PLoS ONE: Alternativ Behandling af U2 Lille Nuclear RNA Giver en 19-22nt Fragment med relevans for Påvisning af ikke-småcellet lungekræft i Human Serum

abstrakt

RNU2 eksisterer i to funktionelle former (RNU2-1 og RNU2-2) skelnes fra hinanden ved tilstedeværelsen af ​​en unik 4-baser motiv. Detaljeret undersøgelse af datasæt opnået fra dyb sekventering af fem humane lunge primære tumorer afslørede, at begge former udtrykker med en høj hastighed en 19-22nt fragment (MIR-U2-1 og -2) fra dens 3′-område og indeholder de 4-baser motiv . Dyb sekventering af uafhængige pools af serumprøver fra raske donorer og patienter med lungecancer afslørede, at MIR-U2-1 og -2 gennemgribende behandles i lungevæv ved hjælp af endonucleolytisk kløfter og stabilt eksporteret til blodet. Derefter mikroarrays hybridiseringseksperimenter af matchede normal /tumorprøver viste en signifikant overekspression af miR-U2-1 i 14 ud af 18 lunge primære tumorer. Efterfølgende QRT-PCR af miR-U2-1 hjælp serum fra 62 lungekræftpatienter og 96 forskellige kontroller viste, at dens ekspressionsniveauerne identificere lungekræftpatienter med 79% sensitivitet og 80% specificitet. MIR-U2-1 ekspression korrelerede med tilstedeværelsen eller fraværet af lungecancer hos patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), andre sygdomme i lungen – ikke kræft, og i raske kontroller. Disse data antyder, at RNU2-1 er en ny bifunktionelt ncRNA der frembringer et 19-22nt fragment, der kan være nyttige ved påvisning lungekræft ikke-invasivt hos højrisikopatienter

Henvisning:. Mazières J, Catherinne C , Delfour O, Gouin S, Rouquette I, Delisle MB, et al. (2013) Alternativ Behandling af U2 Lille Nuclear RNA Giver en 19-22nt Fragment med relevans for Påvisning af ikke-småcellet lungekræft i Human Serum. PLoS ONE 8 (3): e60134. doi: 10,1371 /journal.pone.0060134

Redaktør: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kina

Modtaget: November 23, 2012; Accepteret: 21 februar 2013; Udgivet: 20 mar 2013

Copyright: © 2013 Mazières et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette program mere specielt blod indsamling, blev støttet af en bevilling fra Midi-Pyrénées regionale Råd. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser. Tilknytningen af ​​flere forfattere til Cepheid Company ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker.

Introduktion

udforskning af ikke-protein-kodende RNA (ncRNA) transkriptom i humane celler og væv har længe haft fokus på at profilere microRNA. Fremkomsten af ​​high-throughput Next Generation Sequencing teknologier (NGS) har muliggjort identifikation af nye typer ncRNAer og banede vejen for studiet af deres funktionelle foreninger [1]. De fleste hidtil ukendte ncRNA arter nu opdaget ved hjælp NGS tilgange [2] – [5]. Da funktionelle ncRNAer menes at være beskyttet mod nedbrydning som følge af deres forbindelse med proteiner og emballage til partikler, og derfor er stabile, NGS tilbyder den unikke fordel ved at kunne detektere den samtidige ekspression af tusindvis af funktionelle små RNA transkripter i en enkelt vævstype, afslører et nyt niveau af kompleksitet i produktionen af ​​små ncRNAer i humane celler, væv og organer under forskellige fysiologiske forhold [2], [4], [8]. Den meget høje følsomhed NGS metoder har også gjort opdagelsen af ​​hidtil uopdagede ‘isomirs »fremstillet af post-transkriptionelle redigering mekanismer, single-nukleotid non-skabelon 3’ adenosin eller uracil tilføjelser tjener som et eksempel [6], [7]. Endvidere blev det for nylig vist, at en enkelt ncRNA kan generere forskellige produkter ikke blot ved tilfældig nedbrydning men via specifik tuning af de multiple trin til forarbejdning involverer Dicer [9] eller andre enzymer [10], [11]. Sådanne alternative ncRNA behandling kunne forklare, hvordan en enkelt primær transkript ncRNA kan subserve mere end en funktion, der er analog med den alternative splejsning af præ-mRNA-transkripter. Således er den voksende samling af bi-funktionelle ncRNAer tilbyder et nyt syn på den menneskelige biologi set gennem linsen af ​​NGS.

Disse nyopdagede klasser af små RNA produceret af ncRNAer med en anden funktion deler nogle fælles træk med microRNA. Der er nu omfattende dokumentation for, at flere tRNA’er producerer tRNA-afledte regulatoriske små RNA’er (smRNAs) [9], [11] – [13]. Rigelige små RNA’er 18-22 nt i længde, behandles fra både 5′- og 3′-enderne af modne tRNA’er samt fra 3’trailer regioner af præ-tRNA’er. Det modne 3’befolkning (også betegnet type I) blev fundet at være Dicer afhængige og kompleksbundet med Argonautes 1-4. I modsætning hertil pre-tRNA 3 ‘trailer population (type II) er Dicer uafhængig og tilsyneladende involverer virkningen af ​​RNase Z. Desuden blev fundet type II RNA’er at danne kompleks med Argonautes 3 og 4 og i langt mindre grad til Argonautes 1 og 2 [13]. Koncentreret i nucleoli, flere snoRNAs funktion i behandlingen af ​​ribosomale RNA’er (rRNA) under ribosom subunit biosyntese og montage. Men de fleste af dem fungerer som guide for enzymatisk modifikation af target rRNA og spliceosomal U6 snRNAs på nukleotider udvalgt af RNA: RNA antisense interaktioner [14], [15]. SnoRNAs klassificeres i to grupper, de C /D box snoRNAs som katalyserer 2 ‘O ribose methylering [16], og H /ACA box snoRNAs der indfører pseudouridine ændringer [17]. Nylige bioinformatik analysere af små RNA biblioteker har foreslået, at der findes smRNAs afledt visse af snoRNAs efter forarbejdning [18] – [21]. H /ACA og C /D box afledt ncRNAer bruger divergerende biogenese veje afhængigt af typen af ​​precursor snoRNA der behandles [21] – [23]. H /ACA-afledt ncRNAer er overvejende 20-24 nt i længde og stammer fra 3′-enden. Deres produktion er uafhængig af drosha, men kræver virkning af Dicer [18]. I modsætning hertil C /D afledt ncRNAer er enten 17-19 nt eller 27 nt i længde og overvejende stammer fra 5’-enden [21]. Det store udvalg af deres sekundære strukturer, foreslår Dicer uafhængig behandling baseret på Ago2 endonuklease aktivitet svarende til pre-miR-451 behandling [24]. Flere eksempler på smRNAs afledt fra tRNA eller snoRNA prækursorer er allerede blevet vist at have mulige biologiske funktioner [9], [11], [27], [28].

Short læser fremstilles også fra en lang række af andre typer af strukturerede ncRNAer som 7SL, 5S, Y1 og Y3 [25]. De vault RNA’er der er involveret i multilægemiddelresistens og intracellulær transport hos mennesker er for nylig blevet påvist at producere en gruppe af ~23 nt RNA’er i en drosha-uafhængig men Dicer-medieret behandlingstrin [26]. En af hvælvingen-afledte ncRNAer er bundet til Argonaute proteiner og medierer mRNA spaltning, mimicing det centrale mikro-RNA-lignende funktioner.

Alle disse eksempler viser, at alternativ behandling af ncRNAer kan være en vigtig mekanisme, hvormed funktionel diversitet for ncRNAer opnås, og indebærer endvidere, at det nye lag af regulerende indflydelse og kontrol pålagt af ncRNAer på genekspression kan være grundlæggende for biologi. Man kan kun forestille den potentielle virkning af smRNAs afledt ncRNAer med en anden funktion på ekspressionen af ​​metaboliske mellemprodukter i forskellige fysiologiske tilstande, samt indflydelse på centrale mediatorer af signaltransduktion i ændrede patofysiologiske tilstande, såsom kræft.

i modsætning til snoRNAs og tRNA’er, lidt om snRNAs som er komponenter af den spliceosome kompleks, dirigere nøjagtig fjernelse af intronsekvenser fra præ-mRNA’er [29]. seneste NGS eksperimenter foreslog dog, at spliceosomal snRNAs U1, U2, U6 og U12 akkumulere små RNA-sekvenser [25], mens immunopræcipitation med Argonaute proteiner tilladt identifikationen af ​​Ago-bundne RNA-fragmenter fra U1, U2 og U12 [30]. For nylig blev et fragment af RNU2-1 vist over-udtrykt i pancreas og kolorektale cancere i forhold til normalt væv fra disse organer [31]. For bedre at forstå, om ekspressionen af ​​små ncRNA fragmenter fremkommer ved anden behandling er forbundet med tilstedeværelsen af ​​sygdom, vi målte niveauerne af fragmenterne produceret af snRNA U2 af flere metoder i lungevæv og serum fra patienter med lungecancer og sammenlignede dem med de RNU2 niveauer i serum fra patienter med risiko for lungekræft (patienter med COPD) såvel som normale raske kontrolpersoner. RNU2 er en af ​​de mest højt udtrykt ncRNAer og det er fortrinsvis udtrykkes i lungevæv [32]. Kombinere NGS, microarray hybridisering eksperimenter og QRT-PCR, vi foretaget en detaljeret analyse af RNU2 afledt smRNAs i lunge primære tumorer, parret tilstødende normale lungevæv fra de samme patienter, og serumprøver fra patienter med lungecancer og raske kontrolpersoner, samt som kontrol med andre lungesygdomme – ikke kræft. Resultaterne antyder, at MIR-U2, en 19-22nt produkt af RNU2 alternativ behandling, tillader diskrimination af patienter med lungekræft fra dem med KOL, men ingen kræft, og øger muligheden for, at serumbaserede målinger af MIR-U2 niveauer kan være bruges som en ikke-invasiv, omkostningseffektive, tidlig screening værktøj til at vælge patienter til yderligere evaluering med avanceret billedbehandling diagnostik som spiral CT-scanning.

Materialer og Metoder

kollektionsprøver

Vævsprøver og serumprøver blev indsamlet ved Sygehus Rangueil og Hospital Larrey, Toulouse, Frankrig. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle personer før deres indskrivning i denne undersøgelse, og undersøgelsen blev godkendt af relevante institutionelle anmeldelse bestyrelser. Alle optegnelser blev anonymiseret skal beskytte personoplysninger. Kliniske data blev indsamlet for hver enkelt på tidspunktet for væv eller blod samling. Klinisk fase blev bestemt efter 7

th International Association for Studiet af lungekræft iscenesættelse systemet [33]. For otte patienter ud af atten, som blev opereret for lungekræft, parret primær tumor og distale normale vævsprøver blev indsamlet. Blodet af lungekræftpatienter blev opsamlet på tidspunktet for diagnosen, men forud for tumor resektion eller nogen specifik behandling. Fem ml blod blev opsamlet fra hvert individ i SST-rør og straks behandlet. Rørene blev blandet ved et par inversioner, og derefter sætte ved stuetemperatur i 30 min for koagulation. Rørene blev derefter centrifugeret (1000 g ved 4 ° C) i 10 minutter. Endelig blev serum fraktion alikvoteret i 1 ml rør og straks opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelsestidspunktet. 45 raske kontrolpersoner prøver blev også købt fra Asterand og behandles på samme måde. Vi organiseret denne kohorte i fem grupper. Tre kontrolgrupper indeholder individer uden lungekræft: 1) kun folk uden nogen symptomer på sygdom på tidspunktet for blod uafgjort. De kan betragtes “sunde” individer. 2) patienter med en lungesygdom, som ikke er KOL. Denne gruppe består hovedsagelig af personer, der lider af astma, bronkitis og lungeinfektioner. 3) KOL-patienter uden tegn på lungekræft på tidspunktet for blod uafgjort. Patienter med lungekræft blev delt i to grupper: 1) alle patienter med lungekræft uden nogen KOL symptomer, og 2) patienter, der lider af både en lungekræft og KOL

Ekstraktion-Oprensning af RNA

.

RNA blev ekstraheret fra 0,5 ml serum under anvendelse af Qiagen miRNeasy mini kit, ifølge producentens instruktioner. Et spyd-kontrol (Cel-miR-39) blev tilføjet efter det første denaturering trin.

Arkiverede eller frisk snap-frosne vævsprøver blev homogeniseret ved morter og støder i TRIzol® Reagent Life Technologies (Carlsbad, CA ) og RNA blev yderligere ekstraheret ifølge fabrikantens protokol. Den lille RNA fraktion blev ekstraheret under anvendelse af flash PAGE fraktionatoren (Ambion). Alle microRNA prøver blev fortyndet i RNase-frit vand og opbevaret ved -80 ° C.

Deep sekventering og data behandling

Bibliotek forberedelse og sekventering eksperimenter under anvendelse RNA oprenset fra væv eller serumprøver blev udført ved Fasteris (Schweiz). Kort fortalt, RNA-fragmenter (16-30 nt eller 25-50 nt) blev geloprenset efterfulgt af ligering af enkeltstrenget RNA 3′- og 5’adaptere. En acrylamidgel oprensningstrin udførtes før revers transkription og PCR-amplifikation til at generere DNA-koloni skabelonbiblioteket. cDNA’er blev geloprenset og biblioteket blev kvantificeret før fortynding til 10 nM. De fortyndede cDNA-biblioteker blev derefter sekventeret ved anvendelse af Illumina HiSeq teknologi. Sekvensen læser blev bearbejdet ved en kombination af bioinformatik algoritmer og manuel curation at fjerne de 5′- og 3′-ende adaptere (Tabel S7). Kun læser af 19nt lang eller længere på adapter fjernelse blev godkendt til analyse. 5 ‘og 3’ ender uoverensstemmelser blev trimmet indtil perfekt-match læser. Læser fra de forskellige biblioteker blev normaliseret under anvendelse af det samlede antal læser i hvert bibliotek og udtrykt som læser per million (RPM) med henblik på sammenligning af relative ekspressionsniveauer. Kun læser med en unik match til det humane genom blev anvendt (NCBI bygge 37). Således læser mapping til funktionelle RNU2 gener kort til nogen anden genomisk placering. Ingen interne uoverensstemmelser var tilladt. For højere tillid, blev kun RNA med et minimum af fem RPM i betragtning til yderligere at analysere.

Microarrays hybridiseringsforsøg

Nexterion (Schott) microarray objektglas blev brugt som den faste støtte til microarray. Tilpasset i hus designet oligonukleotider blev spottet i deres overflade. Mærkningen af ​​microRNA blev tilpasset fra Castoldi et al. 2006 [34]. Det mærkede microRNA fraktion blev hybridiseret til de plettede arrays ved hjælp af Discovery hybridisering station (Ventana, Tucson, AZ). De arrays blev scannet ved hjælp af Axon scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og data blev indsamlet ved hjælp GenePix software. Seks i hus konstrueret spike-i interne kontroller blev brugt til at normalisere data. Disse syntetiske RNA kontroller blev tilsat til det totale RNA fraktionen før hybridisering. Alle sekvenser, for hvilke intensiteten af ​​pletten var højere end den gennemsnitlige lokale baggrundsintensitet plus 1,5 gange standardafvigelsen blev kategoriseret som udtrykt microRNA. Statistisk normalisering af data blev gjort ved at beregne Log

2-forhold, hvor Log

2 ratio = gennemsnitlig intensitet signal om duplikerede pletter /median intensitet alle interne kontroller til blokken. Normaliseringen blev gjort per blok for at undgå ikke-homogen mærkning (tabel S4). Microarray data blev analyseret under anvendelse af R biologisk leder pakke [35]. Den relative ekspression af hvert microRNA blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCT metode [36]. Den “MeV 4.8.1” (MultiExperimentViewer) [37] blev anvendt til hierarkisk klyngedannelse analyse, hvor udvalgte miRNA blev grupperet hjælp euklidiske afstand.

QRT-PCR af miR-U2 udtryk

Expression niveauer af mIR-U2-1 blev bedømt ved QRT-PCR under anvendelse af Exiqon brugerdefinerede LNA

TM-primere (Exiqon, Vedbæk, Danmark) ifølge producentens instruktioner. Selv var primerne designet til at detektere isoform UGGAUUUUUGGAGCAGGGAG de Exiqons primere mulighed for påvisning af de andre isoformer (tabel S5 og S6). Eksperimenter blev udført tre gange. På grund af manglen af ​​serum husholdning små ncRNAer, vi normaliseret microRNA fusions det oprindelige volumen af ​​serum (500 pi). En eksogen spike-kontrol (Cel-MIR-39) blev også anvendt for at kontrollere robustheden af ​​resultaterne. Vi beregnede ACt-værdi matrix for hver prøve ved at subtrahere tærsklen cyklusnummer (Ct) value for MIR-U2 fra Ct værdien af ​​Cel-MIR-39. En envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til statistisk analyse sammenligne de prøvepopulationer og kontrolgrupperne. Arealet under kurven (AUC) blev beregnet for modtager-operatør kurver (ROC). Resultater bestemmes ved normalisering til Cel-miR-39 spike-in og normalisering til volumen af ​​serum blev sammenlignet.

Resultater og Diskussion

Lung primære tumorer stærkt udtrykker en 19-22nt ncRNA forarbejdede RNU2

Det menneskelige genom koder to funktionelle U2 snRNA gener, RNU2-1 og RNU2-2 der er placeret på 17q21.31 og 11q12.3 hhv. Den genomiske organisering af de to RNU2 gener adskiller sig radikalt. RNU2-2 er til stede ved en enkelt kopi hvorimod RNU2-1 er organiseret i en klynge af 6 til -30 tandem gentagne kopier spænder 30 til 150 kb. Hver gentagelsesenhed er 6,1 kb lange, indeholder et enkelt RNU2-1 gen og er stærkt konserveret med andre gentagelsesenheder. Selv RNU2-1 afviger i genkopital fra individ til individ, er grupperingerne nedarves stabilt, underlagt dosering kompensation og transskriberes en usædvanlig høj hastighed. For at opdage, hvis små ncRNAer kan effektivt behandles af de to funktionelle RNU2 gener og at afgrænse sådanne produkter præcist vi sekventeret den lille RNA transkriptomet af fem menneskelige lungekræft primære tumorer samt tre puljer af serumprøver, en fra raske donorer og to fra lungecancerpatienter (tabel 1). Sekventering relaterede prøver parallelt minimerer antallet af falske opdagelse af ncRNAer. ncRNAer der er virkelig over-udtrykt ville forventes at blive fundet i flere uafhængige prøver. I et første skridt, vi kortlagt læser sekventeret fra syv biblioteker fremstillet ud fra primære tumorer, fem kort størrelse (16-30nt) og to lange størrelse (25-50nt) direkte på RNA-sekvensen af ​​de funktionelle RNU2 gener. Den RNU2-1 locus på kromosom 17 blev faktisk fjernet fra det humane genom forsamling siden version Build 37 (NCBI Annotation Information Gene ID: 6066, opdateret den 20. Apr 2012). Det store flertal af læser fra de fem korte mellemstore biblioteker kort på en unik beliggenhed mellem positionerne 93 og 114 i RNU2-1 (fig. 1a-b). De mest stærkt udtrykt læser spænder fra 19 til 22nt i længden. Denne RNA-fragment kaldes MIR-U2-1. Bemærkelsesværdigt, lille RNA-sekventering af de tre puljer af serumprøver viste, at MIR-U2-1 er til stede i blodcirkulationen i begge lungecancer patienter og raske forsøgspersoner, afslører dens vidtfavnende ekspression (fig. 1c-d). Disse data tyder på, at miR-U2-1 aktivt eksporteres snarere end passivt frigives i cirkulationen. Kun en delmængde af miRNA har faktisk blevet opdaget uden celler [38] – [41]., Således miR-U2-1 kan repræsentere et ekstra medlem af denne klasse

Små læser påvist i primære tumorer (a) og serumprøver (C). Lang læser påvist i primære tumorer (e). Farvekoden viser læser opdaget antallet af normaliserede i hvert bibliotek. Den røde linje lokaliserer miR-U2. Antallet af læser efter deres størrelse er givet i (b) for de primære tumorer, i (d) for serumprøver.

Blandt befolkningen i læser til stede i primære tumorer som samt i serum, observerede vi en ophobning af RNA-fragmenter startende ved position “A-94” eller “A-95” og slutter ved position “G-113” eller “A-114” (fig. 2). Denne begrænsede antal 5 ‘og 3’ enden læser svarer til en konkret og lille befolkning af varianter eller isomirs, et almindeligt træk ved microRNA. Tilsammen udgør disse miR-U2-1 isomirs udgør mere end 75% af den læser udelukkende matcher til denne region i RNU2-1. Deres ekspressionsniveauer er i området fra kanoniske microRNA’er som miR16, MIR-17, MIR-200A eller MIR-451 (tabel S1). Denne betydelige akkumulering af en unik og præcist spaltede RNA-fragment fra RNU2-1 repræsenterer klare beviser begunstige den hypotese, at specifikke processeringsbegivenheder producere en ny funktionel ncRNA, MIR-U2-1, snarere end den alternative forklaring, at disse er de tilfældige produkter af RNA-nedbrydning. Disse resultater indikerer endvidere, at MIR-U2-1 er beskyttet mod endo- og exo-nukleolytisk RNase-spaltning i kraft af emballage i komplekse nukleoprotein partikler. miR-U2-1 kan også pakket ind i små hindeagtige partikler (exosomer, mikrovesikler, apoptotiske organer) inden eksport til kredsløbet. Størstedelen af ​​microRNA påviselige i serum er nemlig koncentreret i exosomer [42], selv om nogle simpelthen kan være forbundet med proteiner [43]. Tilsammen har dette tyder på, at processeringsbegivenheder producerer MIR-U2-1 repræsenterer fundamentale biologiske processer i den menneskelige.

(a) Angiver læs detekteret sekvensen af ​​hver og gives den normaliserede antal af hver læse for hver tumor prøve. (B) Det samlede antal af hver type read er vist som en histogram. Histogrammer (c) og (d) viser antallet af læser på de forskellige 5 ‘starter og 3’ ender af miR-U2 henholdsvis.

Sekvenserne af RNU2-1 og RNU2-2 generne (187 nt) er stærkt konserverede. Forskellene mellem dem er begrænset til to punktmutationer placeret ved 3′-enden (positionerne 170 og 187) og i 4-basemutation lokaliseret i positionerne 108-111 (fig. S1). Bemærkelsesværdigt, RNU2-2 udtrykker også den samme region med identisk størrelse (fig. S2). Det højere antal læsninger detekteret for MIR-U2-1 i sammenligning med MIR-U2-2 er i overensstemmelse med RNU2-1 videregående genomiske kopital. Heldigvis er 4-basen forskel (GCAG og AAUA i RNU2-1 og RNU2-2 henholdsvis) adskille to U2 gener beliggende inden for miR-U2-sekvenser, tillader diskrimination af de to produkter. Denne polymorfi synes ikke at have nogen mærkbar effekt på behandling, hvilket tyder på lignende biogenese mekanismer for miR-U2-1 og miR-U2-2. forskellene i sekvens mellem miR-U2-1 og miR-U2-2 kan dog afspejle yderligere funktionelle diversificering, måske lette en finjustering af regulerende funktion gennem differentieret mål valg eller proteinfaktorer bindende.

Anvendelse af NGS teknologi er ikke uden faldgruber. Det er velkendt, at små RNA’er utilsigtet kan blive cross-kortlagt til den forkerte genomiske region. RNU2 gener er en kompleks familie med over 50 pseudogener som gør cross-kortlægning fejl udpræget muligt. Det er for nylig blevet rapporteret, at to immunpræcipiteret Argonaute-associerede små RNA af 23nt og 30nt blev kortlagt til to forskellige U2 pseudogener [30], til positionerne 168-187 af U2 pseudogenet kodet af kromosom 6 og til positionerne 95-125 af U2 pseudogen kodet af kromosom 10 hhv. Disse to fragmenter kortlægge den funktionelle U2-1 RNA med 100% identitet. Vi havde tidligere bemærket, at RNU2-1 locus på kromosom 17 faktisk blev fjernet fra Human Genome Sequence Assembly Build 37 (NCBI Annotation Information Gene ID: 6066, opdatere 20-April-2012), og dette er den mest sandsynlige forklaring på, hvorfor disse RNA-fragmenter mappet til disse pseudogener snarere end den funktionelle RNU2 genet selv. Tilsvarende to korte microRNA (19 nt), MIR-1246 og MIR-1290, match MIR-U2-1 med 100% identitet og én mismatch henholdsvis [44]. Kortlægning læser fra vores fem korte biblioteker til de respektive forstadier til disse to microRNA [45], viste utvetydigt, at de to formodede forstadier af MIR-1246 og MIR-1290 er resultatet af falsk-mapping. De to foreslåede modne microRNA’er faktisk afkortet versioner af miR-U2-1. Dette blev indirekte bekræftet for miR-1246, når forsøg på at sekventere dens forløber i det samme væv, hvor miR-1246 blev fundet mislykkedes, hvilket tyder på, at den formodede forløber ikke findes [46]. Dette resultat blev for nylig uafhængigt bekræftet [31]. Vedrørende MIR-1290 er der to mulige genomiske placeringer, der kunne kode det (fig. S3), men i vores eksperimenter det detekteres på samme niveau som baggrundsstøjen tilknyttet sekventeringsfejl (Tabel S2). Vi konkluderer ud fra disse data, at alle resultater relateret til miR-1246 og miR-1290 kan henføres til miR-U2.

En dobbelt funktion for de RNU2 gener

De eksperimentelle resultater diskuteret hidtil foreslå en dobbelt funktion for RNU2-1 og RNU2-2 snRNAs. Deres 5 ‘domæne indeholder mRNA gren stedet involveret i mRNA splejsning, mens deres 3’domæne koder miR-U2, som indeholder Sm bindingssted og kunne være involveret i reguleringen af ​​genekspression. Denne funktionelle opdeling af RNU2 korrelerer med de observerede forskelle i strukturelle træk, der findes i molekylet (fig. 3). 5′-delen indeholder et imponerende antal post-transkriptionelle modifikationer herunder 14 pseudouridylations og 10 methylerede nucleotider [47] – [49]. I modsætning hertil er nogen ændringer identificeret nedstrøms for position 90 i RNU2, og dette domæne indeholder mere omfattende sekundær struktur, især når precursor-sekvensen er inkluderet. Disse slående strukturelle forskelle er sandsynligvis relateret til de respektive differentierede funktioner de to halvdele af RNU2. Selv 5’domænet er tilstrækkelig til at inducere mRNA splejsning in vitro [50] – [52], er der ingen tegn enten fra litteraturen eller fra vores NGS eksperimenter, at enhver del af 5’-området af RNU2 akkumuleres i celler. Dette tyder en alternativ behandling mekanisme, der producerer den fuld-størrelse RNU2 på den ene side, og MIR-U2 på den anden.

Den sekundære struktur foldning af RNU2 precursor er vist. Y steder er fra [49]. Methylerede nukleotider er angivet med symbolet “

m”. Nukleotider i blå og grøn svarer til miR-U2-1 sekvens. De grønne bogstaver lokalisere de fire nukleotid mutation mellem MIR-U2-1 og MIR-U2-2. Sort og røde bogstaver viser RNU2 og prækursorer-specifikke RNU2 sekvenser henholdsvis. Blå pile peger på 5’og 3′-enden af ​​miR-U2 isomirs. Den røde pil viser 3′-enden af ​​RNU2. De to sorte pilespidser peger på de to interne spaltningssteder identificeret i dette arbejde.

For bedre at forstå den mekanisme af miR-U2 splejsning, vi sekventeret to cDNA biblioteker for ncRNAer længere end miR-U2 (25-50nt lang) med henblik på at identificere potentielle mellemprodukter (tabel 1). Antallet af lange læser mapping til RNU2 er betydeligt lavere end den, der ses i de små størrelse cDNA biblioteker, hvilket tyder på, at den mellemliggende af modningen er hurtigt nedbrydes eller trimmet at producere det endelige modne microRNA. Undersøgelse af fordelingen af ​​læser (målt i RPM) langs præ-RNU2 sekvens, vi observerer to toppe svarende til to mindre fragmenter, der akkumulerer (fig. 1e). Som forventet, en top kort til det modne MIR-U2, mens overraskende det andet kort til 3′-enden af ​​det modne RNU2, en region, som ikke frembringer et stabilt ncRNA da vi ikke observere det i vores sekventeringsresultaterne fra den korte Let læseligt biblioteker. Denne RNU2 fragment svarer nøjagtigt til 30nt lange fragment bindende Ago1 [30]. Dette antyder, at nedbrydning af 3′-enden af ​​RNU2 hæmmes af transienten binding af siden, men fordi den beskyttelse, som siden 1 er midlertidig, betyder det ikke anledning til et stabilt ncRNA produkt. Alternativt kan dette produkt blive nedbrudt i lungevæv på grund af fravær af yderligere faktorer, men kunne udtrykkes i andre celletyper eller væv. Det faldende antal læsninger af begge sider af de to toppe afspejler en forringelse af mellemprodukterne med modning ved trimning mekanismer fra begge ender, medens dal mellem dem lokaliserer placeringen af ​​et endonukleolytisk spaltningssted (endo 3 ‘) i nærheden af ​​position 145 inden stamceller IV (fig. 1e og fig. 3). I modsætning hertil har 5’halvdel ikke indeholde fragment beskyttet mod nedbrydning. Desto mindre er en anden endonucleolitic spaltningssted (endo 5 ‘) synes at være placeret mellem positionerne 70 og 80 i stilken IIb.

I betragtning af de forskellige potentielle forarbejdning veje for RNU2, den mest sandsynlige første trin involverer 3′-enden spaltning i stilling 187. Vi kan finde nogen read matcher det ventede specifikke forstadie, hvilket indikerer en tidlig og hurtig begivenhed. Dette første skridt indebærer en basis-skrælle mellem forstadiet specifik sekvens (positionerne 190-200) og positioner 100-110 af RNU2 som er en vigtig strukturelt træk kræves for at lede 3′-enden behandling [53]. Bemærkelsesværdigt, denne base-parring sker med MIR-U2-regionen og skildrer netop de to strukturelt og funktionelt adskilte halvdele af RNU2 (fig. 3). Derefter, i fravær af Ago1-binding, binding af Sm-protein, sandsynligvis i kombination med andre faktorer som U2A ‘og U2B “, kan stabilisere den fulde længde RNU2. I modsætning hertil Ago1 binding til MIR-U2-sekvenser kunne inducere et skift til den endonukleolytisk spaltninger pathway der spalter ved positionerne 70-80 og 145 hhv. Flere og tilstødende små RNA-bindingssteder for Ago1 er kendt for at lette samarbejdsaktiviteter interaktioner, der stabiliserer Argonaute bindende [54]. Da Ago1 har ingen enzymatisk aktivitet, skal en RNase ansættes for miR-U2 modning, på samme måde som miR-lignende ncRNAer fremstillet af snoRNAs og tRNA’er. Endelig er denne forbigående precursor hurtigt trimmet fra begge ender, hvilket gav det modne MIR-U2.

Den eksklusive binding af MIR-U2 til Ago1 [30], i modsætning til de fleste af kanoniske microRNA som binder også Ago2 [ ,,,0],55], tyder på en anden rolle for miR-U2. Selvom overvægten af ​​dataene angiver, at microRNA regulerer genekspression i cytoplasmaet og P-organer, har de fire Argonaute proteiner og en række microRNA er for nylig blevet opdaget i kernen af ​​humane celler. Transport af små RNA’er i kompleks med Ago proteiner ind i kernen afhænger Importin-8 [56]. Denne mekanisme antyder deres mulige samspil med kromatin og åbner spændende alternativ til deres direkte engagement i at påvirke nukleare processer som splejsning eller transskription ved at målrette gen promotorregioner. Interessant flere nye undersøgelser afsløret funktionel adskillelse mellem Ago1 og Ago2 [57] samt en differentiel fordeling i kernen som respons på-promotor-målrettet siRNA under transkriptionel gendæmpning [58] tyder på, at Ago proteiner medierer kernelokalisering af de små RNA’er . Ud over at definere den biologiske aktivitet af små RNA, kan Ago proteiner også definere længden af ​​modne microRNA’er [59].

Dette giver os mulighed for at overveje den mulighed, at miR-U2 kunne spille epigenetiske roller på DNA-niveau hvor det kunne fungere som en regulator af ekspressionen af ​​store kromosomale regioner. Det er faktisk kendt, at mange promotorer af tumorsuppressorgener viser højere niveauer af methylering, hvilket antyder en mulig forbindelse med risiko kræft. MIR-U2 kan f.eks deltage i vejledende cytosin methylering, en proces, der er kendt for at reagere på miljømæssige stimuli.