PLoS ONE: Induktion af Natrium /Iodide symporteren (NIS) Udtryk og radiojod Optagelse i ikke-kræft i skjoldbruskkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Denne undersøgelse blev designet til at udforske det terapeutiske potentiale for at undertrykke MAP-kinase og PI3K /Akt veje og histon deacetylase (HDAC) for at inducere ekspression af natrium /iodid symporter (NIS) og radiojod optagelse i ikke-skjoldbruskkirtlen cancerceller.

Metoder

Vi testede virkningerne af MEK-inhibitor RDEA119, Akt inhibitor perifosine, og HDAC inhibitor SAHA på NIS-ekspression i tretten humane cancercellelinier afledt fra melanom, hepatisk carcinom, gastrisk carcinom, coloncarcinom, brystcarcinom, og hjernecancere. Vi undersøgte også radiojod optagelse og histonacetylering på NIS-promotor i udvalgte celler.

Resultater

Alt i alt kunne de tre hæmmere inducerer NIS udtryk, i forskelligt omfang, i melanom og alle epitel karcinom -afledte celler, men ikke i hjernen kræft-afledte celler. SAHA var mest effektive og dens effekt kunne blive væsentligt forbedret ved RDEA119 og perifosine. Ekspressionen af ​​NIS, både mRNA og protein niveauer, var mest robust i melanom celle M14, hepatisk carcinom celle HepG2, og den gastriske carcinoma celle MKN-7 celle. Radioaktivt jod optagelse blev tilsvarende induceret, ledsaget af robust stigning i histonacetylering på NIS-promotoren, i disse celler, når de behandles med de tre inhibitorer.

Konklusioner

Dette er den første demonstration af, at samtidig undertrykker MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC kunne fremkalde robust NIS udtryk og radiojod optagelse i visse ikke-thyreoidea humane cancerceller, der giver nye terapeutiske implikationer for supplerende radioaktivt jod behandling af disse kræftformer

Henvisning:. Liu Z, Xing M (2012) Induktion af Natrium /Iodide symporteren (NIS) udtryk og radiojod Optagelse i Non-Thyroid Cancer Cells. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10,1371 /journal.pone.0031729

Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, England

Modtaget: 12. september 2011; Accepteret: 12 januar 2012; Udgivet: 16 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu, Xing. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Health R01 tilskud CA134225 til Dr. Xing. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Som et transmembrant glycoprotein udtrykt primært i follikulære epitelceller skjoldbruskkirtlen celler, natriumjodid symporter (NIS) spiller en fundamental rolle i transport af iodid fra det ekstracellulære rum i skjoldbruskkirtlen cellen til syntese af skjoldbruskkirtelhormoner i skjoldbruskkirtlen [1] – [4]. Dette er den biologiske grundlag for den kliniske anvendelse af radioaktivt iod i diagnosticering og behandling af en række af benigne og maligne thyreoidea sygdomme. Et typisk eksempel på at udnytte denne funktion NIS er radioaktivt jod ablation almindeligt anvendt til behandling af kræft i skjoldbruskkirtlen [5], [6]. Radioaktivt jod behandling er sædvanligvis effektiv hos patienter, kræft i skjoldbruskkirtlen, men det bliver ineffektiv, når skjoldbruskkirtlen kræftceller har mistet ekspression af NIS og kan ikke længere tage op radioaktivt jod, som typisk ses i dårligt differentierede og udifferentierede skjoldbruskkirtelkræft [7] – [10]. Tidligere undersøgelser viste, at hæmmere af histon deacetylase (HDAC) kunne inducere ekspressionen af ​​NIS i skjoldbruskkirtlen cancerceller [11], [12]. Vi har for nylig vist, at kombinationen af ​​HDAC-hæmmer SAHA med hæmmere af MAP-kinase og PI3K /Akt veje kunne fremkalde robust og synergistisk udtryk for NIS og radiojod optagelse i skjoldbruskkirtlen cancerceller [13]. Dette åbnede mulighed for romanen effektiv behandling af kræft i skjoldbruskkirtlen ved hjælp radioaktivt jod, der ellers ikke ivrig for denne radioisotop.

I betragtning af den unikke funktion af NIS at transportere iodid i skjoldbruskkirtlen celler og den kliniske succes med at bruge radioaktivt iod for skjoldbruskkirtlen kræft ablation behandling, har det længe været foreslået og afprøvet, at eksogent induceret NIS udtryk ved hjælp målrettet genoverførsel kan bibringe ikke-thyreoidea kræftceller radioaktivt jod begærlighedsantistoffer for radioaktivt jod ablation behandling [2] – [4], [14]. Sådanne undersøgelser er lovende, men har endnu ikke resulteret i pålidelige kliniske anvendelser. Der er stadig behov Major indsats for at forbedre en række centrale aspekter af denne tilgang, herunder den terapeutiske virkning, specificitet, sikkerhed og tekniske kompleksitet. NIS kan udtrykkes i forskellige normale ikke-thyreoidea væv, om end på et lavt niveau, herunder for eksempel spyt, lacrimal, bryst, mave, tarm, lunge, og nyrevæv [15] – [19]. Low-level udtryk for NIS blev også rapporteret i nogle ikke-skjoldbruskkirtelkræft såsom mammacancer [20]. Vi har for nylig vist, at undertrykkelse af MAP-kinase og PI3K /Akt veje kunne fremkalde udtryk for NIS og radiojod optagelse i melanom celler [21]. I betragtning af den synergi i robust fremkalde skjoldbruskkirtlen genekspression og radiojod optagelse i skjoldbruskkirtlen cancerceller ved samtidig at hæmme HDAC og MAP-kinase og PI3K /Akt veje [13], i nærværende undersøgelse testede vi potentialet i denne roman terapeutiske strategi for at fremkalde NIS udtryk for radiojod optagelse i et udvidet panel af ikke-thyreoidea kræftceller.

Resultater

Induktion af NIS genekspression i ikke-skjoldbruskkirtlen cancerceller ved at undertrykke MAP kinase og PI3K /AKT veje og HDAC

Vi testede virkningerne af MEK-inhibitor RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og HDAC-hæmmer SAHA på ekspressionen af ​​

NIS

gen i 13 humane cancerceller (tabel 1). Disse omfattede melanomceller og epitelcarcinoma celler afledt af leverkarcinom, gastrisk carcinom, coloncarcinom og brystcancer, samt glioblastom celle T98G og astrocytomcelle SNB-78. For at demonstrere de målrettede lægemiddelvirkninger af de tre inhibitorer i disse celler, vi først afprøvet deres virkninger på deres målmolekyler i signalvejene. Som vist i fig. 1, efter 30 timers behandling, RDEA119 0.5 uM og perifosine ved 5 uM i væsentlig grad kan inhibere phosphorylering af ERK (p-ERK) og phosphorylering af AKT (p-AKT), henholdsvis i næsten alle celler med undtagelse af SNB-78-celle. SAHA 0.5 uM i 30 timer kunne dramatisk forbedre acetyleringen af ​​histon H3 i disse celler bortset fra nogle celler, såsom T98G og SNB78, hvor der var ingen eller kun en lille stigning i histonacetylering. Disse resultater, samlet, viste de forventede mål virkninger af disse inhibitorer.

MEK inhibitor RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og HDAC-hæmmer SAHA blev brugt til henholdsvis målrette disse signalveje eller molekyler. Cellerne blev behandlet i 30 timer med 0,5 pM RDEA119, 5 pM perifosine eller 0,5 pM SAHA som angivet. DMSO eller PBS blev anvendt parallelt som kontrol køretøjet. Cellerne blev lyseret for Western blotting efter behandlinger at afsløre niveauerne af phosphoryleret ERK (p-ERK), phosphoryleret Akt (p-Akt), og acetyleret histon (Ac-His) med specifikke antistoffer. “+”, Behandling med den angivne inhibitor; “-“., Behandling med køretøj

Vi efterfølgende testet effekten af ​​de tre-hæmmere ved disse koncentrationer, individuelt eller i kombinationer, på ekspressionen af ​​

NIS

gen i de 13 celler under anvendelse kvantitativ real-time PCR. Som vist i tabel 1,

NIS

ekspression blev øget i forskellig udstrækning i alle cellerne, bortset fra de to ikke-epiteliale cancerceller T98G og SNB78 som ikke har nogen reaktion på disse lægemiddelbehandlinger. Den inducerede

NIS

udtryk var mest robuste i melanom celle M14 den hepatocarcinoma celle HepG2, og den gastriske carcinoma celle MKN-7, som blev anvendt til yderligere undersøgelser, som præsenteres i de følgende afsnit. Individuelt, RDEA119 og perifosine hver havde en mindre effekt og SAHA vises de mest udtalte virkninger på ekspressionen af ​​

NIS

. En synergistisk virkning blev set, når MEK-inhibitor eller Akt inhibitor hver kombineret med SAHA og de synergistiske effekter var endnu mere robust, når de tre lægemidler blev kombineret, med en undtagelse, at i HepG2 celler perifosine forøgede ikke yderligere den robuste virkning SAHA .

efter påvisning af mRNA-ekspression af NIS ved kvantitativ realtids-PCR i melanom og epithelial carcinomaceller, vi næste forsøgt at undersøge ekspressionen af ​​NIS på proteinniveauet i disse celler, under anvendelse af melanoma celle M14 , hepatocarcinoma celle HepG2, og gastrisk karcinom celle MKN-7 som repræsentanter, der viste den mest robuste udtryk for NIS (tabel 1). Som vist i fig. 2, kombinationsbehandling af disse celler med RDEA119, perifosine og SAHA steget markant NIS proteinekspression som påvist ved Western blotting. Sammenlignet med M14 og HepG2-celler, MKN-7-celler viste en beskeden stigning i ekspressionen af ​​NIS-protein som respons på kombinationsbehandlingen med de tre inhibitorer, som svarede til mønstret af NIS-mRNA-ekspression i disse celler under denne lægemiddelbehandling tilstand (tabel 1). Således undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt veje og HDAC kunne fremkalde robust udtryk for NIS i disse celler både på transkriptionelle og translationelle niveau.

Cellerne blev behandlet i 30 timer med kombination brug af RDEA119, perifosine, og SAHA ved koncentrationerne, der er beskrevet i fig. 1, efterfulgt af standard Western blotting-analyse af cellelysater ved hjælp af specifikke primære antistof mod NIS. Ekspressionsniveauet af ß-actin blev analyseret parallelt til kvalitetskontrol. “Control”, behandling af celler med køretøjets “R + P + S”, behandling af celler med kombineret brug af RDEA119, perifosine og SAHA.

Cellular radioiodide optagelse induceret ved at undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt veje og HDAC

med demonstration af robust NIS udtryk i ikke-skjoldbruskkirtlen cancerceller ved at undertrykke MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC, vi brugte M14, HepG2 og MKN-7 celler for at teste den ultimative funktionelle relevans af dette fund ved at undersøge evnen af ​​disse celler til at optage radioiodide efter induktion af NIS. Som vist i fig. 3 blev radioiodide optagelse klart induceret i disse celler ved kombinationsbehandling med RDEA119, perifosine og SAHA. Blandt de tre celler, mærket radioiodide optagelse blev især set i M14 cellen, i overensstemmelse med den konklusion, at NIS udtryk på både mRNA og protein niveauer var mest robuste i denne celle.

Celler blev behandlet med RDEA119, perifosine og SAHA som beskrevet i fig. 2, efterfulgt af inkubation med Na

125I i 1 time. Parallelle celler blev yderligere behandlet med NIS Blocker NaCIO

4 at opnå ikke-specifik radioaktivt jod optagelse /binding med cellerne. Celler blev derefter vasket, lyseret og målt for radioaktivitet. Cell radioaktivt jod optagelse præsenteres som cpm /10

6 celler (på y-aksen i figuren) efter korrektion for den ikke-specifikke radioaktivt jod binding. Detaljerede eksperimentelle procedurer er som beskrevet i Materialer og Metoder. “Control”, behandling af celler med køretøjets “R + P + S”, behandling af celler med kombination brug af RDEA119, perifosine og SAHA. ** Sammenlignet med kontrol, p. 0,01

Forbedring af histonacetylering af NIS promotor ved at undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt veje og HDAC

histonacetylering på promotorregion fremmer genekspression [22]. At undersøge, om dette var en mekanisme involveret i ekspressionen af ​​NIS induceret af lægemiddelbehandlingerne i ikke-thyroide cancerceller i den foreliggende undersøgelse, vi næste udført chipanalyse af histonacetylering på NIS-promotoren. Vi undersøgte tre forskellige regioner i NIS promotor for histon H3 og H4 acetylering i M14, HepG2 og MKN-7 celler. Disse regioner repræsenterer den minimale væsentlige NIS-promotor [23]. Vi fandt, at histonacetylering på disse regioner af NIS-promotoren blev forøget til forskellige niveauer ved behandling med SAHA i disse celler (fig. 4a-c). Kombinationsbehandling med MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC-hæmmere steg yderligere histonacetylering på NIS promotor. Samlet set var dette histonacetylering ses i både H3 og H4 i de tre celler undtagen MKN-7-celler, hvori ingen signifikant acetylering ændring blev set i H3 (Fig. 4c). Alle tre regioner i minimale essentielle NIS-promotoren viste histonacetylering bortset fra P1-regionen i M14-celler, viste ingen ændring i acetylering af H3 efter lægemiddelbehandlinger (fig. 4a). Op til omkring 50 folder af stigning i histon H4 acetylering ved P2-område af NIS-promotoren i M14-celler (fig. 4a) og ca. 20 folder af stigning i histon H4 acetylering ved P1-regionen i HepG2-celler (fig. 4b) var observeret. Disse data antyder, at histonacetylering er en mekanisme involveret i NIS-ekspression induceres ved at undertrykke MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC i disse ikke-thyroid cancerceller. M14-celler viste den mest robuste histonacetylering på NIS-promotoren og næstmest i HepG2-celler. MKN-7 celler vises et relativt beskedent histonacetylering på NIS promotor. Det er interessant at bemærke, at dette mønster af omfanget af histonacetylering i de tre celler gentaget såvel mønstrene for omfanget af NIS-ekspression (tabel 1, fig. 2) og radioaktivt iod optagelse (fig. 3) i disse celler, yderligere underbygger en vigtig rolle for histonacetylering i NIS udtryk fremkaldt ved at målrette MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC. Dette synes ikke at gælde for T98G celle, der viste nogle histonacetylering under behandling med SAHA (fig. 1), mens der ikke var nogen stigning i NIS udtryk i denne celle (tabel 1). Men denne acetylering niveau af histon var minimal i sammenligning med det i mange andre celler (fig. 1). Derfor er korrelationen af ​​NIS-ekspression med histonacetylering var generelt klart i forskellige celler testet. Salg

Celler blev behandlet med SAHA alene eller SAHA i kombination med RDEA119 og perifosine som beskrevet i fig. 2. histonacetylering niveauer på de tre regioner (P1, P2, og P3), der omfatter minimale essentielle promotoren fra

NIS

gen blev analyseret ved chromatin immunoprecipitation (chip) analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Acetylering status både histon H3 og H4 blev undersøgt ved hjælp af specifikke antistoffer til chip. Ikke-specifikke IgG antistoffer blev anvendt som kontrol. Resultaterne for M14, HepG2 og MKN-7-celler er vist i fig. 4a, 4b og 4c henholdsvis. For hver celle, den øvre panel viser de faktiske resultater af PCR på DNA fragmenter opnået ved chip bruger ikke-specifik kontrol-IgG, anti-acetyleret H3 (Anti Ac-H3) antistof eller anti-acetyleret H4 (Anti Ac-H4) antistof . Identiske mængder af præ-immunopræcipitationsforsøg cellelysater fra forskellige behandlingsmetoder betingelser blev anvendt til at starte immunoudfældning. En alikvot af præ-immunfældning cellelysat blev direkte anvendt til at isolere DNA som “Input” kontrol. PCR resultater afspejler de histonacetylering niveauer. Præsenteret i det nedre panel til hver celle er et søjlediagram, der viser kvantitativt acetyleringsniveauer af H3 og H4 i de tre regioner

NIS

promotor baseret på densitometriske målinger af det øverste panel. Resultaterne er normaliseret ved at dividere den tilsvarende indgangssignaler og præsenteres som forholdet mellem den angivne behandling i forhold til kontrollen. “Control”, behandling af celler med køretøjets “SAHA”, behandling af celler med SAHA alene; “R + P + S”, behandling af celler med kombineret brug af RDEA119, perifosine og SAHA.

Diskussion

radiojod og adjuverende behandling er klassiske og standard behandlinger for kræft i skjoldbruskkirtlen , der drager fordel af den unikke iodid-transporterende funktion af NIS i skjoldbruskkirtlen cellemembranen. Da NIS også udtrykkes normalt, i forskellig udstrækning, i flere ikke-thyreoidea væv, i den foreliggende undersøgelse testede vi

NIS

ekspression og radioaktivt iod optagelse i cancerceller afledt af ikke-thyroide væv ved samtidig undertrykke MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC. Selv rolle MAP kinase og PI3K /Akt veje i ekspressionen af ​​NIS blev undersøgt i melanom i vores tidligere undersøgelser [21], den rolle, HDAC og histonacetylering i udtrykket af

NIS

i melanom har ikke blevet undersøgt. Vi har derfor også medtaget melanomceller i den foreliggende undersøgelse.

Vi var i stand til at inducere ekspression af NIS, i forskellig udstrækning, i melanomceller og lever-, mave-, colon- og brystcarcinomaceller, men ikke i ikke-epitel hjernetumor-afledte celler, hvilket antyder, at denne inducerbare NIS-ekspression kan begrænses til hudkræft celler og cancerceller af epitelcelle oprindelse. Dette er interessant i overensstemmelse med fordelingen mønster af fysiologisk optagelse af radioaktivt iod i væv af huden (recovery fase af brænde), lever, mave, colon og bryst (lakterende fase) på kroppen scanning af patienterne kræft i skjoldbruskkirtlen efter radioaktivt jod behandling [24 ] – [27]. Bemærkelsesværdigt, vi demonstreret også radioaktivt iod optagelse efter den inducerede ekspression af NIS, i overensstemmelse med NIS funktionalitet i disse ikke-thyroid cancerceller. Vores data også for første gang viste, at øget histonacetylering på

NIS

promotor var en vigtig mekanisme er involveret i ekspressionen af ​​NIS i disse ikke-skjoldbruskkirtlen cancerceller.

HDAC-hæmmer-induceret NIS-ekspression blev tidligere vist i Hela-celler, og som i den samme undersøgelse i HepG2-celler [28]. For at tage et yderligere skridt, vi for nylig vist en synergistisk effekt af HDAC-hæmmer SAHA på NIS-ekspression induceret ved at undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt veje i skjoldbruskkirtlen kræftceller selv, i denne undersøgelse blev histonacetylering ikke undersøgt [13]. I den foreliggende undersøgelse, vi for første gang direkte vist, at undertrykkelse af MAP-kinase og PI3K /Akt veje forbedret histonacetylering på

NIS

promotor som en mekanisme til ekspression af NIS induceret ved samtidigt at målrette de to veje og HDAC i humane cancerceller.

Demonstration af NIS udtryk på både mRNA og protein niveauer samt radioiodide optagelse i disse celler, der er etableret den funktionelle betydning af den inducerbare udtryk for

NIS

gen i disse ikke-thyroid cancerceller. Niveauet af inducerede NIS-ekspression varierede blandt de testede celler, med melanom celle M14, hepatisk carcinom celle HepG2, og gastrisk karcinom celle MKN-7, der viser den mest robuste ekspression af NIS, hvilket antyder, at NIS-ekspression og radioaktivt iod optagelse kan induceres fortrinsvis i visse specifikke tilfælde af disse kræftformer for uklare årsager. Yderligere faktorer sandsynligvis findes, der bestemme inducerbarhed af NIS-ekspression i disse cancerceller, som eksemplificeret ved receptorstatus østrogen, der bestemmer inducerbarhed af NIS-ekspression med all-trans-retinsyre i brystcancerceller [29]. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse har vigtige kliniske implikationer. Melanom, hepatisk karcinom, og gastrisk karcinom er almindelige menneskelige kræftformer, alle med høj dødelighed, især i metastatisk og avancerede tilfælde. Da de sidstnævnte tilfælde er normalt kirurgisk ubrugeligt, der i øjeblikket et presserende behov for nye effektive medicinske behandlinger. Med inducerbarhed af NIS-ekspression og radioaktivt iod optagelse i disse cancerceller demonstreret i den foreliggende undersøgelse, kan det være muligt at behandle disse cancere under anvendelse supplement radioaktivt iod som i behandling for kræft i skjoldbruskkirtlen. Den omstændighed, at inducerede NIS-ekspression var særlig robust i nogle cellelinjer, men ikke andre afledt fra disse cancere tyder på, at denne radioaktivt jod behandling kan være effektiv i en undergruppe af patienter med disse kræftformer.

Terapeutiske midler rettet mod store signalveje, såsom MEK og BRAF inhibitorer for MAP kinase pathway og AKT og mTOR-hæmmere for PI3K /Akt vej, samt HDAC-hæmmere, er ved at blive aktivt udviklet klinisk [30] – [33]. Mange af dem har vist stærk terapeutisk potentiale i forskellige menneskelige kræftformer og nogle er blevet godkendt til klinisk brug. Det er derfor klinisk muligt at anvende disse inhibitorer til at målrette MAP-kinase og PI3K /Akt veje og nogle af dem i kombination til duelt undertrykke de to veje til at inducere NIS-ekspression. HDAC inhibitor SAHA, som også er blevet godkendt til behandling af visse kræftformer [34], kan indgå i dette stof kombinationsterapi kan forbedre NIS-ekspression for radioaktivt iod behandling af cancere. Da disse lægemidler er selv terapeutisk ved direkte inhibering cancercellevækst, deres anvendelse i forbindelse med radioaktivt iod brug for yderligere at dræbe kræftceller kunne gøre behandlingen en endnu mere effektiv kemoterapi. Dette kan vise sig at være en hidtil ukendt og særlig effektiv terapeutisk strategi til melanom og carcinomer i lever- og gastrointestinale system. Denne teknisk let strategi for anvendelse af klinisk dokumenteret narkotika at inducere NIS-ekspression og radioaktivt iod optagelse i ikke-thyroide cancerceller, hvis det bekræftes at være effektive i fremtidige undersøgelser, kan vise sig at være bedre end NIS ekspression opnås ved genoverførsel tilgange, som det kan undgå visse sikkerhed, specificitet, effektivitet og tekniske kompleksitet spørgsmål i forbindelse med den bredt undersøgt plasmid- eller virus-medieret organ målrettet NIS genoverførsel [4], [14].

Interessant, tidligere undersøgelser viste en basal udtryk for skjoldbruskkirtlen gener i hudceller og melanom celler [35], [36]. Det giver grundlag for robust inducerede ekspression af skjoldbruskkirtlen gener og radiojod optagelse i melanomaceller ved at målrette MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC i vores nuværende og tidligere undersøgelser [21]. Det er også muligt, men mangler at blive undersøgt, at en lav basal ekspression tilstand af thyreoidea-gener eksisterer ligeledes i hepatiske og gastriske carcinomer og andre kræftformer undersøgt i den foreliggende undersøgelse, der bliver robust aktivt ved undertrykkelse af de store signalveje.

sammenfattende nærværende undersøgelse for første gang viser robust NIS udtryk og radiojod optagelse i flere ikke-skjoldbruskkirtlen cancerceller ved samtidig målrette MAP-kinase og PI3K /Akt veje og HDAC bruger deres hæmmere. Da mange af disse inhibitorer allerede har vist sig at være klinisk gennemførlig og lovende ved inhibering forskellige cancerformer, deres anvendelse også fremkalde NIS-ekspression til adjuverende radioaktivt jod behandling ud over deres direkte inhibering af cancerceller kan vise sig at være en hidtil ukendt og effektiv terapeutisk strategi for udvalgte ikke-skjoldbruskkirtelkræft.

Materialer og metoder

menneskelige kræftceller

Tretten menneskelige kræftceller blev anvendt i denne undersøgelse, herunder melanom celler M14, UACC- 62 og A375; hepatiske carcinomceller HepG2 og SK-Hep-1; gastriske carcinomaceller MKN-7 og NUGC-4; koloncarcinomceller HT-29 og RKO; brystcarcinomaceller BT-20 og MDA-MB-231; glioblastoma cell T98G; og astrocytomcelle SNB-78. Disse celler var fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor /cellelinie Repository (Frederick, MD). M14, UACC-62, MKN-7, NUGC-4 og SNB-78-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Mediatech, Inc., Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, BT-20, MDA-MB-231, HepG2, SK-Hep-1, og T98G-celler blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. HT-29-celler blev dyrket i McCoys 5a Medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. De A375-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2.

Under disse dyrkningsbetingelser blev celler behandlet, hvor det er angivet, med MEK-inhibitor RDEA119, Akt inhibitor perifosine, og HDAC inhibitor SAHA enkeltvis eller i kombinationer. DMSO og PBS blev anvendt parallelt som kontrol køretøj.

Western blotting

Celler blev lyseret i RIPA buffer med standard proteasehæmmere (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) og standard Western blotting analyser blev udført som tidligere beskrevet [37] ved brug af primære antistoffer, herunder anti-phospho-ERK, anti-phospho-Akt, anti-Ac-histon H3, eller anti-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-Ac-histon H4 (Cell Signaling, Danvers, MA); eller anti-NIS-antistoffer (Millipore Corp., Billerica, MA).

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR

Efter en 30-h behandling af celler med de angivne inhibitorer, total RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) efter fabrikantens anvisninger. Tre ug samlet RNA blev revers-transskriberet under anvendelse af oligo-dT-primere og hævet III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ realtids-PCR blev præformet til at analysere ekspressionen af ​​

NIS

gen ved anvendelse iTaq SYBR Green Supermix med ROX (Bio-Rad, Hercules, CA) på en ABI 7900HT PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA). p-actin blev kørt parallelt for at standardisere input cDNA. De primere designet til

NIS

Ø-actin

gener og de metoder, der anvendes til beregning relative ekspressionsniveauer af

NIS

var som tidligere beskrevet [13].

radioaktivt iodid optagelse assay

Den radioaktive iodid optagelse assay blev udført som tidligere [13] beskrevne. Kort fortalt, efter en 30-h behandling med de angivne inhibitorer, blev celler inkuberet med 1 uCi Na

125I og 5 uM ikke-radioaktiv Nal i 2 ml medium på plader med 6 brønde ved 37 ° C i 1 time. For at bestemme NIS-specifik optagelse blev parallelle celler behandlet på lignende måde med inhibitorerne derudover behandlet med 200 pM NaCIO

4 i 30 minutter forud for Na

125I behandling. Mediet blev opsuget, og cellerne blev hurtigt vasket tre gange med Hanks balancerede saltopløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler blev derefter trypsiniseret og lyseret med 1 ml 0,33 M NaOH. Parallelle plader af celler identisk behandlet med inhibitorerne men uden radioaktivt jod inkubation blev anvendt til at bestemme antallet af celler ved afslutningen af ​​forsøget. Radioaktiviteten forbundet med celler blev talt med en gammatæller og præsenteres som cpm /10

6 celler efter korrektion for ikke-specifik radioiodide binding af celler i nærvær af NaClO

4.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chip assay blev udført under anvendelse af EZ-Magna chIP kit (Millipore Corp., Billerica, MA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, efter lægemiddelbehandlinger, 1 × 10

7-celler blev tværbundet med 37% formaldehyd i 10 minutter, efterfulgt af inkubation med glycin opløsning tilvejebragt i kittet i 5 min. Efter 2 vaske med PBS blev cellerne lyseret, og sonikeret 12 gange i 10 sekunder ved 20% puls strømkilde ved hjælp af Sonifier Cell Disrupter Model Micros-150D (Branson, Danbury, CT). Det tværbundne protein /DNA blev efterfølgende inkuberet natten over med anti-acetyleret histon H3, anti-acetyleret histon H4 antistoffer eller kontrol-ikke-specifik IgG og oprenset anvendelse af protein A-perler. Efter vask med pufferne i sættet i den rækkefølge per fastsatte protokol, protein A perler med protein /DNA-komplekser blev inkuberet med proteinase K ved 62 ° C i 2 timer under omrystning. DNA-fragmenter blev separeret derefter ved centrifugering og oprenset ved anvendelse af spin-søjler. Tre primerpar spænder over minimale essentielle promotorområdet af NIS-genet blev anvendt i analysen som tidligere [23] beskrevne. Standard slutpunkt PCR blev udført som følger: efter 3 min denaturering ved 95 ° C, blev reaktionsblandingen kørt i 32 cyklusser ved 94 ° C, 60 ° C, og 72 ° C ° hver i 30 sekunder, efterfulgt af en forlængelse ved 72 ° C i 8 min (for alle tre par primere).

Statistisk analyse

De data, der præsenteres her, er repræsentanter for mindst to lignende forsøg udført i duplikater eller tre eksemplarer. Forskellene mellem grupperne blev analyseret af

t

test og en

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.