PLoS ONE: Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-4 Triggers Apoptose i livmoderhalskræft celler

abstrakt

Tissue inhibitor af metalloproteinase-4 (TIMP-4) er et medlem af ekstracellulær matrix (ECM) metalloproteinaser inhibitorer, som har pleiotrope funktioner. Imidlertid er TIMP-4 roller i carcinogenese ikke godt forstået. cellelevedygtighed og flowcytometer assays blev anvendt til at vurdere celledød forskelle mellem H-vektor og H-TIMP-4 cellelinjer. Immunobloting og semikvantitativ RT-PCR blev anvendt til at evaluere ekspressionen af ​​apoptose regulatorer. Vi viste, at TIMP-4 har apoptose-sensibiliserende virkning hen imod flere dødsfald stimuli. I overensstemmelse med disse resultater, blev regulatorer af apoptose fra Inhibitors af apoptose proteiner (IAP), FLICE-lignende inhibitorproteiner (FLIP) og Bcl-2 familiemedlemmer moduleres af TIMP-4. Desuden TIMP-4 knockdown resulterede i celleoverlevelse stigning efter serum deprivation, som vurderet ved klonogenisk celle analyser. Denne rapport viser, at TIMP-4 regulerer carcinogenese gennem apoptose aktivering i livmoderhalskræft celler. Forståelse TIMP-4 effekter i tumorigenese kan give ledetråde til fremtidige behandlinger

Henvisning:. Lizarraga F, Ceballos-Cancino G, Espinosa M, Vazquez-Santillan K, Maldonado V, Melendez-Zajgla J (2015) Tissue Inhibitor af Metalloproteinase-4 Triggers Apoptose i livmoderhalskræft Cells. PLoS ONE 10 (8): e0135929. doi: 10,1371 /journal.pone.0135929

Redaktør: Qing-Xiang Amy Sang, Florida State University, USA

Modtaget: Februar 5, 2015; Accepteret: 28 Juli 2015; Udgivet: 20 August, 2015

Copyright: © 2015 Lizarraga et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Tilskud 1616519, 87.855, conacyt.mx. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Apoptose betegner et konserveret type celledød, der er dereguleret i cancer. To vigtige signalveje udløse apoptose i pattedyrceller [1]. Den ydre vej forbinder de udvendige død stimuli i det intracellulære apoptotiske maskineri. Stimuleringen af ​​celledød receptorer ved død ligander udløser dannelsen af ​​død-fremkaldende signaler kompleks (DISC) [2]. Først ved den cytoplasmatiske side af TNFR1, dannelsen af ​​et proteinkompleks består af TRADD, TRAF2, CIAP-1 og RIP kinase finder sted, opkaldt Kompleks I. Dette kompleks derefter rekrutterer og aktiverer IKK kinaser, som igen phosphorylerer IKB-inhibitorer og tillade NFKB-induceret celleoverlevelse. Efterfølgende kan TRADD dissociere fra TNFR1, hvilket fører til dannelsen af ​​komplekset II gennem bindingen af ​​FADD og caspase-8 endelig udløser celledød. I denne model Kompleks I eller Kompleks II aktivering afhænger FLIP (FLICE-lignende inhibitor proteiner) [3]. På den anden side er der den indre vej, hvor apoptotiske stimuli udløse frigivelse af mitochondriale inter-membran space proteiner (ligesom cytochrom c) i cytosolen. Cytochrom c fremmer aktivering af caspaser ved at danne et proteinkompleks består af cytochrom c, Apaf-1, og caspase-9, der fører til aktivering af en caspasekaskaden. Apoptose er stramt kontrolleret af en række modulatorer på forskellige niveauer. Blandt de vigtigste regulatorer er død receptor inhibitor cFLIP (cellulær FLIP), inhibitoren af ​​Apoptose Protein (IAP) familie, og bcl-2-familiemedlemmer [4].

TIMP familien består af fire pleiotropisk proteiner, der modulerer aktiviteten af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP’er) [5]. Som sådan har TIMP’er været forbundet med udvikling af kræft; men disse proteiner viser forskellige og undertiden modsatrettede roller i cellulære processer, såsom MMP-aktivering, apoptose, celleproliferation og invasion [6]. TIMP-4 forøgede ekspression er forbundet med human mammae carcinoma [7], endometrisk carcinoma [8], og gastrisk cancer [9], mens dets ekspression er formindsket i humane gliomer [10] og i Wilms’ tumorer [11]. Vores tidligere arbejde viste, at TIMP-4 udtrykkes

de novo

i livmoderhalskræft med øgede niveauer i mere fremskredne stadier [12]. Disse data antyder en kompleks deltagelse TIMP-4 i udvikling af cancer.

Celledød resistens opstår som følge af ubalance mellem pro- og anti-apoptotiske faktorer, der i sidste ende svare til akkumulering af DNA-mutationer og bestemme responset af tumorceller til behandling [13]. TIMP’er er kendte regulatorer af apoptose i cancerceller [6]. TIMP-3 virker som en potent inducer af celledød i cancerceller, hovedsagelig ved at fremme stabilisering af dødsreceptorer [14]. I modsætning hertil TIMP-1 og TIMP-2 har en beskyttende virkning mod apoptose induceret af forskellige stimuli [15]. Desuden kan TIMP-4 inducerer apoptose i vaskulære glatte celler [16] og transformerede kardiale fibroblaster [17], selv om paradoksalt nok denne faktor har også vist sig at beskytte brystcancerceller fra apoptose [7], hvilket indebærer en vævsspecifik virkning . Men er blevet beskrevet, ingen mekanisme for effekten af ​​TIMP-4 på celledød.

I denne rapport, bemærkede vi, at TIMP-4 opregulering sensibiliserer livmoderhalskræft celler til apoptose gennem modulation af apoptotiske proteiner fra Internetadgangspunkter, FLIP og Bcl-2 familier. Disse resultater afslører nye terapeutiske mål i livmoderhalskræft, der tager højde for de multifunktionelle egenskaber TIMP’er.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

hrTIMP-4 (nr 974 -tsf) og TNF-α (210-TA) var fra R forstand: 5 ‘GCGGAAGCTTCCCAGCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3’ og antisense: 5 ‘CTCCCGAATTCGGCTGAACGATGTCAACAAACTCTTTCC 3’. Denne amplikon blev klonet i pLXSN vektor (CLONTECH, Mountain View, CA, USA). Den nye vektor blev betegnet pLXSN-TIMP-4.

Livmoderhalskræft HeLa-cellelinien blev transficeret med pLXSN og pLXSN-TIMP-4 og selekteret med 800 ug /ml G418 i 4 uger for at skabe stabile cellelinjer. Cellelinierne er i det følgende benævnt H-vektor (pLXSN) og H-TIMP-4 (pLXSN-TIMP-4) og blev dyrket i DMEM. Cervikal cancer cellelinje CaSki blev dyrket i DMEM.

Drug følsomhed

2×10

4 H-vektor og H-TIMP-4-celler blev podet i 24-brønds kammer retter. Efter 24 timer blev cellerne vasket med medium uden FBS (føtalt bovint serum) og inkuberet med TNF-α (10 ng /ml, Sigma-Aldrich, Nr T6674) eller TRAIL (20 ng /ml, R 0,05.

Resultater Salg

TIMP-4 sensibiliserer cervicale cancerceller til apoptotisk celledød

Tidligere arbejde har vist, at TIMP-4 negativt regulerer væksten af ​​forskellige tumorceller [11 , 16, 17]. At analysere, om TIMP-4 regulerer også celledød i cervicale cancerceller, genereret vi en HeLa-cellelinie, der stabilt overudtrykker TIMP-4 (fig 1A, herefter benævnt H-TIMP-4) og kontrol-cellelinie (herefter kaldet H-Vector) . Vi undersøgte effekten af ​​serum sult på H-vektor og H-TIMP-4 cellelinjer. Selv om der blev observeret nogen forskelle i antallet af celler dyrket i 8% serum-suppleret medium, blev færre H-TIMP-4-celler observeret, når serum ikke var til stede fra mediet (fig 1B). Dernæst at teste om disse virkninger var begrænset til vækstfaktor sult, evaluerede vi celledød faktorer fra TNF-familien samt. Ved udsættelse for døden ligander TNF-α og TRAIL, der var færre levedygtige H-TIMP-4 celler end H-Vector-celler (Fig 1C). For yderligere at bekræfte disse resultater blev vildtype HeLa-celler behandlet med hrTIMP-4 i nærvær eller fravær af TNF-α og TRAIL. Vi fandt, at eksponering for hrTIMP-4 alene faldt HeLa celle levedygtighed og potenseret virkningerne af TRAIL og TNF-α (Fig 1D og 1E, henholdsvis).

A, TIMP-4-ekspression analyse ved RT-PCR i H-Vector og H-TIMP-4-celler. B, Grafen viser H-vektor og H-TIMP-4 cellelevedygtighed procenter efter vækst med FBS (8%) eller uden FBS (0%) i 5 dage. C, viser grafen det H-vektor og H-TIMP-4 cellelevedygtighed procenter efter TNF-α (20 ng /ml, 48 h) og TRAIL (20 ng /ml, 7 h) behandling. D viser grafen HeLa cellelevedygtighed analyseret efter hrTIMP-4 (10 nM, 48 h) og TRAIL (20 ng /ml, 7 h) eksponering. E, Grafen viser HeLa-celler levedygtighed efter udløbet af en 48 h præinkubationsperiode med hrTIMP-4 (10 nM) efterfulgt af TNF-α (20 ng /ml, 48 h) stimulation. Stjerner angiver signifikante forskelle med værdier for p = 0,03 i A, p = 0,006 i C og p = 0,003 i D og E.

H-TIMP-4-cellelinje præsenterede også et større antal apoptotiske legemer (fig 2A). For at udforske denne type celledød i detaljer, analyserede vi translokationen af ​​phosphatidylserin fra den indre til den ydre side af plasmamembranen (tidlig apoptose markør) ved flowcytometri efter serum sult og TNF-α behandling. Vi har registreret en større del af H-TIMP-4-celler, der var positive for ekstern plasmamembran phosphatidylserin forhold til H-Vector-celler (tabel 1). Salg

A, H-vektor og H-TIMP-4 cellelinjer blev inkuberet med eller uden TRAIL (20 ng /ml, 7 timer). Cellerne blev observeret ved lysfeltmikroskopi. B, Caspase-9 aktiverings- og PARP spaltningsprodukter fragmenter blev undersøgt ved western blots af H-Vector og H-TIMP-4 celle proteinekstrakter upon FBS sult. p-actin immunoblotting blev anvendt som indlæsning kontrol. C, Caspase-8 og caspase-3-spaltning blev analyseret ved western blot i H-vektoren og H-TIMP-4-celler ved TNF-α behandling. Coomassie gel farvning blev ansat som lastning kontrol. D, Grafen viser levedygtighed procentdele af CaSki celler dyrket med FBS 3% i 6 dage sammen med eller uden hrTIMP-4 (10 nM) (Stjerner angiver signifikante forskelle med værdier af p = 0,0114, un-parret t-test med Welch korrektion ).

TIMP-4 knockdown stiger overlevelse HeLa celler

for at validere vores tidligere data blev to TIMP-4-specifikke shRNAs ansat til at hæmme dens udtryk i HeLa-celler. Den bedste TIMP-4 knockdown i HeLa-celler blev opnået ved en pulje af de to TIMP-4 specifik shRNAs (42% inhibering sammenlignet med kontrol H-Luc celler, som bedømt ved qPCR). Bemærkelsesværdigt blev celleoverlevelse forøget i H-PS-TIMP-4-celler sammenlignet med H-Luc kontrolceller efter 7 dages FBS sult (S1 Fig).

TIMP-4 modulerer caspaseaktivering

Fordi en kaskade af caspaser er ansvarlig for gennemførelsen apoptotisk celledød, evaluerede vi caspaseaktivering ved western blotting. Som vist i fig 2B, fandt vi, at serumudsultning induceret spaltning af caspase-9 i H-Control og H-TIMP-4-celler. Derudover observerede vi spaltning af PARP, et udbredt caspaseaktivering markør. Højere mængder af spaltet caspase-3 og caspase-8, som er ansvarlige for transduktion pathway efter bindingen af ​​dødsreceptor, blev fundet i H-TIMP-4-celler behandlet med TNF-α (figur 2C). Yderligere blev virkningerne af TIMP-4 ikke begrænset til HeLa-cellelinie, eftersom eksponering af CaSki-celler til hrTIMP-4 også forstærkede cytotoksiske aktivitet af serum sult (Fig 2D). Disse resultater understøtter den opfattelse, at TIMP-4 har apoptose-sensibiliserende effekter i livmoderhalskræft celler.

TIMP-4 regulerer apoptose hæmmere fra IAP, cFLIP og bcl-2-familier

Mange signaltransduktion veje er påkrævet til apoptose celledød. På niveauet af celledød receptorer, Flip proteiner regulerer apoptose. Interessant ekspression af mRNA’et for FLIP isoform S var lavere i HeLa-celler efter hrTIMP-4-behandling. I overensstemmelse med dette fund, TIMP-4 overekspression hæmmede isoform FLIP

S proteinekspression til ikke målbart (Fig 3A). I modsætning hertil viste H-TIMP-4-celler højere CIAP-1 og CIAP-2 mRNA-niveauer, mens survivin udtryk ikke blev ændret (Fig 3B).

A, Ophobning af FLIP isoformer ‘mRNA blev analyseret ved RT -PCR i HeLa-celler behandlet med hrTIMP-4 (10 nM, øvre paneler) under det angivne tidspunkt. FLIP proteinekspression blev bestemt ved immunblotting i H-vektoren og H-TIMP-4 cellelinjer (lavere paneler). B, CIAP-1, CIAP-2, og survivin mRNA tilstedeværelse blev undersøgt ved semikvantitativ RT-PCR i H-vektoren og H-TIMP-4 cellelinjer.

Efter aktiveringen af ​​opstrøms initiator-caspaser, mitokondrier frigive flere apoptotiske faktorer i en proces styres af Bcl-2-protein familien [23]. Som vist i fig 4A, H-TIMP-4-celler demonstrerede lavere niveauer af Bcl-2 og Mcl-1, som begge antiapoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien. Derudover blev højere ekspression af de proapoptotiske proteiner Bid og Bax også observeret i H-TIMP-4-celler. Disse forskelle blev afspejlet i isoleret mitokondrier, hvor et fald i Bcl-2-ekspression i celler, der overudtrykker TIMP-4 blev observeret, såvel som en stigning i mitokondrie-associeret Bak (fig 4B).

Bcl-2-familien medlemmer blev evalueret ved immunoblotting i cytosolisk (A) og mitokondriel (B) H-vektoren og H-TIMP-4 cellelysater. Actin og anti-mit antistoffer blev anvendt som henholdsvis lastning kontroller.

For nylig er det blevet vist, at TIMP-3, en potent inducer af apoptose, fremmer død i melanomceller gennem en stabilisering af dødsreceptorer og deraf følgende aktivering af deres apoptotiske-signaleringskaskade gennem caspase-8 [14]. Fordi vi observerede caspase-8 spaltningsprodukter i H-TIMP-4 celler efter TNF-α stimulation (Fig 2C), vi vurderede protein niveauer af TNFRI, RII, og DISC komponenter TRAF2 og TRADD. Som vist i fig 5A, observerede vi et fald i TNFRI, TRADD og TRAF2 proteinniveauer i H-TIMP-4-celler, mens TNFRII niveauer var uændrede. Tilsammen disse resultater viste, at TIMP-4 sensibiliserer HeLa celler til apoptose

in vitro

ved at ændre balancen i centrale apoptotiske aktører til støtte for celledød.

A, TIMP-4 modulerer TNFRI, TNFRII og DISC komponenter TRAF2 og TRADD. Proteiner blev påvist ved immunoblot i H-Vector og H-TIMP-4-celler proteinekstrakter.

Diskussion

TIMP’er er pleiotropiske proteiner, der modulerer celleproliferation, apoptose, MMP aktivitet, celle invasion og angiogenese under tumor udvikling [6]. Imidlertid har deltagelse af TIMP-4 i carcinogenese kun blevet undersøgt i et par vævstyper.

Komplicerer dette scenario, TIMP-4 viser også apoptose-regulerende aktiviteter, der er celletype-specifik. Mens TIMP-4 hæmmer spontan apoptose [7], det potenserer også apoptose i kardiale fibroblaster og vaskulære glatte muskelceller [16, 17]. I lighed med tidligere resultater, i den foreliggende forskning, vi har vist, at TIMP-4 sensibiliserer livmoderhalskræft celler ihjel

in vitro

.

Vi observerede den slående evne TIMP-4, der kan forbedre apoptose i cervikal cancercellelinier efter døden receptorligand (TNF-α og TRAIL) behandling og serum sult. I overensstemmelse, viste vi, at TIMP-4 knockdown forstærker HeLa celler overlevelse efter serum afsavn. Tummalapalli

et al

., Rapporterede, at TIMP-4-induceret apoptose i transformerede kardiale fibroblaster [17], hvilket indikerer en potentiel beskyttende rolle mod carcinogenese i organer, der udtrykker dette molekyle. Fordi TIMP-4 paradoksalt beskytter andre celletyper fra apoptose [7, 24] (Tabel 2), kan en vævsspecifik og en subpopulation virkning udledes, som kan være forårsaget af det komplekse forhold i denne inhibitor med andre proteiner, som vist i

in vitro

undersøgelser [25].

Vores tidligere rapport viste i livmoderhalskræft kræftpatienter, TIMP-4 ekspression stigninger i mere avancerede kliniske stadier [12]. Fordi TIMP-4 kan påvirke følsomheden af ​​kræftceller til kemoterapi, som foreslået af vores nuværende arbejde, ville det være attraktivt at foretage yderligere undersøgelser for at undersøge, om patienter, der udtrykker højere niveauer af denne inhibitor har en bedre eller dårligere prognose.

for at få yderligere indblik i, hvordan TIMP-4 udøver celledød-fremkaldende aktiviteter, vi undersøgt, om TIMP-4 modulerede udtryk for flere apoptose modulatorer. Faktisk bemærkede vi, at TIMP-4 faldt niveauerne af FLIP

S, CIAP-1, CIAP-2, Bcl-2, Mcl-1, Bid, og Bak. Ændringer i cIAPs ekspression kan være en konsekvens af forøgelsen af ​​TNF-α og NFKB-aktivering, som vi har fundet, at TIMP-4 forøger de opløselige niveauer af denne død receptorligand (Lizarraga

et al

.,

upublicerede data

).

Efter aftale med vores resultater, har tidligere arbejde vist, at TIMP-4 regulerer de udtryk for Bcl-2 proteiner i en brystkræft musemodel [7]. Interessant, vi fandt også, at TIMP-4-overudtrykkende celler aktiveret caspase-8 ved TNF-α behandling. Dette kunne have været forårsaget af den markerede nedregulering af flip

S, en isoform af FLIP familien. FLIP

S, en antiapoptotisk protein med en lignende struktur som caspase-8, mangler katalytisk aktivitet og har således evnen til at blokere signal transduktion fra flere dødsreceptorer [26]. I tilfælde af TNF-α, er forholdet mellem FLIP og caspase-8 ved DISC bestemmer celleskæbne [3]. I denne henseende observerede vi, at H-TIMP-4-celler udtrykte lavere niveauer af de TRAF2 og TRADD proteiner. Tilsammen vore data tyder på, at TIMP-4 modulerer DISC proteiner og FLIP ekspression, hvilket kan resultere i øget caspase-8-aktivering og celledød [27].

Som konklusion det nuværende arbejde viser, at TIMP-4 udviser en anti-tumorigen apoptose-sensibiliserende rolle i livmoderhalskræft celler. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme den faktor (er), der bestemmer balancen mellem TIMP-4 pleiotrope aktiviteter. Dog kan vores resultater påvirke udformningen af ​​fremtidige terapeutiske metoder, der tager hensyn til de mange funktioner TIMP’er i kræft.

Støtte Information

S1 Fig. TIMP-4-hæmning øger cellernes overlevelse

Grafen viser H-Luc og H-pS-TIMP-4 celle suvival procenter efter vækst uden FBS 7 dage i tre uafhængige forsøg

doi:.. 10,1371 /tidsskrift. pone.0135929.s001 Hotel (TIF)

tak

Vi takker Dr. Julio Pérez-Carreon (INMEGEN) for hans hjælp i erhvervelse billede og molekylærbiolog Paulina Sanchez for venligt revision af manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud 161.619 fra CONACYT til JM-Z.