PLoS ONE: En nøglerolle microRNA-29b til bekæmpelse af Colon Cancer Cell Migration American Ginseng

Abstrakt

Metastase af kolon kræftceller øger risikoen for dødelighed tyktarmskræft. Vi har for nylig vist, at amerikansk ginseng forhindrer tyktarmskræft, og en hexan ekstrakt af amerikansk ginseng (HAG) har særligt potente anti-inflammatoriske og anti-cancer egenskaber. Fejlreguleret microRNA (MIR) ekspression er blevet observeret i flere sygdomstilstande, herunder coloncancer. Brug global miR udtryk profilering, observerede vi øget miR-29b i kolon kræftceller efter udsættelse for HAG. Da MIR-29b spiller en rolle i reguleringen af ​​migrationen af ​​cancerceller, vi den hypotese, at HAG inducerer MIR-29b-ekspression til at målrette matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) for derved at undertrykke migrationen af ​​colon cancerceller. Resultater stemmer overens med denne hypotese. Vores undersøgelse understøtter den forståelse, at målrette MMP-2 ved miR-29b er en mekanisme, som HAG undertrykker migration af tyktarmskræft celler

Henvisning:. Poudyal D, Cui X, Le PM, Hofseth AB, Windust A , Nagarkatti M, et al. (2013) en central rolle for microRNA-29b til bekæmpelse af Colon Cancer Cell Migration American ginseng. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10,1371 /journal.pone.0075034

Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: August 7, 2013; Udgivet: 9. oktober, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Center for CAM Forskning i Autoimmune og inflammatoriske sygdomme, NIH tilskud 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, MN) og COBRE finansierede University of South Carolina center for Colon Cancer Research, NIH tilskud P20RR17698-01 (Franklin Berger, direktør). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i både mænd og kvinder og den tredje hyppigste årsag til kræft død. I USA, American Cancer Society anslået 141,210 nye tilfælde af kolorektal cancer og 49,380 dødsfald i 2011. Metastase fører til 90% af kræftrelaterede dødelighed [1], [2]. I princippet under metastase af CRC, nogle kræftceller fra primær tumor masse invadere omkringliggende væv, intravasate ind i karrene til at rejse gennem blod og lymfekar, anholdelse i fjerne kapillærer, ekstravasatet i parenkym af fjernt væv (primært lever og lunger), hvor de frø nye kolonier til dannelse af de makroskopiske sekundære tumorer [3]. Disse metastatiske cancerceller mister deres evne til at holde sig til de omkringliggende tumorceller og udvikle vandrende og invasive egenskaber til at formidle til fjerne metastatiske organer. Mens du gør det, de metastatiske celler undergår ændringer i genekspression og funktion, og derved få mere mesenchymal- lignende funktioner, og denne proces, der betegnes som Epithelial til Mesenchymale Transition (EMT), en afgørende begivenhed i malignitet. MikroRNA’er (Mirs) er små ikke-kodende RNA på ca. 22 nukleotider (NTS) lang, at post-transkriptionelt regulerer genekspression i planter og dyr. Hos dyr, Mirs target udskrifter gennem ufuldkommen baseparring af 2-7 NTS af 5′-enden af ​​miR (såkaldte »frø« sekvens) til flere steder i 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af target mRNA, og dette ufuldkomne miR-mRNA hybrider med centrale buler (nt 9-12) rekrutterer miRNP (microRNA ribonukleoproteinkompleks), der gør det muligt translationel hæmning eller exonucleolytisk mRNA henfald [Anmeldt i [4]]. Mange husholdning gener er udviklet med kortere længde af 3′-UTR at undgå miR regulering [5]. Ca. 50% af kommenteret humane mir gener er placeret i cancerassocierede genomiske regioner eller skrøbelige websteder, der er modtagelige for amplifikation, deletion og translokation i forskellige tumorer, herunder colontumorer [6]. På grund af dette nogle Mirs kunne fungere enten som tumorsuppressor eller onkogener [7], [8], [9], [10], [11]. Expression profilering analyse har afsløret karakteristiske MIR signaturer, der kan forudsige de kliniske resultater af CRC [12], [13].

En af de klassiske kendetegn for kræft er evnen til tumorceller at invadere og metastaserer [14] . Mirs er både positive og negative regulatorer af kræft metastaser [15], [16], [17]. En negativ regulator af kræft metastaser er miR-29b [For eksempel [18], [19], [20], [21], [22]]. MIR-29b hører til MIR-29 familien. MIR-29 familie består af tre paraloger: miR-29a, -29b og -29c. MIR-29a og MIR-29b1 er lokaliseret på kromosom 7q32; MIR-29b2 og MIR-29c er lokaliseret på kromosom 1q23 [23]. miR-29b1 og miR-29b2 sekvenser er identiske, men adskiller B1 og B2 på grund af forskellen i locus. MMP-2, en ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydende enzym, der har en væsentlig implikation i metastase og angiogenese har vist sig at være det direkte mål for MIR-29b [20]

amerikansk ginseng (AG.

Panax quinquefolius

) er en obligat skygge flerårig indfødte i Nordamerika. Fra Bioassay guidet fraktionering af AG, har vi for nyligt vist, at en Hexan del af AG (HAG) er et potent antioxidant og anti-cancermiddel [24], [25]. Til dato har kun begrænsede anti-cancer studier af lipofile ekstrakter af AG blevet udført, og disse undersøgelser er for det meste fokuseret på antiproliferative og cytotoksiske virkninger [26], [27], [28], [29]. For yderligere at forstå den anti-cancer mekanisme HAG (et lipofilt ekstrakt), studerede vi den rolle miR i kræft celle migration.

Materialer og metoder

Hexan Fraktion af AG

P. quinquefolius

ekstrakt er tidligere blevet beskrevet i detaljer af vores laboratorium [30]. Samt, har vi for nylig beskrevet dannelsen af ​​HOJ anvendt i den foreliggende undersøgelse [24].

Cell Cultures

HCT 116 vildtype (WT), LOVO og DLD-1 kolon cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HCT 116 celler blev dyrket i McCoys medium (ATCC, Manassas, VA); LoVo-celler var kulturen i F-12K medium (ATCC, Manassas, VA); og DLD-1-celler var kultur i RPMI-1640 medium. Alle medier blev suppleret med 10% serum fra nyfødte kalve (NBCs; GIBCO /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM glutamin (Biofluids, Rockville, MD), penicillin (10 U /ml, Biofluids) og streptomycin (10 ug /ml, Biofluids).

Global mir Expression

HCT 116 WT celler blev podet ved 1 × 10

6 celler /plade i 6 brønde i fire gentagelser. Efter dyrkning i 24 timer blev 260 ug /ml HAG tilsat til hver brønd. Celler blev høstet efter 0, 12, og 24 timer separat i RNase-frit EP rør. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Ambion, Austin, TX). RNA-koncentrationen blev bestemt ved NanoDrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng RNA fra HCT 116 WT-celler blev anvendt til NCounter miRNA Expression Assay v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA) indeholdende 800 miRNA efter producentens anvisninger.

MIR-29b Expression

celler blev podet, udsat for køretøj (kun medier) eller 260 ug /m HAG, og høstet ved 24 timer. For MIR-29b detektion blev 10 ng af total RNA anvendes til revers-transskribere til cDNA under anvendelse TaqMan miR Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner og MIR primers til HSA-MIR-29b til påvisning og den lille nukleare protein RNU6B (U6) til normalisering (Applied Biosystems). qPCR måling af MIR-29b og U6 ekspression blev udført under anvendelse af TaqMan miR Assays (Applied Biosystems) med 7300 PCR Assay System (Applied Bioystems). Den sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode blev anvendt til at evaluere den relative forekomst af MIR-29b i forhold til U6 ekspression (fold ændringer i forhold til U6). Alle eksperimentelle behandlinger blev udført på tre særskilte gange; hver gang med tre gentagelser.

siRNA og miR transfektion

I MMP-2 siRNA, 1,5 × 10

5-celler blev dyrket i medium i plader med 6 brønde 1 dag før transfektion. Brug af INTERFERin siRNA transfektionsreagens (Plyplus, iLllkirch, Frankrig), blev cellerne transfekteret med 5 nM af MMP-2 Trilencer-27 human siRNA (Origene, Rockville, MD). Efter 48 timers transfektion blev cellerne behandlet til western blot-analyse for at evaluere effekten af ​​knock down (Fig S3). For Mirvana-MIR-29b inhibitor og Mirvana-Negativ kontrol inhibitor (Ambion, Austin, TX) transfektion, 1,5 × 10

5-celler blev dyrket i medium i plader med 6 brønde 1 dag før transfektion. Brug af INTERFERin siRNA transfektionsreagens (POLYPLUS Transfektioner, Illkirch, Frankrig), blev cellerne transficeret med 10 nmol /l af Mirvana-MIR-29b inhibitor eller Mirvana-Negativ kontrol inhibitor. Efter 48 timers transfektion blev cellerne høstet i RNase-frit EP rør. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol Regent. RNA-koncentrationen blev bestemt ved NanoDrop 2000. 10 ng af total RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit med microRNA primers til HSA-MIR-29b og den lille kerneprotein RNU6B (U6) for normalisering. qPCR måling af miRNA-29b og U6 udtryk blev udført ved hjælp af TaqMan miRNA tests med 7300 PCR Assay System. Den relative gange ændring i MIR-29b plan blev anvendt til at repræsentere den relative forekomst af miRNA-29b sammenlignet med U6 ekspression. Som pr leverandøren af ​​Mirvana-MIR-29b inhibitor (Ambion af Life Technologies, Austin, TX), den effektivitet, hvormed pattedyrcellerne transficeres med Mirvana-miR inhibitor afhænger af celletypen og transfektion middel. Det anbefales blive udført for at opnå den maksimale aktivitet med minimal cytotoksicitet at optimeringseksperiment (Koncentrationer fra 1 nM til 100 nM miR inhibitor). Transfektionen effekt og oprindelsen af ​​3 cellelinier HCT116, LoVo og DLD-1 er forskellige, og fra optimeringseksperiment (data ikke vist) viste Mirvana MIR-29b Inhibitor maksimal aktivitet ved 10 nM efter 48 timers transfektion for HCT116 celler og 50 nM for LoVo og DLD-1-celler. Efter 48 timers transfektion med Mirvana-MIR-29b Inhibitor blev HAG (260 ug /ml) tilsat i 24 timer, og celler blev høstet for målgen (MMP-2) ekspression og for migration assay. Alle eksperimentelle kontrolprøver blev behandlet med et lige koncentration af et ikke-targeting inhibitor negativ kontrol sekvens, til anvendelse som kontroller for ikke-sekvensspecifikke virkninger i MIR eksperimenter. Mock-transficerede kontroller gav ikke nogen signifikant effekt på nogen af ​​de analyserede parametre.

mRNA Analyse

Samlet RNA blev ekstraheret ved anvendelse Trizol reagens (Invitrogen, CA). Et ug totalt RNA tjente som template for enkeltstrenget cDNA-syntese i en reaktion under anvendelse af oligo (dT) primere og AMV revers transkriptase (Promega Corp, WI) under betingelser, der er angivet af fabrikanten. PCR af cDNA prøver blev udført med prøver amplificeret i 30 cykler denaturering ved 94 ° C i 30 s, annealing ved 50 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 30 s med endelig ekstension ved 72 ° C i 10 min . Sekvenserne for Real Time PCR anvendte primere var: MMP-1 fremadrettet 5′-AGG TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 ‘; MMP-1 Reverse 5’-CTG GTT GAA AAG CAT GAG CA-3 ‘; MMP-2 fremadrettet 5’-ACA TCA AGG GCA TTC AGG AG-3 ‘; MMP-2 Reverse 5’-GCC TCG TAT ACC GCA TCA AT-3 ‘; MMP-7 fremadrettet 5’-GAG TGC CAG ATG TTG CAG AA-3 ‘; MMP-7 bagside 5’-AAA TGC AGG GGG ATC TCT TT-3 ‘; MMP-9 fremadrettet 5’-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3 ‘; MMP-9 bagside 5’-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-3 ‘og GAPDH fremadrettet 5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′, GAPDH bagside 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3 ‘( integrerede DNA Technologies, Inc). Real-time PCR (qPCR) blev udført ved anvendelse af 7300 Real-Time PCR Assay System (Applied Biosystems, CA) med Power SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) og primere for MMP-1, -2, -7, -9 og GAPDH ifølge leverandørens protokol. MMP-genekspression blev normaliseret ved GAPDH-genekspression. Folden ændring i genekspression er i forhold til vektoren behandlet [1x phosphatpufret saltvand (PBS)] celler høstet ved 24 timer. Salg

Western blot analyse og antistoffer Salg

Western blots blev udført som tidligere beskrevet [31]. Antistoffer anvendes, omfatter: MMP-2 (Polyklonalt, fortyndet 1 i 500, cat # 4022s; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), og GAPDH (Polyklonalt, fortyndet 1 i 1000, cat # 5174; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). For alle de blots, et standard protein (BenchMark Prestained Protein Ladder, Invitrogen, Carlsbad CA) blev kørt for at sikre den korrekte molekylære vægt af hver bånd observeret. Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin sekundære antistoffer blev indkøbt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Sekundære antistoffer blev fortyndet til 1:2000. Alle antistoffer blev fortyndet i 5% mælk /PBST (0,1% Tween 20 i 1 × PBS). Western blot signal blev opdaget af Pierce ECL Western Blotting Substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) og udviklet på Hyperfilm.

In Vitro

Assay For Migration

24 godt Costar Transwell permeable support med en 8-um porestørrelse polycarbonatmembran (Corning Incorporated, NY), og med en 6,5 mm insert blev anvendt til at analysere migrationen af ​​tumorceller. Til denne migration assay blev Transwell membran gennemvædet med 15 ug /ml collagen type I (BD Biosciences) i 30 minutter ved 37 ° C i serumfrit medium. Collagen blev fjernet ved pipettering og collagen coatede membran var sted på en plade med 24. Celler blev serum sultet i 12 timer og 50.000 celler blev resuspenderet i 200 pi serumfrit medium (SFM) og overført på den øverste kammer i Transwell. Den nederste kammer blev fyldt med 750 pi SFM eller Komplet vækstmedium (10% NCS suppleret, som kemoattraktant for celler) eller HAG (260 ug /ml i komplet medium). Transwell Pladen blev inkuberet ved 37 ° C i 12 timer. Efter inkubation blev mediet fjernet fra kammeret, Transwell membranen blev vasket i 1X PBS og cellerne blev fikseret med formaldehyd (3,7% i PBS) og permeabiliseret med 100% methanol og farvet med 0,4% Crystal violet plet. Membranen blev vasket med 1X PBS, og ikke-migrerede på toppen af ​​Transwell membran blev skrabet med steril vatpind. Transwell membran blev skåret ud fra Transwell kammer og fikseret på mikroskopisk objektglas med Permount og set under mikroskop (100 x forstørrelse). 7 tilfældige snit blev fotograferet fra hvert objektglas og de migrerede celler på bunden af ​​transwell membran blev automatisk talt ved hjælp af Image J software (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Statistisk analyse

for global miR analyse, alle data blev importeret til NSolver Analysis Software v1.0 (Nanostring Technologies) og normaliseret til den geometriske middelværdi af de 100 Mirs med det højeste udtryk værdier. Normaliseret data blev importeret til BRB-ArrayTools v4.1.0 til analyse. Forud for analyse, data blev filtreret, hvor som helst værdi mindre end 10 blev udeladt, og enhver miR mangler i 50% af prøverne blev udelukket forlader 248 Mir til analyse. Kriterierne filtrering blev sat sådan, at enhver normaliserede datapunkt 10 eller log2 transformerede data værdi 3,321928 blev kaldt mangler og blev udelukket, fordi det er på niveau med baggrunden. Kun de datapunkter 10 eller log2 transformerede data værdi 3.321928 blev taget i betragtning, og bestået filtreringskriterier forlader 248 Mirs til analyse. Klasse sammenligning test udnyttet Student T-test for at sammenligne Mir af behandlede versus ubehandlede celler. Trend tests anvendt lineær regression modellering på ordnede kategoriske variabler af 0 timer, 12 timer og 24 timer. Den Benjamini-Hochberg fremgangsmåde blev anvendt til at beregne falske opdagelse satser. Når mere end to grupper blev sammenlignet, vi bestemt statistiske forskelle ved hjælp af en envejs variansanalyse, efterfulgt af en Scheffe multiple sammenligning test. Hvis to grupper blev sammenlignet, anvendte vi en t-test. P-værdi er valgt for signifikans i denne undersøgelse var 0,05.

Resultater

HAG Fremkalde miR-29b i Colon Cancer Cells

American ginseng og HAG har begge udøvet forebyggende effekt på den kemisk induceret coloncancer model [24], [32]. For at starte vores undersøgelse, da Mirs har vist sig at have både pro-tumor og anti-tumor egenskaber, vi kiggede på effekten af ​​HAG på global miR udtryk i tyktarmen kræftceller. Der var en signifikant positiv korrelation i 2 Mirs, og signifikant negativ korrelation i 6 Mirs efter eksponering af HCT 116 celler til HAG (260 ug /m) for 0 timer, 12 timer og 24 timer (tabel 1). Baseret på den forståelse, at miR-29 familien er blevet nedreguleret i flere maligniteter [21], [23], [33], [34], at flere undersøgelser har vist, at op regulering af miR-29 at have anti-tumor effekt [22], [35], og at øget ekspression af miR-29b blev vist med to forskellige statistiske metoder (tabel 1 og 2), vi fokuseret på denne miR. For at bekræfte miR-29b opregulering af HAG, vi gentog eksperimentet og undersøgt miR-29b opregulering af QRT-PCR. I overensstemmelse med de globale miRNA analyseresultater, Figur 1 viser, at der blev øget miR-29b udtryk (7.3 gange) med eksponering af HCT 116 celler til HAG. Der var også en stigning i MIR-29b ekspression med eksponering af to andre tyktarmskræft cellelinjer (DLD-1, 3,1-fold; og LoVo, 1,5-fold). (Figur 1)

HCT 116, DLD -1, og LoVo celler blev udsat for 260 pg /mL HAG i 24 timer (n = 3 pr tidspunkt). Relative endogene MIR-29b ekspressionsniveauer blev påvist ved QRT-PCR under anvendelse af Taqman primere og prober til påvisning modne MIR-29b og den lille nukleare RNA RNU6B (U6), en intern kontrol. Relative MIR-29b ekspressionsniveauer blev normaliseret til den gennemsnitlige værdi af de ikke-behandlede prøver (0 h). * Angiver signifikant forskel (p-værdi 0,005). Fra 0 h kontrol Vejviser

HAG Undertrykker MMP-2 Expression I Colon Cancer Cells

Potentielle mål gener af miR-29b blev først forudsagt ved hjælp af online-databaser, herunder miRTarBase, Targetscan, PicTar, og MIRANDA. MMP-2 blev forudsagt at være det potentielle mål for MIR-29b i alle disse databaser (figur 2A). Fordi MMP-2 er overudtrykt i tumorvæv [36], [37], [38], og har en direkte konsekvenser i metastase og angiogenese af cancerceller [39], [40], vi først undersøgt virkningerne af HAG på MMP -2 ekspression. Behandling af HCT-116 celler med HAG i 24 timer resulterede i en reduktion af MMP-2-genekspression med ca. halvdelen fold [(1 ± 0,14 til 0,57 ± 0,05), p-værdi = 0,078] (figur 2B). HAG behandling i 24 timer, reducerede signifikant ekspressionen af ​​MMP-2-gen i DLD-1 celler [(1 ± 0,03 til 0,03 ± 0,01), p-værdi 0,005] (figur 2D). Tilsvarende behandling af LoVo-celler med HAG i 24 timer resulterede i en reduktion af MMP-2-ekspression [(1 ± 0,06 til 0,74 ± 0,017), p-værdi 0,05] (figur 2F). For at kontrollere, om HAG reducerer MMP-2-aktivitet, blev HCT-116 celler behandlet med HOJ for 24 timer og MMP-2-protein blev analyseret. Figur S4, HAG reducerede pro- og aktiv- MMP-2 proteinekspression; bekræfter, at HAG reduceret MMP-2-aktivitet og genekspression. Derudover andre ECM nedbrydende MMP’er, såsom MMP-1, MMP-7 og MMP-9-genekspression blev ikke reguleret af HAG behandling (tabel S2). Interessant, disse MMP (MMP-1, -7 og -9) er ikke den direkte mål for miR-29b.

(A) miR-29 familie (miR-29a /b /c) og dens formodede bindende sekvens i 3′-UTR af MMP-2-gen. Frøene sekvens af MIR-29 familie er vist i kassen. (B) HCT116 WT celler blev udsat for 260 pg /mL HAG i 24 timer. (C) HCT116-celler transficeret med 10 nM Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponeret for 260 mikrogram /ml HAG i 24 timer. (D) DLD-1 celler blev udsat for 260 pg /mL HAG i 24 timer. (E) DLD-1 celler transficeret med 50 nM Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponeret for 260 mikrogram /ml HAG i 24 timer. (F) LoVo celler blev udsat for 260 pg /mL HAG i 24 timer. (G) LoVo-celler transficeret med 50 nM Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponeret for 260 mikrogram /ml HAG i 24 timer. Relativ MMP-2 ekspressionsniveauet blev påvist ved QRT-PCR. MMP-2 mRNA for hver prøve blev normaliseret ved GAPDH-ekspression. Fold ændring i MMP-2-mRNA-niveau var beslægtet med ikke-behandlede celler høstet ved 0 timer (n = 3 pr tidspunkt). Resultater indikerer den Hexan Fraktion af AG undertrykker MMP-2-mRNA-niveau sammenlignet med de ikke-behandlede celler. *, Indikerer signifikant forskel, P-værdi. 0,05 fra 0 h kontrol

Endvidere at kontrollere, om HAG medierede undertrykkelse af MMP-2-genet er afhængig af miR-29b, vi tavshed miR- 29b (fig S1) med en mIR-29b-inhibitor (se metoder 4.2.5). HAG ikke undertrykke MMP-2 genekspression når miR-29b er bragt til tavshed (figur 2C, 2E og 2G). I virkeligheden er der en 2,4 gange forøgelse i ekspression af MMP-2 i MIR-29b tavshed HCT116 celler, når de udsættes for HAG, 24 timer (figur 2C). Der var noget fald i MMP-2-genekspression i MIR-29b tavshed DLD-1 og LoVo coloncancerceller når de udsættes for HAG, 24 timer (figur 2E og 2G). Alle sammen, disse resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at undertrykkelsen af ​​MMP-2 ved HAG er afhængig af miR-29b.

HAG Undertrykker Migration af tyktarmscancerceller

MIR-29b mål nøgle spillere at undertrykke invasionen og metastase [19], [20], [21], [22]. MMP-2 er involveret i migration af tyktarmskræft celler (tabel S1, figur S2). Omkring 3,5 gange reduktion i antallet af celler migreret /mikroskopisk felt i HCT116 celler MMP-2 knock /ned celler sammenlignet med HCT116 WT celler i nærvær af 10% serum som kemoattraktant er rapporteret (tabel S1, figur S2). Dette er en klar indikation af, at MMP-2 er en nøglefaktor i reguleringen af ​​celle migration, men det bør ikke udelukkes, at andre ECM nedværdigende MMP’er såsom MMP-1, MMP-7, MMP-9 og MMP-13 har blevet vist være forbundet med kolorektal cancer progression [37], [41], [42], [43], [44]. Da HAG opregulerer MIR-29b ekspression og nedregulerer ECM enzym MMP-2-genekspression, vi undersøgt yderligere den funktionelle virkning HAG på cancercelle migration. I HCT116 celler, HAG undertrykte migrering af kræftceller med næsten 7 gange (figur 3A og 3C). I miR-29b tavshed HCT-116 celler, HAG ikke undertrykke migration. I overensstemmelse med MMP-2 resultat (Figur 2C), i fravær af MIR-29b-aktivitet, HAG forhøjet antallet af celler migrerer til det nedre kammer i Transwell membran ved næsten 2,5 gange sammenlignet med den positive kontrol (figur 3B og 3D). Tilsvarende HAG undertrykt migration af DLD-1 celler kun i nærvær af MIR-29b, hvor den reducerede antallet af migrerende celler ved næsten 5 gange sammenlignet med den positive kontrol (figur 4A og 4C). HAG ikke udøvede antimigrationsvirkning aktivitet, når MIR-29b blev stille i DLD-1-celler (figur 4B og 4D). Samlet set resultater her viser miR-29b er ved en skillevej i evne HAG at udøve anti-vandrende aktiviteter.

Collagen type I (15 mikrogram /ml) belagt transwell kammer blev anvendt med 5 × 10

4 HCT116 celler (A /B) i 12 timer. Det nedre kammer indeholder SFM /Serum (10%) eller HAG (260 ug /ml i komplet medium). (A) 5 × 10

4 HCT116 WT celler blev anvendt til det øvre kammer i Transwell membran. (B) 5 × 10

4 HCT116 (transficeret med Mirvana MIR-29b, 10 nM, 48 h) blev cellerne påført det øvre kammer af Transwell membran. Efter 12 timers inkubation ved 37 ° C, cellerne migreret til indersiden (nedre membran) af Transwell membran blev talt under anvendelse ImageJ software (7 tilfældige mikroskopiske felter (100x) blev evalueret for celletælling). (C) viser de repræsentativt billede af HCT116 WT celle migration fra hver behandling. (D) viser de repræsentativt billede af HCT116 (transficeret med Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) celle migration fra hver behandling. Baggrunden på billedet viser den 8 um pore i transwell membran. * Angiver signifikant forskel (p-værdi 0,005) sammenlignet med SFM. #, Angiver signifikant forskel (p-værdi 0,005). I forhold til 10% Serum

Collagen type I (15 mikrogram /ml) belagt transwell kammer blev anvendt med 5 × 10

4 DLD-1-celler (A /B) i 12 timer. Det nedre kammer indeholder SFM /Serum (10%) eller HAG (260 ug /ml i komplet medium). (A) 5 × 10

4 DLD-1 WT celler blev anvendt til det øvre kammer i Transwell membran. (B) 5 × 10

4 DLD-1 (transficeret med Mirvana MIR-29b, 10 nM, 48 h) blev cellerne påført det øvre kammer af Transwell membran. Efter 12 timers inkubation ved 37 ° C, cellerne migreret til indersiden (nedre membran) af Transwell membran blev talt under anvendelse ImageJ software (7 tilfældige mikroskopiske felter (100x) blev evalueret for celletælling). (C) viser de repræsentativt billede af DLD-1 WT celle migration fra hver behandling. (D) viser de repræsentativt billede af DLD-1 (transficeret med Mirvana miR-29b, 10 nM, 48h) celle migration fra hver behandling. Baggrunden på billedet viser den 8 um pore i transwell membran. * Angiver signifikant forskel (p-værdi 0,005) sammenlignet med SFM

Diskussion

Her har vi vist, at HAG undertrykker migration af tyktarmskræft celle.. Denne anti-metastatisk egenskab HAG er medieret af opregulering af microRNA-29b, som direkte retter sig mod og nedregulerer et centralt molekyle involveret i metastase, MMP-2

Global miR-analyse af HAG -. Behandlet HCT116 celler resulterede i forhøjede udtryk for miR-29b, der matchede både tendensen og fold-skifte statistisk analyse (tabel 1 og 2). Der var 8 miRNA (HSA-miR-938, HSA-mir-203, HSA-miR-1975, HSA-miR-29b, HSA-miR-600, HSA-miR-1244, HSA-miR-548o og HSA-miR -590-5p), der var statistisk (p 0,05) op eller nedreguleret. En positiv korrelationskoefficient indikerede øget niveauer af miR med øget eksponering for HAG (0 h til 12 h til 24 h) med kun 2 Mirs (HSA-miR-29b og HSA-miR-590-5p) henhørende under denne kategori. Af disse 2 Mirs, miR-29b havde den højeste korrelationskoefficient værdi på 0,621. Samt, da MIR-29b var også statistisk signifikant opreguleret ved HAG i folden ændring analyse (tabel 2), og at denne miR er blevet vist af andre for at spille en tumor suppressor rolle [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], vi fokuseret på miR-29b for denne særlige undersøgelse. Rolle MIR-29b som en tumor suppressor er blevet godt belyst i flere maligniteter, herunder, AML [23], [45], lunge [33], CLL [46], [47] og cholangiocarcinom [48]. Nedregulering af MIR-29 familien er blevet rapporteret i adskillige humane cancere herunder lunge [49], prostata [50], invasiv brystcancer [51]. For nylig, Kuo et’al har rapporteret en lavere ekspressionsniveau af MIR-29a /C i en kolorektal cancer tidligt tilbagefald gruppe sammenlignet med en ikke-tidlig recidiv gruppe, som angiver ekspression lavt niveau af MIR-29a /c som en potentiel biomarkør for tidlig tilbagevenden af ​​CRC [52]. Vores resultater har bedre belyst de mulige mekanismer dette fund

MIR-29 familie består af tre medlemmer:. MiR-29a, miR-29b, og miR-29c (miR29a /b /c), der viser høj sekvens lighed og deler en fælles frø sekvens for target anerkendelse (figur 2A). Andre har rapporteret et omvendt forhold vedrørende ekspression af MIR-29b og MMP-2 [20], [22], [53], [54]. Samt, fordi MIR-databaser (miRTarBase, Targetscan, PicTar, og Miranda) angiver MMP-2 som et potentielt mål for miR-29b, vi undersøgte den funktionelle betydning af dette. MMP-2, også kendt som gelatinase A eller type IV collagenase, er en ECM-nedbrydende enzym, og er bredt udtrykt i de fleste væv og celler [55]. Samt, er MMP-2 overudtrykkes i tumorvæv [36], [37], [38] og aktivering af MMP-2 resultater i ECM-nedbrydning, hvilket letter invasionen og metastase af tumorceller [56]. Vores realtid RT-PCR-data viste, at HAG reducerer MMP-2-ekspression med 2 gange i HCT116-celler og til ca. 30 gange reduktion i DLD-1-celler (figur 2C og 2E). HAG reducerede også MMP-2-protein-ekspression (figur S4). Når miR-29b aktivitet tavshed ved transfektion kolon kræftceller med en Mirvana miR-29b Inhibitor (figur S1), HAG har ingen effekt på reduktion af MMP-2-ekspression (figur 2C, 2E og 2G) og i nogen grad fremkaldt MMP -2 ekspression. Årsagen kan skyldes fravær af endogen MIR-29b, HAG var ikke i stand til at regulere MIR-29b, som yderligere styrket MMP-2 sekretion. Nogle af de komponenter, der findes i HAG, kunne have potentiale til at øge MMP-2-ekspression direkte i fravær af endogen miR-29b, men dette behøver yderligere undersøgelse for at blive bekræftet. Derfor en kraftig isolering proces af aktive komponenter i HAG er undervejs, og fremtidige undersøgelser vedrørende dette er i linjen. Alle sammen, vores data tyder på, at MIR-29b er kritisk for HAG at undertrykke MMP-2-ekspression i cancerceller.

Matrixmetalloproteinaser er blevet betragtet som vigtige molekyler bistå tumorceller under metastase [57], [58 ], [59], [60]. De MMP’er er en familie af zinkholdige endopeptidaser bedst kendt for deres rolle i fysiologiske og patologiske ombygning af ECM under angiogenese, sårheling, embryogenese, tumormetastase, og forskellige kardiovaskulære og inflammatoriske sygdomme [61], [62]. Det er blevet vist, at MIR-29b er involveret i den negative regulering af metastase i flere cancertyper [18], [20], [63]. Ved at kombinere disse resultater, hvor miR-29b er en negativ regulator af metastaser og mål nøglespiller af metastaser MMP-2, og HAG inducerer miR-29b og undertrykker MMP-2-ekspression (tabel 1 og 2, figur 1, 2 og S4), vi stillede spørgsmålet, om HAG funktionelt undertrykker metastase af tyktarmskræft celler. Vi viste, at HAG funktionelt undertrykker

in vitro

metastase af tyktarmskræft celler ved at udføre migration assay af tyktarmskræft celler (figur 3A, 3C, 4A og 4C). I fravær af MIR-29b-aktivitet, HAG var ikke effektiv i at undertrykke migrationen af ​​colon cancerceller (fig 3B, 3D, 4B og 4D). Selv om der endnu ikke er vist

in vivo

, alle sammen, vores

in vitro

data indikerer, at HAG udfører sin anti-metastatisk aktivitet ved at regulere miR-29b.

Major komponenter til stede i hexan ekstrakt (lipofil ekstrakt) af AG er polyacetylener (Panaxydiol, panaxydol og panaxynol), der omfatter omkring 50% af den samlede ekstrakt, samt fedtsyrer, med næsten ingen ginsenosides [24]. Vi har for nylig vist, at HAG besidder anti-inflammatoriske og anti-cancer egenskaber [24]. Flere andre undersøgelser af anti-inflammatoriske og anti-cancer egenskaber af amerikansk ginseng har fokuseret på ginsenoside eller saponin indhold af ginseng [64], [65], [66], [67], som opnås fra en vandig ethanolekstrakt (polært opløsningsmiddel) af ginseng.