PLoS ONE: CCHCR1 opreguleres i hudkræft og associeret med EGFR Expression

Abstrakte

På trods af kronisk inflammation, psoriasis læsioner næppe nogensinde videre til hudkræft. Aberrant funktion af CCHCR1 genet (dobbeltsnoede α-helix Rod protein 1, HCR) inden for PSORS1 locus kan bidrage til udbrud af psoriasis. Som CCHCR1 udtrykkes i visse cancerformer og regulerer keratinocyt (KC) proliferation i en transgen musemodel, vi undersøgte dens relation til proliferation i kutant pladecellekræft (SCC) cellelinier ved ekspression arrays og kvantitativ RT-PCR og i hudtumorer ved immunohistokemi . CCHCR1 protein blev påvist i den skubbende grænsen af ​​SCC og foring basal cellecarcinom øer. Forskellig fra psoriasis, Ki67 havde en lignende udtryk mønster som CCHCR1. Den mest intense CCHCR1 farvning opstod i områder positive for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR). Ekspression af CCHCR1 mRNA blev opreguleret 30-80% i SCC linjer i forhold til normal KCS og korrelerede positivt med Ki67-ekspression. De mest aggressive og invasive tumorcellelinier (RT3, FaDu) udtrykt CCHCR1 mRNA mindre end ikke-tumorigene HaCaT celler. Desuden tumor initiativtagere okadainsyre og menadion nedreguleret CCHCR1 mRNA. Vi konkluderer, at både i psoriasis og de tidlige stadier af KC transformation, kan CCHCR1 fungere som en negativ regulator af spredning, men ud over et vist punkt i onkogenese kan ikke styre dette fænomen længere

Henvisning:. Suomela S, Elomaa O, Skoog T, Ala-aho R, Jeskanen L, Pärssinen J, et al. (2009) CCHCR1 opreguleres i hudkræft og associeret med EGFR Expression. PLoS ONE 4 (6): e6030. doi: 10,1371 /journal.pone.0006030

Redaktør: Benjamin Rich, Harvard Institute of Medicine, USA

Modtaget: 8. december 2008; Accepteret: 21. maj 2009; Udgivet: 24 juni 2009

Copyright: © 2009 Suomela et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Finlands Akademi (US-K. bevilge nr. 115.590, SS give nr. 122.236, RA og VM.K. give nr. 114.409, LL give nr. 108.828), Sigrid Juselius Foundation (US-KJK, VM .K.), Helsinki University Hospital forskningsfond (TYH 7113), Den finske Cancer Research Foundation (VM.K.) og EU-rammeprogram 6 (LSHC-CT-2003 til 503.297) (RA og VM.K.) , Turku University Central Hospital EVO tilskud (projekt 13336), og finsk Dermatologisk Selskab (SS), Finland, det svenske forskningsråd (US-K., JK) og svenske Cancer Foundation (US-K., JK), og Finsen- Welander Foundation (TS), Sverige. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vi har tidligere vist, at CCHCR1 genet i den store psoriasis modtagelighed locus PSORS1 kan fungere som en negativ regulator af KC proliferation [1] – [3]. Den CCHCR1 genet koder for et 782 aminosyrer langt protein (GenBank AY029160) [4], som er forskelligt udtrykt i læsionale psoriasishud forhold til normal hud: lesionally CCHCR1 lokaliserer i basal og suprabasale KCS hvor epidermis er på sit tyndeste. Farvning for celleproliferationen Ki67 viser invers korrelation til CCHCR1 i psoriasis læsioner, i overensstemmelse med en rolle i KC proliferation [1], [4]. Desuden er vores musemodel overudtrykker CCHCR1 * WWCC psoriasis risiko allel under keratin 14 promoter viser nedsat proliferation evne KCS [3], hvilket tyder på mindre aktiv aktivator protein 1 (AP-1) medieret signalering i de risikofaktorer mus. AP-1 medieret signalering regulerer gener associeret med celleproliferation, herunder EGFR også kendt som ErbB1 [5].

Psoriasis læsioner næsten aldrig udvikle sig til hudkræft trods kronisk inflammation, der ofte er en risikofaktor for cancer [6] [7]. Både psoriasis og hudkræft er karakteriseret ved ukontrolleret proliferation KC foruden angiogenese og inflammation. Cellulær proliferation og differentiering kan medieres via EGFR signalering [8]. Flere EGFR-ligander (TGF-a, amphiregulin, heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor) overudtrykkes i psoriasis-læsioner, og transgen ekspression af det humane amphiregulin gen inducerer en psoriasis-lignende fænotype [8]. EGFR-signalering har også været impliceret i patogenesen af ​​ikke-melanom hudcancer [8] – [10]. Interessant nok har både forbedring og forværring af psoriasis er blevet rapporteret i forbindelse med EGFR tyrosinkinasehæmmer kræftbehandling [11], [12].

I vores tidligere undersøgelser, blev CCHCR1 udtryk påvist i nonproliferating celler i bryst og lunge adenokarcinomer: den hyperproliferation Ki67 blev detekteret i tilstødende, men ikke i de samme celler som CCHCR1 [1]. Endvidere EGF opreguleret CCHCR1 proteinekspression i HaCaT celler [2]. For yderligere at forstå funktionen af ​​CCHCR1 i KC transformation og hudkræft, studerede vi til udtryk i præmaligne og maligne skællede læsioner og basalcellekræft (BCC). Som EGFR og dets nedstrøms target cyclin-D1 er involveret i udvikling af cancer og muligvis påvirket af de formodede CCHCR1 veje undersøgte vi deres ekspression i sammenligning med CCHCR1. Relationen af ​​CCHCR1 til KC hyperproliferation blev fremhævet ved farvning tilstødende prøver med Ki67 antistof. Vi undersøgte også korrelationen af ​​CCHCR1 ekspressionsniveauet for dem med Ki67 og EGFR i kulturer af celler med forskellige proliferative og invasive egenskaber. CCHCR1 mRNA-niveauer blev bestemt i HaCaT kulturer inkuberet med forskellige bioaktive stoffer med betydning i tumor forfremmelse, oxidativt stress eller psoriasis inflammation. Endelig blev ekspressionsniveauerne af CCHCR1, Ki67, og EGFR mRNA’er bestemt i et oligonukleotid mikroarray af kutane SCC cellelinier og normale humane epidermale KC cellelinier. Vores resultater antyder, at CCHCR1 udtrykkes i ikke-melanom hudkræft i association med EGFR og Ki67 in vivo. Men i cellekultur de mest Atypic celler udtrykker CCHCR1 mindre end udødeliggjort HaCaT celler, og tumor fremme og proliferation af HaCaT celler korrelerer med reduceret CCHCR1 udtryk.

Resultater

CCHCR1 udtrykkes i SCC i samarbejde med EGFR, cyklin-D1, og Ki67

for at undersøge betydningen af ​​CCHCR1 i KC proliferation og transformation, undersøgte vi CCHCR1 proteinekspression ved immunhistokemi i forskellige hudtumorer i forhold til EGFR, dens downstream mål cyclin- D1, og hyperproliferation Ki67. CCHCR1 positive celler var til stede i 20/22 SCC’er undersøgt. Proliferative cancerceller ved invasive fronten udtrykte CCHCR1 (figur 1A, D, G, S1, figur 2A, C, E), hvorimod de sammenhængende kræftceller i midten var CCHCR1 negative. Infiltrativ udvækst var typiske for CCHCR1 positive områder, men de Atypic celler var heterogene for CCHCR1 ekspression (figur 2A). CCHCR1 udtryk i SCC var forbundet med positiv EGFR farvning i alle prøver (figur 1A, C, D, F). De CCHCR1 positiv cancer reder i de nedre dermis var cyclin-D1 positive såvel (figur 2C-F). Celler positive for hyperproliferation markør Ki67 var placeret hovedsageligt i de samme områder som CCHCR1 positive celler (figur 1B, E, 2B). Men i grad III SCC’er Ki67 var mere rigeligt til stede også i sammenhængende tumor områder, der var blottet for CCHCR1 udtryk (data ikke vist). Til sammenligning er en normal hud prøve vist med basal KCS positiv for CCHCR1 og EGFR, og spredte positivitet overfor Ki67 (Figur 1 H-J).

Serial sektioner af klasse I SCC (A-C) og normal hud (H-J) blev immunfarvet med antistoffer mod CCHCR1, Ki67, og EGFR. Højere forstørrelser på A-C er også vist (D-F, henholdsvis). CCHCR1 farvning (G) i en tilstødende sektion til EGFR-farvning (F). CCHCR1 protein (A) er udtrykt i proliferative cancerceller ved den invasive foran dermal cancercellelinier øer en SCC i samarbejde med hyperproliferation Ki67 (B) og EGFR (C). Ki67-positive celler (E) udtrykker CCHCR1 (D). EGFR-farvning (F) forbinder med CCHCR1 farvning (G) i tilstødende sektioner. Normale hudprøver udtrykker CCHCR1 (H) og EGFR (J) i basal KCS, mens Ki67 udtryk (I) er mere sparsom. Pile peger på illustrative positioner.

Scale barer: Hotel (A-C) 50 um; (D-G) 12,5 um; (H-J) 25 pm.

Serial sektioner af grad III (A, B) og grad II (C, D) SCC blev farvet med de angivne antistoffer. Højere forstørrelse af en anden grad II SCC (E, F). I klasse III SCC (A, B), udtryk for CCHCR1 er heterogent: mange, men ikke alle, kræftceller udtrykker både CCHCR1 (A) og Ki67 (B). De mellemværker viser lavere forstørrelse af samme region, stjerne påpeger en kræftcelle med negativ CCHCR1 og Ki67 udtryk. I grad II SCC (C, D), infiltrativ udvækst er CCHCR1 positive (C), og CCHCR1 positive kræft reder er også cyklin-D1 positive (D). Tilstødende sektioner af grad II SCC (E, F) viser sammenslutning af CCHCR1 og cyklin-D1 positive celler. Pile angiver tilsvarende områder.

Scale barer: Hotel (A, B, E, F) 12,5 um; (C, D, sten indlæg) 50 um.

CCHCR1 udtrykkes af palisading kræftceller i BCC

I BCC blev CCHCR1 udtryk især i cytoplasmaet af palisading kræftceller af de veldefinerede karcinom øer (figur 3A, C). Tre ud af 15 BCC prøver var skleroserende, men CCHCR1 var ikke mere rigelige i dem (data ikke vist). CCHCR1 blev udtrykt i en granulær mønster i syv prøver (figur 3A, C) co-lokalisere med EGFR (figur 3B, D). Alle fem undersøgte prøver var cyclin-D1 positiv: dog dets ekspression ikke var så stærk som den for CCHCR1 og mere koncentreret til tumorens centrum reder (data ikke vist). Cytoplasmatisk udtryk for CCHCR1 i basal KCS i normal udseende hud ved siden af ​​BCC-området varierede mellem prøverne. EGFR var højere i basal KCS af normal hud end i palisading celler i de fleste af prøverne.

Serial sektioner af BCC (A, B) blev farvet med antistoffer mod CCHCR1 og EGFR. Højere forstørrelser af A og B er også vist (C, D, henholdsvis). CCHCR1 protein udtrykkes i en granulær mønster i cytoplasmaet af de palisading cancerceller af en nodulær BCC (A, C). CCHCR1 udtryk (C) co-lokaliserer med EGFR-farvning (D). CCHCR1 og EGFR udtrykkes også i basal KCS (A, B). Pile viser tilsvarende positioner.

Scale barer: Hotel (A, B) 50 um; (C, D) 25 um.

For at undersøge om CCHCR1 og EGFR co-lokalisere også på celleniveau, vi forbigående transficeret HaCaT celler med et CCHCR1 konstruktion og visualiseres CCHCR1 og EGFR med immunofluorescens. CCHCR1 udtryk blev detekteret som en ring-lignende, cytoplasmatisk mønster, mens EGFR var mere eller mindre membranbundne og ikke co-lokalisere med CCHCR1 farvning (figur 4A-D). Transficerede og ikke-transficerede celler udviste tilsvarende EGFR, hvilket antyder, at CCHCR1 ikke påvirker EGFR eller lokalisering (figur 4B).

CCHCR1 transficerede HaCaT celler (A-D) farvet med antistoffer mod CCHCR1 (A) og EGFR (B). Overlejring af A og B er vist i (C), og DAPI-farvning viser kerner i (D). Celler, der udtrykker CCHCR1 (grøn) var også positive for EGFR (rød), men de to proteiner ikke co-lokalisere (C). CCHCR1 positive (pil) og negative (pil hoved) celler udviser lignende EGFR tyder på, at CCHCR1 overekspression ikke påvirker EGFR (B).

CCHCR1 udtryk i keratoacantomer er forbundet med lymfocytinfiltrering

keratoakantom (KA), histologisk en ondartet svulst, men opfører sig på en godartet måde, er ofte betragtes som en “forløber” læsion til SCC. KAs viste generelt positive CCHCR1 farvning især i KCS af skubbe grænsen i områder med en fremtrædende lymfocyt infiltrat omkring tumoren (figur 5A, C). EGFR-positive celler var til stede i de samme områder i de undersøgte prøver (figur 5B, D). I CCHCR1 positive område, blev Ki67 udtryk også stødt på i alle tre prøver, men med mindre intensitet end i SCC (figur 5E, F).

Serial sektioner af KA (A, B, E, F) var farvet med antistofferne mod CCHCR1 og EGFR (A, B) eller mod CCHCR1 og Ki67 (E, F). Højere forstørrelser af A og B er vist (C, D, henholdsvis). Det skubber grænsen til en KA er CCHCR1 positiv (A) co-lokalisere med EGFR (B). En anden prøve er vist (E) med en fremtrædende lymfocyt infiltrat og cytoplasmatisk CCHCR1 udtryk for de skubbe grænserne celler. Mere knappe Ki67-ekspression (F) er defineret til de samme områder, men ikke nødvendigvis til de samme celler. Pile angiver tilsvarende positioner.

Scale barer: Hotel (A, B, E, F) 50 um; (C, D) 12,5 um.

Bowens sygdom og aktiniske keratoser udtrykker CCHCR1 i spongiotic og inflammatoriske områder

spongiosis, inflammatorisk infiltrat, og kapillær proliferation var forbundet med CCHCR1 udtryk i 11 /21 Bowens sygdom (SCC in situ) prøver (figur 6A, B). Områder mangler inflammation og spongiose udtrykt mindre CCHCR1 (figur 6C), ej heller var CCHCR1 udtryk forbundet med KC atypi. I Bowens sygdom, blev cytoplasmatisk CCHCR1 farvning stødt basalt og suprabasally i dermal papiller (figur 6B) ligner CCHCR1 farvning af psoriatisk læsionale hud (fig 6E), især i hypertrofiske prøver. Også EGFR i Bowens sygdom lignede ekspressionsmønsteret for CCHCR1 (figur 6D). I psoriasis, CCHCR1 udtryk var mest intense i områder med mindre Ki67 positive KCS (Figur 6F). Otte af 11 undersøgte aktinisk keratose (AK) prøver havde CCHCR1 positiv basal eller suprabasale KCS (figur 6G). CCHCR1 positive celler ofte stødt i områder med spongiose eller inflammation.

Dele af Bowens sygdom (A-D) immunfarvet med antistoffer mod CCHCR1 og EGFR som angivet. Serielle sektioner af psoriasis (E, F) blev farvet med antistoffer for CCHCR1 og Ki67. AK prøver (G, H) blev farvet med CCHCR1 antistoffer. I Bowens sygdom (A, B), spongiose, inflammatorisk infiltrat og kapillær proliferation er forbundet med CCHCR1 ekspression mens områder mangler inflammation og spongiose udtrykke mindre CCHCR1 (C). EGFR (D) i basal og suprabasale KCS af dermal papiller associerede virksomheder med CCHCR1 udtryk (B). Også i psoriasis (E), er CCHCR1 udtrykkes basalt eller suprabasally (pile) ligger over dermal papiller (dp), mens netkamme (RR) rager ind i dermis er næsten negative for CCHCR1. I modsætning hertil Ki67-ekspression (F) lokaliseres til regioner, der er næsten negative for CCHCR1 celler (pilespidser). AK prøver (G) udtrykker CCHCR1 basalt og suprabasally i samarbejde med KC heterogenitet, spongiose eller betændelse, men tilstødende områder med mindre betændelse eller spongiosis (H) pletten kun svagt.

Scale barer:

(A-D) 50 um; (E, F) 25 um; (G, H) 12,5 um.

Angivelse af CCHCR1 opreguleres og korrelerer med Ki67 udtryk i kutane SCC cellelinier

Næste, vi sammenlignede mRNA udtryk profiler af CCHCR1 , EGFR, Ki67, og cyclin-D1 i forskellige kutane SCC cellelinier (fem primære og tre metastatisk), ved at udføre Affymetrix eksperimenter. Oligonukleotidet mikroarray baseret ekspressionsprofil viste, at CCHCR1 genet udtrykkes i SCC-celler (figur 7A). Signalniveauerne CCHCR1 probesæt var op til 80% højere i de kutane SCC cellelinier (n = 8) end i det normale humane epidermale KCS (n = 5), men der var ingen klar forskel i CCHCR1 ekspressionsniveauer mellem primær og metastatiske SCC linjer. Ekspressionsniveauer i SCC cellelinier var variabel, men de gennemsnitlige niveauer viste en lille stigning (30%; p 0,05) sammenlignet med normale KCS ved kvantitativ real-time RT-PCR (TaqMan) (figur 7C). Signalniveauerne i Ki67 probesæt var 3-4 gange højere i SCC cellelinier end i normale epidermale KCS (figur 7A). Denne observation blev også bekræftet af TaqMan PCR (figur 7D). Vigtigere, ekspressionsniveauer af CCHCR1 korreleret med niveauerne af Ki67 i microarray data (figur 7B). En svag korrelation (R = 0,46) mellem CCHCR1 og Ki67-mRNA-niveauer blev observeret i TaqMan data samt (figur 7e). Ekspressionsniveauerne af EGFR-mRNA i SCC cellelinier var mellem 80% og 180% af de normale KC ekspressionsniveauer i 4 ud af 8 probesæt (figur 7A). Både cyclin-D1 probesæt var til stede i alle cellelinjer og de gennemsnitlige signalniveauer var op til 60% højere i SCC cellelinier sammenlignet med normal KCS. CCHCR1 havde en lille negativ korrelation med EGFR-niveau, men blev opdaget nogen korrelation mellem CCHCR1 og cyklin-D1 (data ikke vist).

A) Ki67, EGFR, cyklin-D1 og CCHCR1 genekspression profil fem normal epidermal KC og otte kutane SCC cellelinier (Heatmap). Signalværdier af sonden sæt blev sammenlignet med de gennemsnitlige signalværdier af hver probe sat i KCS. Den farve er baseret på log2 værdier af ændringen i signalværdier. De opregulerede gener er vist med rødt og ned-regulerede gener er vist med grønt. B) Korrelation mellem CCHCR1 og Ki67 probesæt blev beregnet mellem signalværdier i en CCHCR1 og én Ki67 probesæt i HG-U133 Plus 3.0 array. Pearsons korrelationskoefficient R = 0,88. C) CCHCR1 og D) Ki67 mRNA ekspressionsniveauer i de normale KCS og kutane SCC cellelinier som målt ved QRT-PCR (TaqMan). Ekspressionsniveauer af CCHCR1 og Ki67 i den normale KCS og SCC cellelinier blev analyseret ved QRT-PCR og korrigeret for p-actin mRNA-niveauer i de samme prøver. E) Sammenhæng mellem CCHCR1 og Ki67 probe sæt blev beregnet mellem signalværdier i CCHCR1 og Ki67 mRNA-niveauer. Pearsons korrelationskoefficient R = 0,46.

Okadasyre og menadion nedregulerer CCHCR1 mRNA-ekspression i HaCaT celler

For at afgøre, om forskellige bioaktive stoffer ændrer CCHCR1 mRNA-ekspression, vi behandlede HaCaT celle kulturer med tumor initiativtagere, oxidative stress induktorer og agenter er involveret i psoriasis inflammation. Okadainsyre (OA) og menadion, begge forbindelser vist sig at fremme tumorer in vivo og inducerer oxidativt stress, nedreguleret CCHCR1 mRNA-niveauer i HaCaT celler op til 10 gange med stigende dosis (OA) og 3 gange (menadion) (figur 8A) . EGFR og Ki67 mRNA niveauer af OA og menadion behandlet HaCaT celler blev nedreguleret samt (figur 8B, C). Menadion eller OA behandlinger ikke væsentligt ændrer ekspressionen af ​​huset-holder gen GAPDH i HaCaT celler, hvilket tyder på, at disse midler ikke påvirkede cellernes levedygtighed. De tumorpromotorer 12-phorbol-13-myristat-acetat (PMA) og staurosporin eller anti-østrogen tamoxifen, H

2O

2-producerende oxidativ stress, leptin, IL-6 eller stafylokok endotoksin B, activin eller anisomycin , ikke i nævneværdig grad CCHCR1 mRNA-niveauer (data ikke vist).

CCHCR1 (A), Ki67 (B), og EGFR (C) mRNA ekspressionsniveauer (TaqMan) i HaCaT-celler efter behandling med tumorpromotorer OA og menadion. CCHCR1 (D), Ki67 (E) og EGFR (F) mRNA-ekspression i HaCaT, A5, II4, RT3, A431, og FaDu celler. De invasive celler II4 og FaDu og metastatiske RT3 celler udtrykte mindre CCHCR1 (D) og Ki67 (E) end HaCaT og A5 celler. A431-celler (F) udtrykker EGFR mRNA klart mere end andre cellelinjer. RAS-transformerede kloner A5, II4, og RT3 og FaDu celler udtrykker EGFR mindre end HaCaT celler. Kvantitative RT-PCR-resultater er vist i forhold til mRNA-niveauer fra tilsvarende kontrolceller (tildelt værdien 1). Ekspressionsniveauer af CCHCR1, Ki67, og EGFR i HaCaT celler blev normaliseret til GAPDH mRNA niveauer i de samme prøver. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

CCHCR1 nedreguleres i de mest aggressive tumorcellelinier

For yderligere at studere rolle CCHCR1. i KC transformation, vi sammenlignet CCHCR1 mRNA-ekspression i cellelinjer med forskellige metastatisk og invasive egenskaber. Baseret på kvantitativ TaqMan RT-PCR, CCHCR1 og Ki67 ekspressionsniveauer var ens i immortaliserede HaCaT og tumordannende A5 ras-transformerede cellelinier (figur 8D, E). Men med stigende tumorgenicitet i ras-transformation, invasive II4 og metastatiske RT3 celler udtrykte mindre CCHCR1 mRNA, og denne tendens blev også set med maligne A431-celler (Figur 8d). Tilsvarende FaDu celler, der er mere indgribende end HaCaT og A431 celler [13] udtrykt mindre CCHCR1, Ki67, og EGFR (figur 8D-F). Også Ki67 og EGFR formindsket med ras-transformation (figur 8E, F). Interessant, A431-celler var de eneste celler til EGFR betydeligt mere end HaCaT celler (figur 8F), Ki67 og CCHCR1 ekspression forbliver på et lavere niveau (figur 8D, E).

CCHCR1 mRNA-ekspression nedreguleres, når keratinocytter er i et hastigt prolifererende statslige

at studere CCHCR1 mRNA-ekspression i udødelige, men ikke tumorigene HaCaT celler med forskellige proliferative stadier, vi udførte cellekultur eksperimenter i henhold til den strategi Pivarcsi et al. [14]. I vores eksperimenter, sammenflydende HaCaT celler (kontroldyr) og sammenflydende celler efter en 1-wk sultende periode (celler tvunget til hviletilstand) udtrykt CCHCR1 mere end HaCaT celler stimuleret til at proliferere ved tilsætning af serum til et ikke-sammenflydende subkultur (figur 9A). CCHCR1 udtryk faldt især i de første fire dage. Spredningen status af cellerne (som bekræftet af Ki67 mRNA-ekspression) korrelerede negativt med CCHCR1 udtryk (Figur 9B): fald i CCHCR1 udtryk var forbundet med stigningen i Ki67 udtryk. Efterhånden som cellerne reattained sammenflydning, ekspressionen af ​​CCHCR1 steg igen til det oprindelige niveau (figur 9A). En af de fire forsøg blev udført ved anvendelse endnu lavere antal celler. Her har vi vist et intenst proliferation i de første tidspunkter (24 timer og 48 timer) som relativ Ki67 mRNA-ekspression øget 6 gange sammenlignet med kontrolceller (to sæt kontrolceller, der giver de to værdier omkring værdien 1). Den negative korrelation af CCHCR1 udtryk med Ki67-ekspression var endnu mere udtalt som relativ CCHCR1 mRNA samtidig faldt nær nul fra de to kontrolcelle værdier omkring værdien 1 (figur 9D). Interessant EGFR mRNA niveauer fulgte CCHCR1 ekspressionsmønster stedet Ki67 ekspressionsmønster (figur 9C, E). Ved at tvinge HaCaT celler til at differentiere med høj calcium medium, ekspressionen af ​​CCHCR1 forblev uændret som målt med TaqMan PCR (data ikke vist), aftale med vores tidligere data, som CCHCR1 mRNA-niveauer var ikke-ændret i differentieret normal KCS [1]. Involucrin blev anvendt som en differentieringsmarkør til at bekræfte differentiering status for HaCaT celler efter calcium administration [15].

A) Relativ ekspression af CCHCR1 mRNA (som målt ved TaqMan) på forskellige tidspunkter (fra 24 timer til 8 d) efter frigørelse af cellerne fra serum sult og høj densitet dyrkning. Ekspression af CCHCR1 adskilte sig ikke mellem sammenflydende (kontrol) celler og rolige (sultet) celler. Kontrolceller udtrykte CCHCR1 2,5 gange mere end proliferative HaCaT celler (24-48 timer, 3-4 d). Som konfluens blev reattained (8 d), ekspressionen af ​​CCHCR1 steget til niveauet af kontrolcellerne. B) Korrelation mellem relativ CCHCR1 og Ki67 ekspressionsniveauer. Når CCHCR1 mRNA ekspressionsniveauer blev sammenlignet med dem for Ki67, blev en negativ korrelation set bekræfter proliferative status HaCaT celler. C) EGFR-mRNA-ekspression korrelerede med CCHCR1 mRNA-ekspression. D) Sammenhæng mellem CCHCR1 og Ki67 udtryk i eksperimentet med lavere celletæthed. Den negative korrelation mellem CCHCR1 udtryk med Ki67 udtryk var endnu mere dybtgående som relativ CCHCR1 mRNA faldt tæt på nul i de to kontrolgrupper celler. E) Sammenhæng mellem CCHCR1 og EGFR i eksperimentet med lavere celletæthed. Også her CCHCR1 udtryk korreleret med EGFR. TaqMan PCR resultater er vist i forhold til mRNA-niveauer fra tilsvarende kontrol celler tildeles værdien 1. Expression niveauer af CCHCR1, Ki67, og EGFR i HaCaT celler blev normaliseret til GAPDH mRNA niveauer i de samme prøver. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Diskussion

Vores resultater præsenteret her viser, at CCHCR1, en kandidat gen for psoriasis, blev udtrykt. i størstedelen af ​​SCC’er, BCC og KAs undersøgt, tyder på, at CCHCR1 kan have en rolle, ikke blot i KC proliferation men også i transformation. EGFR korreleret med CCHCR1 udtryk, og cyklin-D1, en downstream mål af EGFR og en positiv regulator af cellecyklusprogression [16], blev også fundet udtryk i de samme områder. I normal epidermis, er både EGFR og CCHCR1 udtrykte basalt [4], [8] (Figur 1). Ekspression af EGFR, “en overlevelse faktor for tumorceller”, er endog anses for at være nødvendig for at opretholde KCS i en proliferativ tilstand [8]. Vi postulerer, at EGFR kan regulere CCHCR1 udtryk som vi for nylig har vist, at EGF-stimulering opregulerer CCHCR1 proteinekspression [2]. Vores eksperimenter her med transficerede HaCaT celler antydede, at overekspression af CCHCR1 ikke regulerer EGFR.

Ifølge vores resultater, transformerede KCS har en anden CCHCR1 status i korrelation til hyperproliferation Ki67 status sammenlignet med ikke-tumorigene KCS. Adskiller sig fra godartede hyperproliferativ lidelse psoriasis ([1], figur 6E-F), blev ekspression af hyperproliferation Ki67 demonstreret her i de samme områder som CCHCR1 ekspression ved den invasive foran SCC’er. Vi har tidligere vist, at i bryst- og lunge-adenocarcinomer, CCHCR1 positive celler er Ki67 negative [1], men denne uoverensstemmelse kan skyldes forskelle mellem adenocarcinom og SCC-celler eller lokaliteten organ af cancer. Den positive korrelation med CCHCR1 og Ki67 udtryk i hudkræft blev støttet af udtrykket profilering af kutane SCC cellelinier. Der var imidlertid negativ korrelation med CCHCR1 og EGFR i disse samme cellelinier såvel som i invasive FaDu tumorceller [17], hvilket antyder, at EGFR-transkription blev inhiberet. Dog kan dette afspejle forskellige EGFR varianter studeret, da den specifikke probe til variant 2 syntes at være mere nedreguleres end variant 1 eller sonder genkender alle varianter.

På trods af positiv CCHCR1 og Ki67 udtryk in vivo i hudkræft og i Affymetrix assay af SCC cellelinier viser vi, at CCHCR1 og Ki67 mRNA’er nedreguleres i dyrkede celler med stigende transformation og også i ikke-tumorigene HaCaT celler behandlet med forbindelser, der fremmer tumorer in vivo. Metastatisk RT3 og invasive II4 celler udtrykte CCHCR1 og Ki67 mindre end tumorigen A5 og immortaliserede HaCaT celler, hvilket antyder, at CCHCR1 og Ki67-ekspression øges omvendt til niveauet af ras-transformation. Tilsvarende blev EGFR nedreguleret i alle ras-transformerede celler, selv i A5 celler. CCHCR1 mRNA blev også formindsket i de invasive FaDu celler sammenlignet med A431 korrelerer med opregulering af EGFR fra FaDu til A431-celler. Høj EGFR i A431 celler sammenlignet med FaDu celler er enig med tidligere undersøgelser [17]. Endvidere i SCC, den CCHCR1 immunfarvning var heterogen i Atypic celler – mange Atypic celler var også blottet for Ki67

tumor initiativtagere OA og menadion nedreguleret udtryk for CCHCR1, Ki67, og EGFR mRNA i HaCaT celler.. OA inhiberer serin /threonin-specifikke proteinphosphataser, herunder proteinphosphataser 1, 2A, og PP3 [18] og aktiverer cellulære ERK1 /2, JNK og p38 MAPK signalveje og AP-1 transkriptionsfaktorer [19] – [21] Desuden til aktivering Akt-1, et pro-overlevelse serin-threonin-kinase [22]. Menadion inhiberer proteintyrosinkinaser phosphataser aktiverende ErbB2, som er overudtrykt i BCC og nedreguleret i SCC forhold til normal epidermis [23]. Interessant nok har EGFR aktivitet været impliceret i OA-induceret carcinogenese og menadion-induceret ErbB2 aktivering [24], [25]. Endvidere EGFR er blevet rapporteret at aktivere Erk1 /2 og Akt i SCC [10].

Ultraviolet stråling er en af ​​de vigtigste faktorer, som disponerer for hudkræft og er også kendt for at aktivere EGFR [9]. Vi har ikke fundet væsentlige ændringer i CCHCR1 mRNA-niveauer i HaCaT celler dyrket i forskellige perioder efter UVA /UVB-stråling (Suomela, Latonen og Saarialho-Kere, upublicerede data). Vi kunne ikke påvise nogen effekt af H

2O

2 (producerer oxidativ stress) på CCHCR1 mRNA-ekspression enten, selvom også OA samt menadion er kendt for at inducere dannelsen af ​​reaktive ilt arter og lipidperoxidation på udødeliggjort celle linjer [26], [27], tyder på, at oxidativt stress var ikke involveret i interaktionen mellem OA og CCHCR1.

Endelig har vi vise, at i HaCaT celler, CCHCR1 udtryk faldt med spredning, i overensstemmelse med vores tidligere rapporter [1], [3], [4]. Efter fremprovokere proliferation i HaCaT celler som beskrevet tidligere [14], den mere proliferativ de ikke-tumorgene HaCaT celler blev, jo mindre CCHCR1 blev udtrykt. Interessant EGFR mRNA-ekspression fulgte af CCHCR1 mRNA-ekspression i stedet for Ki67-ekspression, hvilket antyder en fælles opstrøms effektor i signalveje. Vi kan dog ikke i denne indstilling udelukker effekten af ​​cellekonfluens alene på CCHCR1 udtryk som det påvirker også udbredelsen af ​​HaCaT celler.

malign transformation af psoriasis læsional KCS er meget usædvanligt på trods af ukontrolleret KC spredning og co -existence af kronisk inflammation. Årsagen til beskyttelse mod udvikling af cancer forbliver uklar. Reducerede AP-1-niveauer i psoriatiske KCS er blevet foreslået som en forklaring [28], [29]. AP-1 medieret vej er også involveret i EGFR-aktivering fører til KC hyperproliferation [5]. Når CCHCR1 transgene risiko mus, med nedreguleret vitamin D receptor [30], blev såret og PMA-behandlede, KC proliferation blev reduceret [3], hvilket tyder på mindre aktive AP-1 eller STAT3 signalering. Endvidere vitamin D er et lægemiddel til behandling af psoriasis, nedregulerer EGFR og cyclin-D1 [31]. CCHCR1 er også blevet foreslået at regulere migrering af RNA-polymerase II-underenhed 3 (RPB3) [32], der aktiverer den aktiverende transskriptionsfaktor 4 (ATF4 eller CREB2) [31] associere med vækststandsning [34], [35] og bliver stand til at danne heterodimerer med medlemmer af AP-1-familien. Den foreliggende undersøgelse implicerer, at CCHCR1, en kandidat gen for psoriasis, har en funktion i KC biologi også i malign transformation. [14].