PLoS ONE: Funktionel Cross-Talking mellem differentielt udtrykte og alternativt splejsede gener i Human Liver Cancer celler behandlet med Berberin

Abstrakt

Berberin er blevet identificeret med anti-proliferative virkninger på forskellige kræftceller. Mange forskere har forsøgt at belyse de anti-cancer mekanismer Berberin baseret på differentielt udtrykte gener. Men måske forskelligt alternative splejsning gener fremkaldt af Berberin også bidrage til dets farmakologiske virkninger og er ikke blevet rapporteret endnu. Desuden potentielle funktionelle cross-tale mellem de to sæt af gener fortjener yderligere udforskning. I denne undersøgelse blev RNA-seq teknologi anvendes til at detektere de differentielt udtrykte gener og differentielt alternative splejsede gener i BEL-7402 cancerceller induceret af berberine. Funktionel berigelse analyse indikerede, at disse gener hovedsagelig blev beriget i p53 og cellecyklus signalvej. Desuden blev det statistisk bevist, at de to sæt af gener var lokalt co-beriget langs kromosomer, tæt forbundet med hinanden på grundlag af protein-protein-interaktion og funktionelt ligner på Gene ontologi træ. Disse resultater antydede, at de to sæt af gener reguleret af berberine kan være funktionelt tværs talt og i fællesskab bidrage til dens cellecyklus standsning virkning. Det har givet nye spor for yderligere undersøgelser på de farmakologiske mekanismer Berberin samt de andre botaniske stoffer

Henvisning:. Sheng Z, Sun Y, Zhu R, Jiao N, Tang K, Cao Z, et al . (2015) Funktionel Cross-Talking mellem differentielt udtrykte og alternativt splejsede gener i Human Liver Cancer celler behandlet med Berberin. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10,1371 /journal.pone.0143742

Redaktør: Emanuele Buratti, International Center for Genetic Engineering og Bioteknologi, ITALIEN

Modtaget: Maj 14, 2015; Accepteret: November 9, 2015; Udgivet: November 25, 2015

Copyright: © 2015 Sheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af National High Technology Research og Development Program ( “863” Program) Kina (2012AA020405) og Finansiering af Ministeriet for Sundhed (2012ZX10005001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : DASG, differentielt Alternative splejsede gener mellem to prøver; DEG, Differentielt udtrykte gener mellem to prøver Salg

Indledning

Alternativ splejsning er en tæt reguleret proces under genekspression, der kan producere forskellige former af et protein fra det samme gen. Desuden er det blevet bevist, at alternativ splejsning også kan bestemme bindingsegenskaber, intracellulær lokalisering, enzymatisk aktivitet, proteinstabilitet og posttranslationelle modifikationer af et stort antal proteiner [1]. I de seneste år, mere og mere farmakologiske forskere har fundet, at små molekylære medikamenter kunne udøve deres farmakologiske virkninger ikke kun gennem regulering transkriptionsniveauer af gener, men også gennem skiftende gen alternativ splejsning [2].

Berberin, en isoquinolin kvaternær alkaloid isoleret fra Berberis arter [3], har et bredt spektrum af farmakologiske virkninger, såsom anti-mikrobe, anti-diabetes og anti-inflammation [4]. Klinisk er det blevet anvendt til behandling af en række lidelser, herunder koronararteriesygdom, diabetes, ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, hyperlipidæmi, metabolisk syndrom, fedme og polycystisk ovariesyndrom (https://www.clinicaltrials.gov/). For nylig har akkumulerende undersøgelser vist, at Berberin også besad potent anticancer aktivitet, med få eller minimale uønskede toksiske virkninger [5, 6]. Derfor har mange forskere forsøgt at belyse de anti-cancer mekanismer Berberin baseret på gen-differentiel ekspression. For eksempel er det rapporteret, at berberine kunne inducere apoptose i HepG2 celler gennem AMPK-medieret mitokondrisk pathway ved at øge forholdet Bax /Bcl-2 [7]. I vores tidligere undersøgelse, vi har også fundet, at Berberin kunne fremkalde G1 cellecyklusstop i BEL-7402 celler delvist via forstyrre interaktionen af ​​calmodulin med CaMKII og blokering efterfølgende p27 protein nedbrydning. [8]

Selv om disse værker har givet nogle grundlæggende viden om anticancer mekanisme Berberin, alternativ splejsning i kræftceller efter behandlet med Berberin er ikke blevet rapporteret endnu. For det første er det blevet antydet, at mange anticancerlægemidler kunne hæmme væksten af ​​cancerceller ved at ændre genet alternativ splejsning [9-11]. Desuden er det rapporteret, at gentranskription og alternativ splejsning kan være fysisk og funktionelt koblet [12, 13], hvorved fællesskab bidrage til de farmakologiske virkninger af disse lægemidler. Derfor er det nødvendigt samtidigt at måle de differentielt udtrykte gener (DEGS) og de differentielt alternativt splejsede gener (DASGs) i cancerceller efter behandling med berberin og systematisk undersøge, om der er nogen form for funktionel cross-tale mellem disse to sæt af gener .

for ovennævnte spørgsmål, den nyeste næste generation sekventering teknologi (RNA-seq) blev anvendt til at opnå den transkriptom profilering af BEL-7402 celler efter Berberin behandling. Derefter blev DEGS og DASGs induceret af berberine omhyggeligt detekteres af en suite af sekvens analyseværktøjer. Endelig blev den funktionelle krydstale mellem disse degs og DASGs statistisk analyseret og deres mulige bidrag til anticancer effekt af Berberin blev drøftet.

Materialer og metoder

Cell kultur

etableret human leverkræft cellelinje (BEL-7402, kat. nr .: TCHu_10) [8, 14, 15] blev købt fra og deponeret i cellen bred af institut for Biokemi og Cellebiologi, Shanghai Institutes for Biologisk institut, kinesisk Academy of Science (https://www.cellbank.org.cn/) og venligst stillet til rådighed af Dr. Xuan Liu (Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, PRChina). Celler blev holdt i en befugtet 37 ° C atmosfære indeholdende 5% CO

2 og dyrkes i RPMI-1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM /L-glutamin, 50 enheder /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. I denne undersøgelse har vi puljet 3 ~ 5 biologiske gentagelser i en RNA-seq eksperiment for at opnå den samme mængde af total RNA indhold. Mere specifikt ved celledyrkning sektionen, kræftceller i 8 ~ 10 forskellige petriskåle blev inddelt i to lige store grupper. En gruppe blev anvendt som berberine behandlede gruppe, den anden blev anvendt som kontrol /ubehandlet gruppe.

RNA-isolering

I ekstraktion af total RNA blev celler udpladet på 10-cm plader (Corning, Acton, MA, USA) i komplet medium i 12 timer. Derefter 50 uM berberine (renhed ≥ 98%, Tauto Biotech, Shanghai, Kina, IC50 ifølge Ref. [8]) blev tilsat, og efterlades i kontakt i 24 timer. Derefter blev cellerne skyllet i PBS og lyseret i TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Residual kontaminerende genomisk DNA blev fjernet fra totalt RNA fraktionen under anvendelse Turbo DNA-free kit (Ambion, Austin, TX, USA). mRNA blev isoleret fra DNA-free total RNA under anvendelse af Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Endelig, for at opnå tilstrækkelig mængde af mRNA indhold til sekventering, blev det totale RNA-prøver fra hver gruppe lagt sammen som én samleprøve.

Transkriptomet sekventering

mRNA udvælgelse, bibliotek forberedelse og sekventering blev udført af Shanghai ceneter for Bioinformation Technology (SCBIT) på en Illumina Hiseq 2000 sekventering platform i henhold til producentens specifikationer. Kort fortalt blev mRNA vælges ved hjælp oligo (dT) prober og derefter fragmenteret under anvendelse af divalente kationer. cDNA’er blev syntetiseret under anvendelse vilkårlige primere, modificeret og beriget til fastgørelse til Illumina flowcellen. Vi sekventeret to 60-cyklus 100 bp × 2 parret-end baner, genererer ~ 83.100.000 læser.

Læs justering

Rå sekventering læser blev trimmet ud Ns og regioner lav kvalitet (gennemsnitlig basis kvalitet score i en 5-mer slide-vindue mindre end 20, dvs. sekventering fejlrate ≤1%). Læs-par med mindst 36 bp tilbage i hver læst blev holdt som rene læser. Sekventering kvalitet blev vurderet ved anvendelse FastQC [16]. Derefter ren læser blev kortlagt til humant henvisning genom (Ensembl GRCh37.66 = hg19) ved hjælp af aligner Tophat [17] (version 2.0.6) med parametre (-r /-inner-mate-afstand: 70, -g /-max -multihits: 1, -ingen-dækning-søgning, -no-roman-junc, de andre som standard). Udgangene af Tophat blev brugt som input til HTSeq [18] og AltAnalyze [19] for at udføre gen forskellen udtryk eller alternativ splejsning analyse henholdsvis.

Differential genekspression analyse

degs (differentielt udtrykte gener) refererer til de gener med væsentlige ændringer i deres udtryk niveau. For det første blev antallet af læser kortlagt til den genomiske region af hvert gen for hver prøve estimeret med HTSeq [18]. Derefter DESeq [20] blev anvendt til at vurdere forskellen i genekspression mellem forskellige prøver. Endelig blev degs filtreret af følgende regler:. 1) den absolutte værdi af log2 [fold-ændring] var større end 1. 2) p-værdien var mindre end 0,05

Differentielt gen alternativ splejsning analyse

DASGs (differentielt alternative splejsede gener) refererer til de gener uden eller små variationer i deres hel-genekspression niveau, men væsentlige ændringer i deres exon forbrug, især de alternative exons (Fig 1). Differential splejsning analyse beskriver forskellene i alternativ brug splejsning websted mellem to prøver, som er afgørende for undersøgelser med mekanismer for alternativ splejsning og dets regulering, og i stand til at afdække funktionel mangfoldighed, der er savnet ved differentiel genekspression analyse [21]. Snesevis af tilgængelige softwareværktøjer og pakker, såsom Cuffdiff2 [22], miso [23], DEXseq [24], DEGseq [25], DiffSplice [26], Splejsning kompas [27], AltAnalyze [19] og osv, tog begrebsmæssigt forskellige tiltag, der kunne identificere differentiel splejsning på niveauet for isoform /transkript, exon, eller begge dele. Men valget af en egnet metode til undersøgelse, afhænger af den eksperimentelle mål og forventede resultat,. Blandt disse fremgangsmåder og pakker, kun AltAnalyze tilvejebringer en grafisk brugergrænseflade, mens resten køres på Commend linje. Desuden, AltAnalyze giver en bekvem arbejdsgang at udtrække de betydelige alternativ splejsning regulering begivenheder og efterfølgende undersøge de potentielle biologiske konsekvenser af sådanne splejsningsbegivenheder og relaterede mekanismer i forbindelse med molekylære interaktioner og bindingssteder [19]. Flere algoritmer er tilgængelige i AltAnalyze at identificere individuelle funktioner (exons eller vejkryds) eller gensidige vejkryds, der er forskelligt reguleret i forhold til genekspression ændringer. I dette arbejde, blev enkelt funktion analyse (splejsning Index, SI) umiddelbart efter gensidige junction analyser (Analyse af Splejsning af isoform Gensidighed, ASPIRE) [28] på den samme liste af udtrykte funktioner, som giver os mulighed for at undersøge alternative exons forudsagt af par af gensidige vejkryds ud over dem, forudsagt af en enkelt regulerede exoner /vejkryds (se AltAnalyze-Manual). Splejsning indeks er en måling af differentiel splejsning mellem to prøver. Exoner med SI-værdi større end 1 betyder mere inddragelse af exon i modnet mRNA under splejsning proces i den behandlede prøve i forhold til kontrolprøven, mens dem med SI-værdi mindre end 1 betyder mindre inklusion men mere skipping af exon, og dem med SI-værdi lig med 1 betyder, at der ikke er nogen ændring i brugen af ​​exon.

A. Udtrykket eller alternativ splejsning af DPM1 gen forblev uændret efter Berberin behandling. B. splejsningsmønster af NFKBIA genet forblev uændret efter berberine behandling som angivet ved splejsning (SI) af hver af sine exoner. Imidlertid blev ekspressionen af ​​NFKBIA genet opreguleres af mere end 2-fold efter berberine behandling (p 0,05), idet hver af sine exoner blev overudtrykt. C. splejsningsmønster af RLIM genet blev ændret ved berberine behandling som indikeret af SI-værdien af ​​exon 2 (SI 0,5) inden RLIM genet. Men udtryk for RLIM gen ikke ændret sig væsentligt efter Berberin behandling. Relative ekspression, den relative ekspression af genet eller alle dets exoner sammenlignet med kontrolprøven.

*, DEG;

#, DSAG.

Differentielt alternativ splejsning analyse blev udført ved hjælp af AltAnalyze med standardparametre. For det første var der tre kriterier exoner til at udføre forskelligt gen alternativ splejsning analyse: 1) Mindst 5 læser blev kortlagt til exon; 2) RPKM (Reads Per Kilo-base af exon model pr Million kortlagt læser) værdien af ​​exon var større end 0,3; 3) ekspressionen ændring af det tilsvarende gen var mindre end 2 gange. Derefter blev to exon-centreret algoritmer anvendes til at detektere de differentielt alternativ splejsning exoner: splejsning Index (SI) og analyse af Splejsning af isoform gensidighed (ASPIRE) [28]. SI-værdi for hver exon eller vejkryds blev beregnet som nedenfor.

(1)

I hvilke,

RPKM

(

exon

jeg

) og

RPKM

(

gen

) var udtryk værdien af ​​i’te exon og genet hhv. I SI algoritme, exoner med SI 2-fold blev kaldt AS-exons_SI. I aspirerer algoritme, exoner med Ai blev 0,2 kaldt AS-exons_ASPIRE. Nærmere oplysninger om disse to algoritmer er blevet beskrevet i AltAnalyze workflow (https://www.altanalyze.org/). Kun overlappede AS-exons i begge algoritmer blev valgt til yderligere funktionel analyse. Og generne indeholder disse exons blev kaldt forskelligt alternative splejsede gener (DASG).

Gene Set Funktionelle Berigelse Analyse

Gene sæt berigelse analyser blev udført for den funktionelle annotation af DEGS og DASGs separat. Funktionelle Anmærkningsværktøjer i DAVID Bioinformatik Resources [29] blev anvendt til at udføre disse analyser. De gen ontologi (GO) [30] biologisk proces vilkår eller Kyoto Encyclopedia of Gener og genomprogramledere (Kegg) [31] veje med berigelse p-værdi mindre end 0,05 (modificeret Fishers eksakte test) og mere end to gener blev betragtet som signifikant beriget funktioner til yderligere analyse.

lokal co-berigelse analyse langs kromosom sekvenser

for at teste, om DEGS og DASGs viste lignende berigelse fordeling langs kromosomerne, lokal co-berigelse analyse blev udført. For det første en berigning score (

ES

) blev beregnet for et gen sat til hvert kromosom bånd, som også blev vist som intensiteten af ​​denne region som vist i fig 2A [32]. Givet gen sæt

X

:

{x

1

,

x

2

,

… x

N

}

, kromosom band

b

:

{b

1

,

b

2

,

… b

M

}

, at antallet af gener i hvert bånd

g

:

{g

1

,

g

2

,

… g

M

}

, så

ES

score blev beregnet som følgende.

(2)

A. Global intensitet plot af positionelle berigelse for degs og DASGs. Hver celle repræsenterer en kromosomal båndet og intensiteten af ​​farven er proportional med den tilsvarende berigelse af DEGS eller DASGs i dette bånd, som er normaliseret ved både den totale mængde af gener i båndet og antallet af enten DEGS eller DASGs. Hver søjle repræsenterer kromosomet indeholder alle bands og farven, enten blå eller rød, foran kolonnen skelne klassen af ​​gener fra degs og DASGs. B. violin plot for den positionelle co-berigelse score (afstand) mellem to gen-sæt. Kurven, der dækker det gule område repræsenterer afstanden fordeling af to tilfældige gen sæt i samme størrelse af DEGS og DASGs hhv. En kortere afstand betyder en højere co-berigelse af disse to gensæt. Den røde diamant punkt refererer til afstanden mellem DEGS og DASGs

Så, en

ES

score vektor

EX

:.

{ex

1

,

ex

2

,

… ex

M

}

blev fik for gen sæt

X

tværs af alle bands i

B

. Ligeledes en anden vektor

EY

:

{ey

1

,

ey

2

,

… ey

M

}

kunne fik for et andet gen sæt

Y

. Endelig ligheden (

LCE

) mellem de to farver bånd af

X

og

Y

blev målt som euklidisk afstand mellem dem. Hotel (3)

Global nærhed i protein-protein interaktion (PPI) netværk

for at vurdere topologiske nærhed mellem degs og DASGs i PPI-netværket, gennemsnitlige korteste vej længde mellem dem blev brugt som mål. Gennemsnitlig korteste vej længde er et begreb i netværk topologi, der er defineret som det gennemsnitlige antal trin langs de korteste stier til alle mulige par af netværksknuder, hvilket er et mål for effektiviteten af ​​information transport i netværket [33]. Denne foranstaltning gælder også på to-underordnede emner ved at beregne den gennemsnitlige sti afstand for alle mulige par af knuder fra disse to netværk, x og y. (4) Hvis dis (i, j) er den korteste vej afstand mellem

i

‘te gen af ​​delmængde x og j’te gen af ​​delmængde y. I denne analyse blev baggrunden netværk bygget ved hjælp hele PPI data fra online database Humant protein reference Database (HPRD).

Funktionel semantisk lighed på Gene ontologi (GO) træ

På træet af Gene ontologi, er gener kategoriseret i forskellige funktionelle grupper navngivet som GO termer baseret på de biologiske processer, de er involveret. Baseret på grafen struktur GO, blev semantiske lighed mellem to GO termer beregnet som beskrevet i Wang et.al [34] ved brug GOSemSim pakke [35]. Så det semantiske lighed mellem to gen-sæt såsom degs og DASGs kunne beregnes som gennemsnittet af alle mulige par af GO udtryk involverer gener i disse to gen-sæt. Givet to lister med GO vilkår,

gå

1

og

gå

2

involverer gener i to gen sæt,

X

og

Y

, den semantiske lighed

SemSim

blev defineret som: (5) Hvor

N

GO

er den samlede mængde af GO termer anvendt til semantisk lighed beregning.

resultater

Oversigt over RNA-seq resultater for BEL-7402 celler behandlet med Berberin

hele transkriptom profilering af BEL-7402 celler behandlet med eller uden Berberin blev vurderet ved base-par opløsning via RNA-sekventering. Efter lav kvalitet læser (som nævnt i Læs alignment sektion, materialer og metoder) blev renset, ca. 30 mio læser ud af ~ 41,5 mio rå læser (læser retention rate: 70%, GC-indhold: 45 ~ 46%, sekvens længde: 36 ~ 100 bp) blev kortlagt til at henvise genomet for hver prøve (tabel 1). Ifølge “

Standarder

,

Retningslinjer og bedste praksis for RNA-Seq

” vedtaget af KODE [36], denne sekventering dybde er godt for differentieret udtryk analyse og er acceptabelt for alternativ splejsning analyse i human transkriptom.

differentielt udtrykte og alternativt splejsede gener fremkaldt af Berberin behandling

efter analyseret ved hjælp DESeq software, RNA-seq resultater returnerede 343 degs i BEL-7402 celler efter behandling med berberine, med 111 opreguleret og 232 nedreguleret (tabel A i S1 File). Interessant biologisk proces respons på bakterie (GO: 0.009.617) viste sig at være signifikant beriget med opregulerede DEGS (tabel 2), hvilket stemmer overens med den kliniske anvendelse af Berberin som et bredspektret antimikrobielt lægemiddel [3]. Og vi fandt gener relateret til positiv regulering af angiogenese var signifikant nedreguleret af Berberin, som tegner sig for den anti-angiogene aktivitet af Berberin rapporteret i tidligere værker. [37-39] Ifølge Kegg pathway berigelse analyse, DEGS var signifikant beriget med p53 signalvej (hsa04115) og flere kræftrelaterede veje såsom Jak-STAT signalvej (hsa04630), Apoptose (hsa04210) og veje i kræft ( hsa05200) (tabel 3). JAK-STAT-signalvejen er en stor signalering involveret i regulering af immunsystemet, hvilket tyder immunitet-regulerende aktivitet af Berberin kan bidrage til den anti-cancer virkning.

mellemtiden, alternativ splejsning analyse blev udført under anvendelse AltAnalyze software. Resultaterne viste, at 1083 forskelligt alternativt splejsede exoner, svarende til 867 DASGs (tabel B i S1 fil) blev identificeret i BEL-7402 kræftceller efter Berberin behandling. Taget RLIM gen som eksempel (figur 1), blev inklusionsniveau af exon 2 i modnet mRNA signifikant ændret (splejsning indeks 0,5) efter berberine behandling, mens der var kun en lille ændring i dens helhed genekspression niveau. I sammenligning med RLIM, der var dramatisk variation (fold-ændring 6) i genet-ekspressionsniveauet af NFKBIA (som et eksempel på DEG), men ingen signifikante ændringer (splejsning indeks ≈ 1) i forbindelse med integration af sine exons (Fig 1). Som vist i tabel 2, blev DASGs involveret i en række biologiske processer, såsom cellecyklus (GO: 0.007.049), kromosom organisation (GO: 0.051.276), makromolekylære kompleks samling (GO: 0.065.003) og cellulær reaktion på stress (GO: 0.033.554). Pathway berigelse analyse repræsenterede, at disse DASGs blev beriget i PI3K-AKT-mTOR signalvejen (har: 04150) og regulering af aktincytoskelettet (har: 04.810) (tabel 3), som alle stærkt relateret til cellecyklus proces og celledeling [40 ]. Det er klart, disse resultater foreslået, at disse DASGs også kan være relateret med anticancer virkning af Berberin.

Statistisk analyse af den funktionelle cross-tale mellem degs og DASGs

For at undersøge, om der er nogen form af funktionel cross-tale mellem degs og DASGs blev statistiske tests udført fra tre primære, men forskellige perspektiver.

Lokal co-berigelse blandt kromosom sekvenser.

Intuitivt det bør afprøves først, om disse DEGS og DASGs er beriget sammen på samme eller nærliggende regioner på kromosomerne. For at udføre denne eksamen blev en berigelse score tildelt hver bandet på alle kromosomerne for DASGs og degs henholdsvis [32]. Som vist i figur 2A, disse DEGS og DASGs udviste helt andre berigelse distributioner globalt. Imidlertid kunne mønstre findes i hvert lokalt område. De fleste af de DASG-berigede steder er ved eller nær de steder beriget med DEGS. For at kvantificere den fælles berigelse mønster mellem degs og DASGs blev euklidiske afstand (0,941) beregnet mellem berigelse scorer på alle kromosom bånd af DEGS og DASGs. For at teste den statistiske signifikans af afstanden mellem DEGS og DASGs, simuleringer ved tilfældigt prøveudtagning to gensæt i samme størrelse af DEGS og DASGs blev udført for 10000 gange for at producere fordelingen af ​​den euklidiske afstand mellem to gen-sæt på kromosomerne . Som vist i fig 2B, afstanden mellem DEGS og DASGs var signifikant kortere end mellem sæt tilfældigt udvalgte. Disse resultater viste klart, at DEGS og DASGs er fysisk co-beriget på de tilsvarende kromosomer.

Global nærhed baseret på protein-protein interaktion (PPI) netværk.

Efter ovenstående resultat, ekstra blev taget bestræbelser på at måle den funktionelle forbindelse mellem disse to gensæt baseret på PPI-netværk. I første omgang blev 100000-time tilfældige simuleringer udføres for at bygge fordelingen af ​​gennemsnit korteste vej afstanden mellem to gensæt i de samme skalaer som DEGS og DASGs [33]. Derefter blev den gennemsnitlige afstand mellem degs og DASGs beregnes og sammenlignes med fordelingen. Som vist i figur 3, førstnævnte er langt væk fra middelværdien af ​​den simulerede fordelingen ved en statistisk signifikans på p-værdi 0,05. Resultaterne indikerede, at disse DEGS og DASGs kan være tæt forbundet gennem protein-protein-interaktion.

A. Et eksempel illustration af nærhed mellem to gensæt. Hver cirkel punkt repræsenterer et knudepunkt i netværket, og hver linje repræsenterer kanten mellem to knudepunkter. Den røde farve sti er den korteste vej mellem X og Y i dette netværk, hvilket er med 3 trin. Den højre del er matrix af korteste vej længde mellem alle mulige par fra to gen-sæt (set_1 {Y, C, D}, set_2 {X, A, F}). Og deres gennemsnit korteste vej længde er 2,78. B. Den blå kurve over den gule histogram passer fordelingen af ​​nærhed mellem to tilfældige gensæt i de samme størrelser af DEGS og DASGs hhv. Den røde stiplede linje henviser til afstanden mellem degs og DASGs. Den p-værdi repræsenterer den del af gen-sæt par med kortere afstand end mellem degs og DASGs.

Funktionel semantisk lighed på Gene ontologi (GO) træ.

Mens degs og DASGs viste sig at have en væsentligt kortere afstand sammenlignet med tilfældige-samplet gen-apparater i henhold til PPI-netværk, denne form for funktionel sammenhæng er indirekte og ikke med stærk biologisk betydning. Således blev en mere ligetil metode anvendt til at måle den funktionelle sammenhæng mellem degs og DASGs baseret på de biologiske processer, der berøres af dem [35]. Til afbalancering af beregningsmæssige effektivitet og måling robusthed, der GO biologisk proces vilkår med mindst 10 gener vælge som reference biologiske proces sæt (figur 4A). En semantisk lighedsscore fik hver to GO termer baseret på grafen struktur GO, som illustreret i fig 4B. Så en gennemsnitlig semantisk lighed point er beregnet over alle par af GO termer fra henholdsvis de biologiske processer, der berøres af DEGS og DASGs hjælp af bedst-match gennemsnitlige strategi. Og procedurer blev udført på to tilfældigt stikprøven gen-apparater i samme målestok som degs og DASGs for 10000 gange for at få fordelingen af ​​den gennemsnitlige semantiske lighed. Som vist i fig 4C, den midlede semantiske lighed mellem DEGS og DASGs er meget højere end to tilfældige-pickup sæt, indikerer, at disse to sæt gener kan være funktionelt forbundet.

A. Cirklen plot viser andelen af ​​GO vilkår med det tilsvarende gen nummer. Den barplot repræsenterer antallet af GO vilkår med gener mere end hver cutoff af gen nummer. Og den del af GO vilkår med mere end 10 gener blev udvalgt til videre beregning. B. Heatmap af GO semantisk lighed mellem hver to udvalgte GO vilkår. Jo varmere farven er, desto højere er ligheden mellem de to begreber. C. Kurven repræsenterer fordelingen af ​​semantiske lighed mellem to tilfældigt udvalgte gen-apparater i samme størrelse af DEGS og DASGs hhv. Den røde diamant punkt refererer til den semantiske lighed mellem degs og DASGs.

Diskussion

Transskription og alternativ splejsning er to vigtige biologiske processer under genekspression, som tilsammen bestemme proteom af celler under en bestemt tilstand. I denne undersøgelse for at udforske den funktionelle forbindelse mellem differentielt udtrykte gener og differentielt alternative splejsede gener i cancerceller behandlet med berberin, mRNA profilering af BEL-7402 celler blev opsamlet via RNA-seq. Derefter blev begge DEGS og DASGs fremkaldt af Berberin omhyggeligt mærket med en suite af sekvens analyse software. Baseret på den DEGS funktionelle berigelse analyse blev to potentielle mekanismer bag cellecyklusstandsningen ejendomme til berberine foreslået som nedenfor.

Berberin kan inducere p53-afhængig G1 fasen af ​​BEL-7402 cancerceller. Efter BEL-7402 celler blev behandlet med Berberin, fem gener (

BBC3

,

FAS

,

CCNG2

,

GADD45B

, og

IGFBP3

) opreguleret og to gener (

CASP9

,

THBS1

) blev nedreguleret (tabel C i S1 File) i p53 signalvej. Især de fem opreguleret gener er downstream mål af p53 [41-45]. I mellemtiden p53 viste sig at blive udtrykt på et beskedent niveau i BEL-7402 celler før og efter berberine behandling. Vildtype-p53 status i BEL-7402-cellelinje blev også bekræftet af andre forskere [46, 47]. Disse resultater antydede, at p53-signalvejen kan påvirkes under berberine perturbation. Som det er kendt, p53 er en afgørende cellecyklus checkpoint protein, der vil forårsage cellecyklusstandsning reagerer på DNA-beskadigelse [48]. To cellecyklus-beslægtede gener (CDKN2D, GADD45B), som er på den nedstrøms vej for p53, blev fundet at være opreguleret efter berberine behandling. De kunne hæmme aktiviteten af ​​CDK’er der regulerer G1-S faseovergang. Og standsning af cellecyklus ved G1-fasen i BEL-7402 celler induceret af berberine blev også fundet i vores tidligere arbejde gennem flowcytometrisk analyse. [8] Tilsammen vores resultater indikerede, at berberine kan hæmme BEL-7402 celleproliferation ved at inducere G1 cellecyklus standse i en p53-afhængig måde. Endvidere blev p53-afhængig cellecyklusstandsning ved G1-fasen også rapporteret i flere andre cancercellelinier efter Berberin behandling. [37-39] Vores tidligere undersøgelser rapporteret cellecyklusstandsningen effekt af Berberin ved at målrette calmodulin, hvilket kan være upstream signal af p53 pathways [8].

Berberin kan undertrykke produktionen af ​​inflammatoriske cytokiner gennem NFKB inhibering. RNA-seq resultater viste, at

NFKBIA Hotel (

IKB

) var signifikant opreguleret ved Berberin behandling (tabel D i S1 File). Som en inhibitor af NFKB,

IKB

kan hindre translokationen af ​​NFKB fra cytoplasmaet til cellekernen [49]. Tidligere undersøgelser har vist, at inhibering af NFKB kan påvirke ekspressionen af ​​mange inflammatoriske faktorer, som kan fremme tumorcellevækst og facilitet tumorinvasion og metastase [50]. I denne undersøgelse, fem cytokiner (

IL-6

,

IL-8

,

IL1A

,

IL-33

IL11

) (tabel D i S1 File) viste sig at være nedreguleret efter Berberin behandling i henhold til de RNA-seq resultater. Især har alle disse cytokiner blevet rapporteret som pro-inflammatoriske faktorer. For eksempel,

IL-6

og

IL-8

blev rapporteret som betydelig høj udtrykt og spiller en vigtig rolle i migration og bæredygtig spredning af human lever cancerceller [51-53].