 pM Atri, 0,5 pM cisplatin, eller 1 uM Atri og 0,5 uM cisplatin. Cellelevedygtighed blev bestemt efter yderligere 72 timer under anvendelse af Alamar Blue-(Invitrogen). Den procentvise levedygtighed af hver prøve blev bestemt ved at sammenligne lægemidlet behandlede prøve til den ubehandlede prøve for hvert gen til kontrol for eventuelle siRNA-specifikke virkninger på celle vækstrater. Robuste z-scores blev beregnet ved hjælp af median og median absolutte afvigelse af loggen

10 (procent levedygtighed) værdier. Værdierne præsenteres er de gennemsnitlige robuste z-scores fra tre uafhængige transfektioner. Gener udvalgt som udstiller syntetiske dødelige relationer med nogen af ​​de medicinske behandlingsmetoder har mindst 2 siRNA’er med robuste z-scores mindre end -1,3. Den eneste Atri arm af skærmen er tidligere blevet udgivet [18].

RNA-interferens og cellelevedygtighedsassays

Alle siRNA transfektioner blev udført som tidligere beskrevet med 10 nM siRNA og Dharmafect 1 (Invitrogen) [ ,,,0],18]. Følgende siRNA-sekvenser blev anvendt: siREV3L-2 GAAGUUAUCUGGCUGCUUU, siREV3L-4 CAAAGAUGCUGCUACAUUA, si53BP1-2 GGACAAGUCUCUCAGCUAU, si53BP1-3 GAUAUCAGCUUAGACAAUU. Den ikke-targeting siRNA var Qiagen All Star Negativ kontrol. De kortsigtede cellelevedygtighedsassays blev udført som beskrevet tidligere [18]. Kort beskrevet blev celler udpladet i plader med 96 brønde 72 timer efter transfektion med siRNA og derefter behandlet med lægemidler til 72-96 timer som angivet i figurteksterne. Cellelevedygtighed blev sammenlignet med en ubehandlet kontrol efter subtraktion blindprøvebrønd værdier fra alle data. Den maksimale DMSO-koncentration ved den højeste dosis af lægemiddel var 0,01% og havde ingen virkning på cellevækst. Klonogene assays med U2OS celler blev udført som tidligere beskrevet [27]. I alle cellelevedygtighedsassays værdierne repræsenterer middelværdien (n = 3) og Fejlbjælkerne viser standardafvigelsen for ét eksperiment. Alle forsøg blev udført mindst to gange.

Synergy Analyse

Bliss uafhængighed log synergieffekter mængder (iM

2%) blev beregnet med hjælp MacSynergy II og rapporteres på 95% konfidensintervallet for én gentagelse (n = 3) [28]. Toppe på grafen svarer til synergi og jo højere spids jo stærkere grad af synergi. Isobologram analyse blev udført som beskrevet [29, 30]. Fraktionerede inhiberende koncentrationer blev bestemt ved at dividere IC

50 i Atri med en fast koncentration af cisplatin eller PARPi af IC

50 i Atri alene (x-koordinaten). Y-koordinaten er fast koncentration af cisplatin /PARPi divideret med IC

50 af cisplatin /PARPi alene. Det faste diagonal linje på grafen repræsenterer additivitet og værdier under linjen repræsenterer synergi. IC

50 værdier blev bestemt ved hjælp af Prism-version 6.

Immunofluorescensanalyse

Udført og kvantificeres som beskrevet tidligere [27].

Resultater

ATR hæmning synergistisk med cisplatin og resensitizes cisplatin-resistente kræftceller

ATR-hæmmere (Atri) udviser synergi med cisplatin dræbe HCT-116 tyktarmscancerceller tyder kombinationer af Atri og cisplatin kan være nyttige terapeutisk [15, 19] . I overensstemmelse med dette resultat, stigende mængder Atri reducere koncentrationen af ​​cisplatin kræves for at dræbe U2OS osteosarcomceller og begge midler udviser markant synergi i kortfristede rentabilitet assays (Fig 1A og 1B). Synergi er rapporteret i en 3-dimensionel graf med to enkelt-midler (Atri eller cisplatin) afbildet i X- og Z-dimensioner og en Bliss uafhængighed log synergi volumen afbildet i Y-dimensionen. Toppe på grafen svarer til graden af ​​synergi med højere toppe indikerer større mængder af synergi [28]. Synergi blev også evalueret under anvendelse isobologram analyse (Fig 1C). De fraktionerede inhiberende koncentrationer (FIC) af Atri og cisplatin er vist på x-aksen og y-aksen henholdsvis. Værdier beneath optrukne linie repræsenterer synergi. For at bekræfte disse observationer i langsigtede rentabilitet analyser blev U2OS celler behandlet med Atri, cisplatin, eller Atri /cisplatin kombination for 24, 48 eller 72 timer, og fik lov til at danne kolonier i 14 dage (Fig 1D). Ved de anvendte koncentrationer, både Atri og cisplatin-behandling alene lidt reduceret cellernes evne til at danne kolonier. Den Atri /cisplatin kombinationsbehandlingen reducerede kolonidannelse med næsten to størrelsesordener mere end de enkelte behandlinger alene. Der er således stor synergi mellem Atri og cisplatin i langsigtede rentabilitet analyser. Desuden er næsten alle de celledræbende virkning af den kombinerede behandling bibringes i de første 24 timers eksponering, som længere inkuberingstider ikke yderligere reducere kolonidannende evne af cellerne.

(A og B ) U2OS celler blev behandlet med stigende doser af cisplatin eller ATR inhibitor (Atri) alene eller i kombination i 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt med Alamar Blue-og rapporteres som en procentdel af de ubehandlede kontrolceller. Analyse af synergi mellem cisplatin og Atri hjælp Bliss Independence (B) og isobologram analyse (C) som beskrevet i materialer og metoder. (D) U2OS celler blev behandlet med 1 uM cisplatin, 1 pM Atri, eller begge (Atri + Cis); celler blev frigivet i mediet uden stoffer efter 24, 48, eller 72 timer og fik lov til at danne kolonier. (E) Celler blev behandlet med 1 pM cisplatin eller 1 pM Atri for 24 timer, Atri (24 timer) efterfulgt af cisplatin (24 timer) A → C, eller cisplatin (24 timer) efterfulgt af Atri (24 timer) C → A. Fejl barer i alle paneler er standardafvigelse (n = 3).

Næste vi spurgte, om rækkefølgen af ​​behandlingen er vigtigt for synergi. U2OS celler blev enten behandlet med Atri eller cisplatin alene i 24 timer, eller behandlet med Atri i 24 timer efterfulgt af cisplatin i 24 timer eller omvendt (figur 1E). Celler behandlet med Atri, cisplatin, eller Atri efterfulgt af cisplatin udviser en 2-5 gange reduktion i evnen til at danne kolonier. Slående, celler behandlet med cisplatin efterfulgt af Atri udviste en 1000 gange reduktion i deres evne til at danne kolonier. Sammen disse data indikerer, at maksimal synergi observeres, når celler behandles med Atri og cisplatin samtidig, eller når cisplatin behandling forud Atri. Ingen synergi blev observeret, når Atri behandling forud cisplatin.

Den stærke synergi observeret mellem Atri og cisplatin førte os til hypotesen, at Atri kunne resensitize cisplatin-resistente kræftformer. For at teste denne ide, genereret vi cisplatin-resistente MDA-MB-468 triple negativ brystcancer (TNBC) celler ved kontinuerlig trinvis eksponering for stigende koncentrationer af cisplatin (fig 2A). Disse celler blev behandlet med stigende koncentrationer af Atri alene eller i kombination med 0,5 uM eller 3 uM cisplatin (Fig 2B og 2C). Som forventet parentale cellelinje udviste synergi med 0,5 pM cisplatin og blev fuldstændig dræbt af 3 uM cisplatin (Fig 2D). Den cisplatin-resistente cellelinje udviste ingen synergi med 0,5 pM cisplatin men gjorde udviser synergi med 3 uM cisplatin, om end ikke til niveauet af de parentale celler (Fig 2e). Således ATR inhibering kunne resensitize cisplatin-resistente celler for cisplatin, men disse celler var stadig ikke så følsomme som de parentale celler. I disse eksperimenter blev synergi observeret, når dosis af cisplatin begynder at have en effekt på cellelevedygtighed (5-10 procent reduktion i levedygtighed) og maksimal synergi blev observeret, når dosis af cisplatin reducerede cellelevedygtigheden med 25-50 procent af den ubehandlede kontrol. Uventet, cisplatin-resistente cellelinje var en smule mere følsomme over for ATR-inhibitoren alene tyder på, at den mekanisme af resistens over for cisplatin gjort cellerne mere afhængige af ATR-signalering for overlevelse.

(A) MDA-MB-468 (468) og MDA-MB-468 cisplatin-resistente (468-CR) celler blev behandlet med stigende doser af cisplatin for 96 timer før måling af cellelevedygtighed med Alamar blue. (B og C) MDA-MB-468 og MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler blev behandlet med Atri alene eller Atri og cisplatin på 0,5 uM (B) eller 3 uM (C) i 96 timer før måling af cellelevedygtighed med Alamar blue . (D og E) Bliss uafhængighed synergi mellem cisplatin og Atri i MDA-MD-468 (D) og MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler (E). Fejl barer i alle paneler er standardafvigelse (n = 3).

Identifikation af syntetiske dødelige interaktioner med Atri /cisplatin kombinationsbehandling

For at identificere genetiske determinanter af den observerede synergi mellem Atri og cisplatin, gennemførte vi tre syntetiske dødelige siRNA-skærme for at søge efter gener, at når udtømt, lysfølsomme celler til Atri eller cisplatin alene samt Atri /cisplatin kombinationsbehandling. Vi anvendte en brugerdefineret siRNA-bibliotek, der indeholder 240 kendte DNA-reparation og replikationsgenerne med 4 individuelle siRNA’er pr gen i separate brønde af 96-brønds plader [18]. U2OS celler blev transficeret med siRNA bibliotek. 72 timer senere hver plade med 96 brønde blev opdelt i fire 96-brønds plader og enten venstre ubehandlet eller behandlet med 1 uM Atri, 0,5 uM cisplatin, eller en kombination af 1 uM Atri og 0,5 uM cisplatin i 72 timer (Fig 3A). Cellelevedygtighed blev målt med Alamar blue, og den procentvise levedygtighed af hver siRNA blev beregnet ved at sammenligne Alamar Blue-værdi af det behandlede siRNA sammenlignet med den ubehandlede siRNA. Denne metode kontrollerer for eventuelle siRNA-specifikke effekter på cellevækst. Det stof doser blev valgt således, at de havde en minimal virkning på cellelevedygtigheden af ​​den ikke-targeting siRNA og havde en maksimal effekt på ATR siRNA styringsknapper til hver plade af skærmen (Fig 3B). Vi har foreslået, at lavere doser af Atri er tilstrækkelig til at dræbe ATR-udtømte celler, fordi mindre Atri er nødvendig til fuldstændigt at inhibere den resterende ATR-proteinet [18]. Alle tre lægemiddelbehandlinger blev analyseret uafhængigt, og den procentvise levedygtighed blev anvendt til at beregne en robust z-score for hvert lægemiddel behandling som beskrevet i materialer og metoder. Skærmen blev afsluttet i tre eksemplarer, og de gennemsnitlige robuste z-scores blev plottet for hver siRNA for hver af lægemiddelbehandlinger (fig 3C-3E). De interne positive kontrol siRNA’er rettet mod ATR og atrip er fremhævet med rødt, og det faste røde linje angiver tærsklen cutoff bruges til at vælge siRNAs. S1 Dataset præsenterer de fuldstændige resultater af alle tre skærme. Gener med mindst 2 siRNA’er som har en robust z-score på -1,3 eller derunder blev udvalgt som udviser syntetiske dødelige relationer. En relativt beskeden robust z-score cutoff blev valgt, da dette er en forudindtaget bibliotek af DNA-skader respons og replikation proteiner, som vi forventer at have en højere frekvens af syntetiske dødelige interaktioner end en tilfældig bibliotek.

(A) Skematisk af siRNA skærmen. U2OS celler blev transficeret med siRNAs og derefter enten venstre ubehandlet eller behandlet med 1 pM Atri, 0,5 pM cisplatin, eller Atri og cisplatin. Cellelevedygtighed blev målt med Alamar blue. (B) levedygtighed af de ikke-targeting (NT) og ATR siRNA kontrol ved hjælp af skærmen betingelser. Værdierne repræsenterer middelværdien ± SD af de tre uafhængige gentagelser af skærmen. (C-E) De robuste z-scores af behandlet sammenlignet med ubehandlet cellernes levedygtighed blev bestemt for hver siRNA i biblioteket for Atri (C), cisplatin (D), og Atri og cisplatin (E). De røde cirkler repræsenterer de 8 unikke siRNA’er rettet mod ATR og atrip stede i biblioteket, og den røde linje angiver en robust z score på -1,3. (F) Sammendrag af overlapningen af ​​syntetiske dødelige relationer med Atri, cisplatin, eller Atri og cisplatin. (G) Komplet liste over gener, der udviser en syntetisk dødelig forhold til Atri, cisplatin, eller Atri og cisplatin. Gener med 2 eller flere siRNA’er med robuste z-scores på mindre end -1,3 betragtes som syntetisk dødelige. single-agent Skærmbilledet Atri er tidligere blevet udgivet og medtaget til sammenligning med de øvrige medicinske behandlingsmetoder [18].

De tre skærme identificerede gener, der udstillede syntetiske dødelige relationer i en eller flere af de kombinationer narkotika og i flere forskellige DNA-reparationsveje (fig 3F og 3G). Den Atri arm af skærmen er tidligere blevet udgivet og medtaget her til sammenligning med kombinationsbehandling skærmbilledet [18]. Som tidligere rapporteret, den største familie af gener identificeret som udviser syntetisk letalitet med Atri alene var ATR pathway gener og DNA-replikation gener, herunder en tidligere urapporteret syntetisk dødelig interaktion med ribonukleotidreduktase (

RRM1

RRM2

). Vi identificerede også kromatin remodelers, fanconis anæmi pathway gener, translesion DNA-polymeraser, og

ERCC1

[18].

ATM

XRCC1

nåede ikke vores cutoff med mere end én siRNA og blev ikke opført på listen af ​​syntetiske dødelige interaktioner. Disse interaktioner tidligere identificeret ved hjælp af null og suppleret cellelinjer samt små molekyle inhibitorer [19, 20]. Det er muligt, at en fuldstændig dæmpning /hæmning er forpligtet til at overholde den syntetiske dødelighed rapporteret og ikke var udført med siRNA bruges i vores bibliotek.

Brug cisplatin som et enkelt middel, vi observerede syntetisk letalitet med HR-gener som forventet da dette er en vigtig mekanisme, der kræves for at reparere cisplatin addukter. Celler, som mangler

ATR

, translesion DNA-polymerase veje, XPF (

ERCC4

),

XAB2

, og

XRCC1

er også overfølsomme over for cisplatin.

Den kombinerede Atri /cisplatin følsomhed skærm blev udført på de samme doser af Atri og cisplatin, der blev brugt i de enkelte narkotika skærme. Denne skærm identificerede også ATR pathway gener og en delmængde af DNA-replikation gener, som sandsynligvis til stede på grundlag af deres syntetisk letalitet med Atri alene. Nye gen-familier, der findes i den kombinerede behandling omfatter fejlparringsreparationsgener, yderligere translesion DNA-polymeraser, XPF (

ERCC4

),

TP53BP1

,

DDB2

, og SOSS-A (

INTS3

). Med kombinationen af ​​Atri /cisplatin behandling,

ATM

,

RAD50

, og

RAD54

L tilgang vores betydning cutoff tærskel med én siRNA for hver giver en z-score mindre end -1,3 og en anden siRNA med en robust z-score mindre end -0,9.

Syntetiske relationer mellem HR eller MFR og Atri /cisplatin

Det er interessant, tab af HR gener forårsage ikke synergi med Atri /cisplatin, selv om det er synergistisk med cisplatin alene. Vi verificerede dette resultat med BRCA2-defekte VC8 celler. Disse celler er ekstremt følsomme over for cisplatin sammenlignet med isogene celler konstrueret til at re-udtrykke vildtype BRCA2 (Fig 4A). Men de er ikke overfølsom over for Atri alene og kombinationsbehandling af Atri /cisplatin resulterede ikke i nogen synergistisk drab ved lave eller moderate cisplatin doser (Fig 4B og 4C). Den store mængde død ses i højdosis cisplatin kombinationsbehandling er næsten alle på grund af den forbedrede toksicitet af cisplatin i HR-defekte celler. Manglen på syntetisk letalitet kan være, fordi hæmning af ATR reducerer effektiviteten af ​​HR, så der ikke observeres nogen yderligere synergi i HR-mangel baggrunde [31].

BRCA2-mangelfuld VC8 celler eller VC8 celler suppleret med en BRCA2 udtryk vektor blev behandlet med Atri, cisplatin, og Atri /cisplatin kombination. (A) Følsomhed af BRCA2-deficiente celler til cisplatin. (B og C) Følsomhed af BRCA2-deficiente celler til Atri alene og Atri med enten 0,05 eller 0,1 uM cisplatin. Cellelevedygtighed blev målt med Alamar blue efter 72 timer og rapporteres som procent af de ubehandlede kontrolceller. Fejl barer er standardafvigelse (n = 3).

Flere MMR gener udstillet syntetisk letalitet med Atri /cisplatin kombinationsbehandling på skærmen. Siden MFR-mangel er et fælles træk ved mange kræftformer, vi søgte at kontrollere, at tumorceller med MMR-mangel er overfølsom over for kombinerede Atri /cisplatin behandlinger. Den coloncancercellelinie HCT-116 er MMR-defekte på grund af manglen på MLH1. Overraskende, når der sammenlignes med HCT-116 + kromosom 3, hvor MLH1 udtryk er blevet restaureret [24], fandt vi ingen forskel i følsomhed over for Atri alene eller kombinationen af ​​Atri /cisplatin i både kortsigtede og langsigtede rentabilitet assays ( fig 5A og 5B). Vi testede også rollen som MFR i HEC59 endometrie kræftceller, der er mangelfuld i MSH2 og dermed ikke udtrykker MSH3- eller MSH6. Disse celler udviste ikke nogen syntetisk letalitet med Atri alene eller kombinationen af ​​Atri /cisplatin sammenlignet med den suppleret cellelinje i både kortsigtede og langsigtede rentabilitet assays (Fig 5C og 5D). Sammen disse data indikerer, at mismatch reparation er ikke en nyttig indikator for syntetisk letalitet med Atri eller Atri /cisplatin kombinationsbehandling. Således flere DNA-reparationsveje udviser nogen syntetisk letalitet med ATR inhibering eller kombinationen af ​​ATR /cisplatin herunder HR og MMR.

(A og C) Celler blev behandlet med stigende doser af Atri alene eller i kombination med 0,5 pM cisplatin i 72 timer. Cellelevedygtighed blev målt med Alamar blå og rapporteret som en procent af de ubehandlede kontrolceller for hver cellelinie. (B og D) Celler blev behandlet med 1 uM Atri, 0,5 uM cisplatin, eller begge (A + C); celler blev frigivet i mediet uden stoffer efter 24 timer og fik lov til at danne kolonier. (A og B) MLH1-deficient HCT-116-celler og HCT-116 celler suppleret med MLH1. (C og D) MSH2-mangelfuld HEC59 celler og HEC59 celler suppleret med MSH2. Fejl barer i alle paneler er standardafvigelse (n = 3).

ATR hæmning er syntetisk dødelig med PARP hæmning

PARP-inhibitorer udviser syntetisk letalitet med tab af HR, og i øjeblikket i kliniske forsøg til behandling af BRCA-mangel tumorer [32-34].

PARP1

,

PARP2

, og

PARP4

var i vores bibliotek og forårsagede ikke syntetisk letalitet med nogen af ​​de medicinske behandlingsmetoder hvilket indikerer, at den genetiske tab af PARP ikke bevidstgøre celler til ATR inhibering. Men ATR blev identificeret som den tredje højeste scoring gen i en skærm på udkig efter syntetiske dødelige interaktioner med PARP hæmning [35] og ATR hæmning sensibiliserede ovariecancerceller til PARP inhibitor Veliparib [36]. PARP-inhibering kan give forskellige resultater sammenlignet med genetisk tab af PARP-gener på grund af de multiple PARP’er i celler og behovet for fastholdelse af PARP komplekser på DNA for celledræbende [34, 37-39]. U2OS celler behandlet med stigende doser af BMN673 signifikant reducerede mængden af ​​Atri behov at dræbe celler og udviste markant synergi over et bredt område af doser i kortfristede levedygtighed assays (Fig 6A-6C). Denne observation var endnu mere udtalt i de lange kolonidannende assays hvor kombinationsbehandling af Atri og BMN673 reducerede cellernes evne til at danne kolonier med over 1000 gange (figur 6D). Lignende resultater blev opnået i HCT-116-celler. Salg

(A) U2OS celler blev behandlet med stigende doser af ATR og PARP-inhibitorer i 96 timer. Cellelevedygtighed blev målt med Alamar blå og rapporteret som en procent af den ubehandlede kontrol. Synergi mellem ATR og PARP-inhibering ved hjælp af Bliss Independence (B) og isobologram analyse (C) som beskrevet i materialer og metoder. (D) Celler blev behandlet med 1 uM Atri, 2 nM PARPi, eller begge (A + P), og celler blev frigivet i mediet uden stoffer efter 72 timer og fik lov til at danne kolonier. Fejl barer i alle paneler er standardafvigelse (n = 3).

Tab af REV3 og 53BP1 sensibiliserer kræftceller til Atri og cisplatin

Yderligere gener identificeret i skærmen som udstille stærk syntetisk letalitet med Atri /cisplatin kombination var

REV3L

og

TP53BP1

.

REV3L

blev den fjerde højest scorende gen (efter

POLD2

,

ATR

, og

atrip

) identificeret. REV3 er den katalytiske subunit af translesion (TLS) polymerase ζ. Den strukturelle underenhed af Pol ζ, REV7, blev også identificeret som syntetisk dødbringende med Atri /cisplatin kombineret med 2 ud af 4 siRNAs. TLS er opdelt i to trin, indsættelse af et nukleotid modsat en beskadiget base og forlængelse efter indsættelsen [40]. Forlængelse efter indsættelsen af ​​flere TLS-polymeraser er ofte udføres af Pol ζ. Denne polymerase-skift begivenhed kræver REV1. 3 af 4

REV1

siRNA’erne forårsagede syntetisk letalitet med Atri /cisplatin (robuste z-score på -1,9, -1,0, og -0,9), men omfanget af to af dem bare gået glip af vores betydning tærskel. Udseendet af begge underenheder af Pol ζ og polymerase kræves for at indlæse det tyder stærkt tab af dette komplekse skaber overfølsomhed over for Atri /cisplatin.

For at validere resultaterne på skærmen og vurdere deres generaliserbarhed vi bankede ned REV3 ved anvendelse af to specifikke siRNA’er i NSCLC cellelinien H157. H157 celler depleteret for REV3 var lidt mere følsomme for høje koncentrationer af cisplatin end celler, der udtrykker ikke-targeting siRNA (Fig 7A). REV3-udtømte celler blev derefter behandlet med stigende doser af Atri alene eller i kombination med cisplatin. Udtømning af REV3 moderat sensibiliserede H157 celler til Atri alene med både siRNA’er (fig 7B og 7C). Øget syntetisk letalitet blev observeret, når celler blev behandlet med Atri /cisplatin kombination (fig 7B og 7C). I modsætning hertil H157-celler transficeret med den ikke-targeting siRNA udviste synergi med Atri og cisplatin kun ved høje doser af Atri /cisplatin kombination (Fig 7D). Celler depleteret for REV3 udviste store mængder synergi over et bredt dosisinterval på Atri og cisplatin (fig 7E og 7F). Maksimal synergi blev observeret ved en dosis af cisplatin lige før det udviser en enkelt-agent drab. Vi observerede også lignende resultater ved kolonidannende assay (S1 Fig) og korte sigt analyser med andre NSCLC og TNBC cancer cellelinjer (S2-S4 Figner).

(AF) H157 NSCLC celler blev transficeret med ikke -targeting siRNA (Sint) eller to siRNAs rettet REV3 (nummer 2 og 4 refererer til specifikke sekvenser, der er beskrevet i de materialer og metoder). Celler blev derefter behandlet med Atri, cisplatin, og Atri og cisplatin. Cellelevedygtighed blev bestemt med Alamar blå og rapporteret som en procent af de ubehandlede kontrolceller. (A) Følsomhed af REV3 Knockdown celler til cisplatin. (B og C) Følsomhed af REV3 Knockdown celler til Atri og Atri med 0,1 uM cisplatin. Bliss uafhængighed synergi mellem Atri og cisplatin i kontrol (D) og REV3 Knockdown celler (E og F). Fejl barer i alle paneler er standardafvigelse (n = 3).

Efter REV3,

TP53BP1

var den næsthøjeste score gen, som ikke var en ATR sti eller en DNA-replikation gen . 53BP1 er en DNA-skade responset protein med roller i dobbelt-strenget pause reparation. 53BP1 forhindrer resektion ved dobbelt-strenget pauser og påvirker sti valg for DNA-reparation ved at fremme ikke-homologe ende sammenføjning [41-43]. 53BP1 er også forpligtet til at beskytte kromosomale skrøbelige steder og andre under-replikerede regioner under mitose for eventuel reparation i den efterfølgende G1 [44, 45].

For at generalisere 53BP1 genetiske forhold med Atri /cisplatin kombination, vi analyserede reduktion af 53BP1 i H157 NSCLC cellelinie. Udtømning af 53BP1 havde en mindre effekt på følsomheden af ​​celler til single-agent cisplatin behandling (Fig 8A). 53BP1-udtømte celler udviste markant følsomhed over for Atri behandling alene med begge testede siRNA’er (Fig 8B og 8C). Cellernes levedygtighed blev yderligere reduceret med den kombinerede behandling af Atri /cisplatin. Som tidligere nævnt kombinationsbehandling med Atri /cisplatin udviste synergi kun ved høje doser af begge lægemidler i celler transficeret med den ikke-targeting siRNA (Fig 8D).