PLoS ONE: Geranylated 4-Phenylcoumarins Exhibit anticancer effekter mod human prostatacancer celler gennem caspase-Uafhængige Mechanism

Abstrakt

Geranylated 4-phenylcoumarins, DMDP-1 -2 Isoleret fra

Mesua elegans

blev undersøgt for anticancer potentiale mod humane prostata kræftceller. Behandling med DMDP-1 -2 Resulterede i celledød i en tid og dosisafhængig måde i en MTT assay på alle testede med undtagelse af lungeadenocarcinom celler cancercellelinjer. DMDP-1 viste højeste cytotoksisk effekt i PC-3 celler, mens DMDP-2 var mest potente i DU 145 celler. Flowcytometri indikerede, at begge coumariner var vellykkede til at inducere programmeret celledød efter 24 timers behandling. Forklaring om tilstanden-af-aktivering via proteinarrays og western blotting demonstrerede død induceret uden væsentlige udtryk for caspaser, Bcl-2-familien proteiner og spaltet PARP, hvilket antyder inddragelsen af ​​caspase-uafhængig pathways. Ved identifikation af autophagy, analyse af GFP-LC3 viste øget punktformig i PC-3 celler forbehandlet med CQ og behandlet med DMDP-1. I disse celler nedsat ekspression af autophagosome protein, P62 og cathepsin B yderligere bekræftet autofagi. I modsætning, de DU 145-celler forbehandlet med CK og behandlet med DMDP-2 har reduceret GFP-LC3 punktformig selv om antallet af celler med åbenlyse GFP-LC3 puncta blev øget væsentligt i de inhibitor-behandlede celler. Stigningen niveau af p62 foreslået lækage af cathepsin B i cytosolen at udløse potentielle downstream død mediatorer. Dette korrelerede med forøget ekspression af cathepsin B og reduceret ekspression efter behandling med dets inhibitor, CA074. Også auto-nedbrydning af calpain-2 ved behandling med DMDP-1 -2 og dets inhibitor alene, calpeptin sammenlignet med kombinationen behandling, bekræftes yderligere involvering af calpain-2 i PC-3 og DU 145 celler. Behandling med DMDP-1 -2 Viste også opregulering af totale og phosphorylerede p53-niveauer på en tidsafhængig måde. Derfor DMDP-1 -2 Viste evne til at aktivere flere død veje involverer autophagy, lysosomale og endoplasmatisk reticulum død proteiner, som potentielt kan blive manipuleret til at udvikle anti-cancer terapi i apoptose resistente celler

Henvisning:. Suparji NS, Chan G, Sapili H , Arshad NM, I LLA, Awang K, et al. (2016) Geranylated 4-Phenylcoumarins Exhibit anticancer effekter mod human prostatacancer celler gennem caspase-uafhængig mekanisme. PLoS ONE 11 (3): e0151472. doi: 10,1371 /journal.pone.0151472

Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES

Modtaget: 26 august, 2015; Accepteret: 29 februar 2016; Udgivet: 14. marts 2016

Copyright: © 2016 Suparji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Denne undersøgelse blev støttet af universitetet i Malaya Postgraduate Research Grant (PV043-2011A) og University Malaya Research Program (RP001-2012A)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform samt den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1]. På trods af tilgængeligheden af ​​flere behandlingsmuligheder, der er i øjeblikket ingen effektive behandlinger til rådighed til behandling af apoptotiske-resistent androgen-uafhængig prostatacancer, som ofte opstår efter hormonal afsavn eller ablation terapi [2]. Naturlige phytocompounds betragtes som en vigtig kilde til kræft kemoforebyggende og kemoterapeutiske midler. Fremtrædende eksempler omfatter coumarin-baserede forbindelser, som er afledt af frugter og dæmme gøer af forskellige planter, såsom

Casimora edulis

[3],

Calophyllum inophyllum

[4],

Mesua Ferrea

[5] og

Mesua kunstleri

[6]. Coumariner er blevet anerkendt for at besidde antiinflammatorisk, antioxidant, antiallergisk, hepatobeskyttende, antithrombotisk, antimikrobielle, anti-arrythmic, anti-osteoporose, antiviral, og anticarcinogenic aktiviteter [7-11]. Yang og kolleger, demonstrerede femten isoprenylated coumariner isoleret fra

Mammea americana

udviste signifikante cytotoksiske virkninger og høje antioxidant aktivitet i humane tyktarmskræft cellelinjer [12]. I et forsøg med både coumarin og 7-hydroxycoumarin, inhibering af cellevækst i lunge carcinom-cellelinier ved at inducere G

1 fase cellecyklusstop og apoptose blev påvist [13]. I en anden rapport blev geranylated coumariner ses at udøve anti-proliferative aktioner gennem apoptotisk celledød i leukæmiceller [14]

I denne undersøgelse to store geranylated 4-phenylcoumarins.; DMDP-1 -2 Isoleret fra barken af ​​

Mesua elegans

(clusiaceae), lokalt kendt som “pokok Penaga”, blev udsat for forskellige cytotoksiske og apoptotiske analyser. Til forfatternes viden, er dette den første rapport om induktion af multiple “apoptose-lignende” caspase-uafhængig programmeret celledød på prostata kræftceller ved geranylated 4-phenylcoumarins.

Materialer og Metoder

Indsamling af

Mesua elegans

bark af

Mesua elegans Hotel (King) Kosterm blev indsamlet fra Sungai Badak Forest Reserve, Kedah, Malaysia. Prøven blev identificeret ved hr Teo Leong Eng og deponeres i Kemisk Institut, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Universitetet i Malaya herbarium (Ref No:. KL5232).

Ekstraktion og oprensning af coumarin-analoger

Tørret formalet bark af

Mesua elegans

(1,5 kg) blev udblødt med hexan (3 x 4L, 48 timer hver gang) ved stuetemperatur. Ekstrakten blev tørret fra med rotationsfordamper, hvilket gav en gul gummiagtig remanens (120,3 g). En portion af det rå hexan (13,0 g) blev underkastet søjlekromatografi fraktionering over silicagel 60 (230-400 mesh) og elueret med hexan-EtOAc (fra 9,5 til 0) og EtOAc-MeOH børn (fra 5 til 0), hvilket gav fraktioner AH. Fraktion A blev underkastet silicagelkromatografi og elueret med hexan-EtOAc (fra 9.7 til 9,5) til frembringelse af sub-fraktionerne A1-A4. Observationer af fraktion adskillelse blev udført ved hjælp af TLC med silicagel 60 F

254 plader. Fraktion A2 blev underkastet HPLC-analyse under anvendelse ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm i.d. x 150 mm x 3,5 um HPLC-kolonne, og adskilles ved anvendelse ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm i.d. x 250 mm x 3,5 um HPLC-kolonne for at oprense isomerer DMDP-1 -2 (Figur 1). Vand auto-rensning system blev anvendt til HPLC-adskillelse. NMR-spektre blev opnået under anvendelse af JEOL LA400 FT-NMR og JEOL ECA400 FT-NMR-spektrometer System (400 MHz) med CDC

3 som opløsningsmiddel. UV-spektre blev registreret på et Shimadzu UV-Visible recording Spektrofotometer anvendelse af ethanol som opløsningsmiddel med spejl UV celle. IR-spektre blev opnået gennem Perkin Elmer FT-IR Spectrometer Spectrum RX1 med CHC

3 som opløsningsmiddel. Massespektre blev udført på Agilent Technologies 6530 Nøjagtig-masse Q-TOF LC-MS, med ZORBAX Eclipse XDB-C18 Rapid Opløsning HT 4,6 mm i.d. x 50 mm x 1,8 um søjle (S1 tabel)

(A) Kemisk struktur af DMDP-1 -2. (B) (I) HPLC-kromatogram af fraktion A2 med følgende eksperimentelle betingelser (analytisk): kolonne, ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm i.d. x 150 mm x 3,5 um; mobil fase, to opløsningsmidler: A, 0,1% myresyre i H

20 og B, 0,1% myresyre i MeOH; elueringen programmet på 0,6 ml /min som isokratisk med 90% B (0-30 min) til opnåelse af isomerer DMDP-1 -2. (II) HPLC kromatogram af fraktion A2 med følgende eksperimentelle betingelser (semi-forberedende): kolonne, ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm i.d. x 250 mm x 3,5 um; mobil fase, to opløsningsmidler: A, 0,1% myresyre i H

20 og B, 0,1% myresyre i MeOH; elueringen programmet på 3,0 ml /min som isokratisk med 90% B (0-50 min) til opnåelse af isomerer DMDP-1 -2

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

I alt ti menneskelige kræftceller blev anvendt:. Ca Ski, HeLa, HepG2, A549, PC-3, DU 145, MCF7 (indkøbt fra ATCC), HSC4 (opnået fra Cancer Research Initiative Foundation, Malaysia), MDA-MB-231 og SK-LU-1 (indkøbt fra AseaCyte, Malaysia). NP69, den normale cellelinje var en gave fra Prof GSW Tsao [15]. Hver cellelinje blev opretholdt med den passende vækstmedium (RPMI 1640: for celler A549, SK-LU-1, MDA-MB-231, PC-3, DU 145, MCF7) og (DMEM: for celler Ca Ski, HepG2, HeLa, HSC4) og (keratinocyt-SFM: NP69), der blev suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum. Cellerne blev dyrket som monolag ved 37 ° C i fugtig atmosfære med 5% CO

2/95,% luft

MTT assay

De cytotoksiske virkninger af DMDP-1 -2 På cancercellelinier blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. I alt 1,0 x 10

4-celler blev udpladet (100 pi /brønd) og behandlet ved koncentrationer på 10 til 100 um i 24 timer med DMSO som en negativ kontrol. MTT-opløsning (5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Absorbans blev målt ved 560 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Tecan Sunrise

®, Schweiz).

Direkte /Dead assay

Vurdering af cellelevedygtighed efter behandling med begge analoger blev udført ved anvendelse af LIVE /DEAD

® levedygtighed /cytotoksicitet kit (Molecular Probes, Invitrogen, NY, USA). Celler blev dyrket på dækglas placeret i 6-brønds plader og behandlet ved IC

50 koncentration i 24 timer. Celler blev farvet ved anvendelse af en dobbelt-fluorescens system bestående af 150,0 pi calcein-AM (2,0 uM) og ethidiumhomodimer (EthD) (4,0 uM). Excitations- og emissionsbølgelængder blev sat til 494/517 nm for calcein-AM og 528/617 nm for EthD henholdsvis. Visualisering af prøver blev udført ved hjælp af et Nikon Eclipse TS-100 fluorescens mikroskop (Nikon, Japan) under 100 × forstørrelse.

Flowcytometer analyse

Påvisning af forskellige celle død stadier blev udført ved hjælp af Annexin V FITC Apoptose Detektion Kit (Calbiochem, USA). Kort fortalt, 1,0 x 10

4 celler behandlet og ubehandlet blev inkuberet med Annexin-V (200 ug /ml). Prøverne blev centrifugeret og resuspenderet i 1 × iskold bindingsbuffer med propidiumiodid (PI). Detektion og analyse blev udført ved hjælp af BD FACSCanto II ™ flowcytometer (Becton Dickenson, USA). For cellecyklusanalyse, 2,0 x 10

4 celler behandlede og ubehandlede blev suspenderet i PI (50,0 ug /ml) og RNase A (10,0 mg /ml). Disse celler blev fikseret i iskold 70,0% (v /v) ethanol og opbevares ved -20 ° C natten over. Cellecyklusfordeling blev analyseret ved flowcytometer og procenterne ved forskellige faser blev bestemt ved ModFit LT cellecyklusanalyse software.

Apoptose proteinarray

I alt 1,0 x 10

6 celler var ubehandlet og behandlet i 6 timer. Cellelysaterne blev normaliseret under anvendelse af BCA Protein Assay kit (Pierce, USA) og inkuberet ved 4 ° C natten over med Raybio

® Humant Apoptose Antistof Array objektglas (RayBiotech Inc. USA, GA). Alle objektglas blev vasket og en cocktail af biotinyleret antistof-blandingen blev anvendt til at detektere apoptose-relaterede proteiner. Efter inkubation med Hylate Plus ™ -konjugeret streptavidin, blev signalerne detekteret med en fluorescens-scanner ved Axon GenePix

® ved hjælp af Cy2 kanal. Shortlistet proteinekspression mål blev udvalgt på grundlag af en fold tærskel på ≥ 1,5 eller ≤ -1,5.

Western blotting

Nuklear og cytoplasmatiske proteiner blev udvundet fra PC-3 og DU 145 cellelinjer behandlet ændring med analoger IC

50 værdier for 6, 12, og 24 timer under anvendelse af NE-PER

® Nuclear og cytoplasmiske Extraction kit (Pierce, USA). Koncentrationer blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay kit (Pierce, USA). Ækvivalente mængder af protein (20 ug) fra både ubehandlede og behandlede celler blev separeret på 12% (vægt /volumen) SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner, som efterfølgende blev inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med peberrodsperoxidase (HRP) -bundet sekundære antistoffer. 14 primære antistoffer fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA mod GADPH, caspase-3, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bax, mikrotubulus associeret let kæde (LC3), granzym B, cathepsin B, calpain-2, p53, phospho p53 og p62 /SQSTM1 blev anvendt. Protein bands blev visualiseret via forøget kemiluminescens signaler på røntgen film. Intensiteter af alle bands blev kvantificeret ved hjælp af billedanalyse software (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA). Anti-GADPH kontrol antistoffer blev anvendt til normalisering af båndintensiteter.

Analyse af GFP-LC3

PC-3 og DU 145-celler blev udpladet med en tæthed på 4,0 x 10

4 celler /brønd i 6-brønds plade og efterladt til at klæbe natten over i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2. Alle celler blev transduceret med RFP-GFP-LC3B reagens under anvendelse af kommercielt tilgængelige Premo Autophagy Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B Kit (Life Technologies, USA) i 48 timer. Den følgende dag blev celler inkuberet med 100 pM chloroquin-diphosphat (CQ), og behandlet med enten DMDP-1, DMDP-2 eller lades ubehandlet (kontrol) i 24 timer. Cellerne blev visualiseret under et inverteret fluorescensmikroskop (Nikon Instruments, Japan) under anvendelse af en blå filter for at påvise ophobning af GFP-LC3 punktformig med GFP emission.

Statistisk analyse

Alle resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SD af data fra mindst tre uafhængige biologiske gentagelser. En-vejs ANOVA blev anvendt til at vurdere de væsentlige forskelle mellem kontrol og behandlede prøver med et

s

-værdi tærskel på ≤ 0,05.

Resultater

Karakterisering af coumarin analoger

Både DMDP-1 -2 Blev isoleret fra hexan ekstrakt af bark af

Mesua elegans

med 98% renhed (S1 Fig). DMDP-1 blev isoleret som hvide krystaller med smp 90-92 ° C, medens DMDP-2 som farveløs olie. HRESIMS afslørede en [M + H]

+ ion top ved m /z 475,2728 (beregnet 475,5945), svarende til molekylformlen C

30H

34O

5 for begge analoger. NMR, IR og UV-data af disse forbindelser er blevet studeret og sammenlignet med litteraturen [5, 16], og strukturerne af disse forbindelser blev bekræftet som DMDP-1[5,7-dihydroxy-8-(2-methylbutanoyl)-6-[(

E

)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2

H

-chromen-2-one] og DMDP-2[5,7-dihydroxy-8-(3-methylbutanoyl)-6-[(

E

)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2

H

-chromen-2-one]

Cytotoxic virkninger af cumarin analoger

Vores resultater viste induktion af cytotoksicitet i en dosis og tid afhængig måde efter 24 timers eksponering på testede cellelinier. Baseret på IC

50 værdier, DMDP-1-induceret celledød mest effektivt i PC-3 celler med en IC

50 værdi på 9,0 uM mens DMDP-2 klarede sig bedst i DU 145 celler med en værdi på 24,0 uM, indikerer en dybtgående effekt på prostata cancercellelinier (tabel 1). Levedygtighed celler behandlet med DMSO alene blev ubetydeligt påvirket (≤2.0%) og derved udelukker inddragelse af opløsningsmiddel-induceret cytotoksicitet. Levende /døde assays blev udført for at bekræfte deres cytotoksiske virkninger blev celledød kun observeret i PC-3 og DU 145-celler efter behandling, men ikke i NP69 celler, hvor levedygtighed blev holdt ved 92,7%. Procentdel af PC-3 cellelevedygtighed faldt fra 98,0% til 43,0%, mens levedygtigheden af ​​DU 145-celler faldt fra 95,0% til 38,0% (figur 2A). Dette indikerede, at begge forbindelser påfører en mere gradvis cytotoksisk farmakokinetisk effekt i langsomt voksende normale celler sammenlignet med hurtigt prolifererende kræftceller, hvilket er et fælles kendetegn blandt kemoterapeutiske stoffer.

Alle værdier blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tre tekniske og tre biologiske gentagelser

(A) Levende /Dead assay efter behandling med DMDP-1 -2 I 24 timer og DMSO som kontrol opløsningsmiddel. Grøn fluorescens betegner levedygtige celler farvet med calcein-AM, mens rød fluorescens betegner døde celler farvet med ethidium-homodimer. (B) Annexin V-FITC /PI flowcytometri punktdiagram-analyse efter behandling i 24 timer. Procentdel af celledød blev beregnet på grundlag øverste højre og nederste højre kvadranter fra i alt 1,0 x 10

4 celler

DMDP-1 -2 Inducerer celledød

Efter de indledende cytotoksicitetsdata, besluttede vi at fokusere denne undersøgelse på androgen-uafhængige humane prostata cancer cellelinjer. Annexin-V FITC /PI flowcytometri assays blev anvendt til at bestemme tilstanden af ​​celledød. Celledød procentdel blev beregnet på basis øverst til højre (sent apoptotiske celler) og nederste højre kvadranter (tidlige apoptotiske celler) i flowcytometri. Den dot-blot fra i alt 1,0 x 10

4 PC-3-celler efter behandling med IC

50 i DMDP-1 viste en stigning fra 12,3% til 46,4%. Lignende effekter blev observeret i DMDP-2 behandlede DU 145 celler, hvor celledød befolkning steget fra 3,1% til 49,7% (figur 2B). Selvom celledød også blev observeret i NP69-celler, blev celledøden population holdt under 10,4% efter 24 timers behandling

DMDP-1 -2 Inducerer caspase-uafhængig celledød

I vores forsøg på at bestemme, om celledød blev medieret via apoptose, anvendte vi et antistof matrix stand til at detektere 43 apoptose-relaterede gener involveret i både interne og eksterne forløb. I tabel 2 giver behandling af PC-3-celler med DMDP-1 demonstrerede en reduceret ekspression af survivin og insulin-vækstfaktorreceptor-1 (IGF1R) koblet med et forhøjet niveau af insulin-vækstfaktor bindende protein-2 (IGFBP-2) og varme-shock protein-27 (HSP-27). I mellemtiden, behandling af DMDP-2 på DU 145-celler afslørede reduceret udtryk af tre proteiner, dvs. CD40-ligand, tumornekrosefaktor-receptor 1 (sTNF-R1) og TNF-relateret apoptoseinducerende ligand 1 (TRAIL-1). Alle andre proteiner afprøvede viste ingen signifikant ændring (fold ændring 1,5 eller -1,5) i udtryk, herunder prominente apoptotiske effektorer såsom caspase-8 og -3, samt bcl-2-medlemmer såsom Bad, Bax , Bim og Bcl-2 selv. Interessant dette indikeret, at dødsfaldet receptor pathway og det mitokondrielle pathway ikke blev aktiveret følgende DMDP-1 -2 Behandlinger, men i stedet foreslog en caspase-uafhængig tilstand af celledød. For at undersøge de caspase-uafhængige mekanismer involveret, western blotting analyse af DMDP-1 -2 Behandlede PC-3 og DU 145-celler blev udført. Resultaterne viste sig at være i overensstemmelse med data opnået fra proteinet array, hvor ingen induktion af caspase-3, -8 og -9 proteiner blev observeret, mens niveauet af anti-apoptotiske Bcl-2 fandtes at stige samtidig med ændringen i Bax (fig 3a 3b). Denne observation var også i overensstemmelse med negativt resultat fra poly-ADP ribose polymerase (PARP) spaltning, cellecyklusstop og DNA-fragmentering analyser, hvor aktivering af caspaser blev fundet at mangle (S2 Fig).

I alt af 42 apoptose-relaterede proteiner blev analyseret ved hjælp af RayBio

® Menneskelig Apoptose Antibody Array G Series 1. Mean protein fold ændringer blev beregnet i forhold til ubehandlede celler fra fire biologiske gentagelser.

(A ) Behandling med DMDP-1 -2 Viste fuld længde protein niveauer og fravær af spaltet PARP og caspase-9, -3 og -8. (B) Analyse af anti-apoptotiske Bcl-2 og pro-apoptotiske Bax proteinniveauer. Kvantificering af protein båndintensiteter blev bestemt ved densitometri analyse og normaliseret til GADPH hjælp af ImageJ v1.43 software. Alle resultater blev præsenteret som betyder normaliseret intensitet ± standardafvigelse. . Af tre uafhængige forsøg

DMDP-1 -2 Fremkalder celledød via flere veje

For at identificere hvilke caspase-uafhængige mekanismer var involveret, western blotting analyse af behandlede og ubehandlede PC-3 og DU 145 celler blev udført. I figur 3, fraværet af spaltet PARP, caspase-3, -8 og -9, opregulering af Bel-2 og nedregulering af Bax bekræftet vores hypotese om eventuel inddragelse af caspase-uafhængige veje medieret af autofagi eller anden organeller, såsom lysosomer og endoplasmatisk reticulum (ER), som frigiver og aktiverer dødsproteiner såsom, cathepsiner, granzymer og calpainer. Western data (figur 4) viste en stigning i cathepsin B-niveauer i DU 145-celler, som viste, at DMDP-2 inducerede aktivering af denne lysosomal cysteinprotease i stedet for caspaser. Calpain-2 etager, som er auto-nedbrudt af dets aktivering [17], blev nedsat efter behandling af DMDP-1 -2. Dette resultat blev yderligere valideret med kombinationsbehandling af hver analog med calpain-2-inhibitor, calpeptin ved Western blot. Men granzym B ikke ud til at spille en rolle som dens proteinniveauer blev reduceret konsekvent over 24 timer behandlingsforløb. Interessant, den vestlige resultater viste, at ved behandling, total og phosphorylerede p53 niveauer var både opreguleret på en tidsafhængig måde. Aktivering af p53 kan øge selektiviteten og sikkerheden af ​​behandling med disse to coumarin analoger ved selektiv beskyttelse af normale celler og væv

(A) Celler blev behandlet med DMDP-1 -2 I 24 timer, efterfulgt af undersøgelse af vigtige proteiner involveret i multipel form for celledød ved western blotting. (B) Kvantificering af båndintensiteter blev bestemt ved densitometri analyse og normaliseret til GADPH hjælp af ImageJ v1.43 software. Alle resultater blev præsenteret som betyder normaliseret intensitet ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

DMDP-1 inducerer autophagy og aktiverer calpain-2 i PC-3 celler

Western blotting på LC3-I /II protein niveau, som er en standard markør for autophagy aktivering viste konverteringer af LC3-i til LC3-II efter behandling med DMDP-1 og kombineret behandling af DMDP-1 og tidlig autophagy inhibitor, 3mA i PC-3 cellelinie. Imidlertid blev ingen konvertering observeret i de ubehandlede og inhibitor-behandlede celler. Endvidere analyse af GFP-LC3 resultat viste øget GFP-LC3 punktformig i PC-3-celler forbehandlet med chloroquin (CQ) og behandlet med DMDP-1, hvorimod GFP-LC3 blev jævnt fordelt i hele cellerne i kontrolbrøndene, antyder en fusion begivenhed for autophagosomes og lysosomer i DMDP-1-behandlede celler. GFP-LC3 punktformig var tilbøjelig til at klynge og co-lokalisere med lysosomer i celler behandlet med både CQ og DMDP-1. Dette er i modsætning til den for DMDP-2-behandlede DU 145-celler, hvor minimal LC3-I /II konvertering og reducerede GFP-LC3 punktformig selv om antallet af celler med åbenlyse GFP-LC3 puncta var signifikant forøget i CQ behandlede celler ( fig 5). Dannelsen af ​​autophagosome blev også set som øget antallet af vakuoler i mikrofotografier (Fig 6). I yderligere undersøge virkningen af ​​DMDP-1 -2 På dannelsen af ​​autophagolysosome, ændringer i niveauerne af p62, en ubiquitin-bindende protein (også kendt som SQSTM1) involveret i autophagy, lysosom eller iagttoges proteasom-afhængige nedbrydning af proteiner. Som vist i fig 7A, behandling af DMDP-1 på PC-3-celler viste nedsat P62 niveau ved 24 timer, hvilket giver yderligere bevis for, at DMDP-1 inducerer autofagi. Dette resultat er i overensstemmelse med cathepsin B udtryk mønster, som faldt efter behandling med DMDP-1 ved 24 timer (Fig 4). I mellemtiden, i DU 145-celler, det øgede niveau af p62 og cathepsin B foreslog, at DMDP-2 medierer lysosomal permeabilitet resulterer i lækage af cathepsin B i cytosolen at udløse downstream death mediatorer og ikke fusion af autophagosome med lysosomer at inducere autofagi. Endoplasmatisk reticulum dødsprotein calpain-2-aktivitet i PC-3-celler blev overvåget med kombinationsbehandling af dets inhibitor, calpeptin og DMDP-1 ved Western blot. Calpain-2-ekspression behandlet med DMDP-1 er den laveste i PC-3-celler i sammenligning med de ubehandlede celler, kombinationsbehandling af DMDP 1 med calpeptin og behandling med kun calpeptin. Behandling med calpeptin viste kun den højeste calpain-2-ekspression som følge af inhibering af dets auto-nedbrydning, validering at calpain-2-aktivering i PC-3-celler er ved behandling med DMDP-1.

(A) repræsentative fluorescens billeder, der viser punktformig fordeling af GFP-LC3B i DMDP-1 -2 Behandlede celler. PC-3 i DU 145-celler blev transduceret med RFP-GFP-LC3B 48 timer før behandling af 9 uM DMDP1, 100 uM choloquine eller lades ubehandlet (kontrol). Celler blev også forbehandlet med 100 pM CQ i 4 timer, efterfulgt af 9 uM DMDP-1 -2 Behandling 24 timer senere blev punktformet fordeling af GFP-LC3 visualiseret og sammenlignet med den spredte fordeling i kontrolceller. Procentdel af PC-3 celler med indlysende ophobning af GFP-LC3 punktformet. Middelværdier ± SD, n = 3. *: p ≤ 0,05. (B) Ekspression af LC3-I /II behandling med begge analoger med og uden inhibitorer i 24 timer. Kvantificering af båndintensiteter blev bestemt ved densitometri analyse og normaliseret til GADPH hjælp af ImageJ v1.43 software. Alle resultater blev præsenteret som betyder normaliseret intensitet ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

Alle billeder er vist ved 400x forstørrelse, og dannelse af vakuoler er angivet med hvide pile.

(A) Ekspression af P62-niveauer efter behandling med begge analoger på PC-3 og DU 145 på 0-24 t. (B) Ekspression af cathepsin B og calpain-2 behandling med begge analoger med og uden inhibitorer i 24 timer. Kvantificering af båndintensiteter blev bestemt ved densitometri analyse og normaliseret til GADPH hjælp af ImageJ v1.43 software. Alle resultater blev præsenteret som betyder normaliseret intensitet ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

Lysosomal og endoplasmatisk reticulum-aktivitet (ER) er involveret i DMDP-2 induceret celledød

minimal omdannelse af LC3-I /II og forøget ekspression af p62 kraftigt indikerede, at DMDP-2 hæmmer sent autophagy, især på det punkt af lysosomale aktivitet. Som vist i fig 7B, behandling af DMDP-2 i DU 145-celler i 24 timer resulterede i øget ekspression af cathepsin B. Behandling med sin inhibitor CA074 alene stærkt reduceret cathepsin B-ekspression. En kombination af behandling med dets inhibitor, CA074 og DMDP-2 resulterede ikke i nogen signifikant ændring af cathepsin B-ekspression sammenlignet med de behandlede celler, hvilket bekræfter sin deltagelse i celledød. Endvidere har vi målt også ændringen i ekspression af det endoplasmatiske reticulum død protease calpain-2. Fig 7B viser en reduceret proteinniveau af calpain-2 som et resultat af protease aktivering og auto-nedbrydning efter behandling med DMDP-2 på DU 145-celler. En kombinationsbehandling af dets inhibitor, calpeptin og DMDP-2 udviste lavere ekspression af calpain-2 sammenlignet med de ubehandlede celler, men højere i celler behandlet med calpeptin alene, hvilket giver yderligere bevis for DMDP-2 inducerer ER celledød.

diskussion

med hensyn til kemisk struktur, både geranylated 4-phenylcoumarins besidder nøjagtig samme karakteristiske coumarin ring, med kun en lille variation; i DMDP-1 er et 2-methylbutanoyl del substitueret ved position C-8, hvorved en 3-methylbultanoyl del i position C-8 i DMDP-2. Den struktur-aktivitetsforhold sammenligning viste, at denne enkelte methylsubstitution kunne ændre cytotoksiske effektiviteter og præferencer mod bestemte cellelinier. Dette studie fremlagde beviser, der støttede en tidligere rapport, at ændringer i den kemiske struktur af coumariner kunne forbedre deres cytotoksiske egenskaber [11].

Aktivering af caspaser er ofte set som synonym med apoptotisk celledød [18]. Men celledød uafhængig af caspase veje er også vigtigt, da beskyttelsesforanstaltninger mekanismer til at beskytte organismen mod uønsket og potentielle skade, når caspase medierede ruter mislykkes, og kan udløses som reaktion på cytotoksiske midler eller andre død stimuli. Ligesom hvordan mitokondrier spiller en central rolle i apoptose, andre organeller, såsom lysosomer og endoplasmatisk reticulum spiller også en lige så vigtig rolle i frigivelsen og aktiveringen af ​​dødsfald faktorer såsom cathepsin, calpainer og andre proteaser [19-22]. Caspase-afhængig og -uafhængig apoptose er alle stærkt reguleret former for programmeret celledød og spiller afgørende roller i fysiologiske processer såsom væv udvikling, homeostase og afskaffelse af uønskede celler [23]. Caspase-afhængige vej omfatter ydre og indre mitochondria pathways mens caspase-uafhængig, indbefatter apoptose-lignende, autophagic og nekrose-lignende celle-dødsfald medieret af lysosomer og ER [18, 19]. Under apoptose, vil caspase proteinniveauer ikke stige, men vil blive behandlet ved spaltning for aktivering, mens Bcl-2-proteiner vil blive translokeres til mitokondrier. Rapport i 2000 af Saeki og hans kolleger viste, at andre end apoptose mekanismer forårsaget celledød i Bd-2 nedreguleret celler. Deres konklusion indikerede, at apoptoseinducerende faktor (AIF) ikke translokere til kerner som i tilfælde af apoptose, men snarere det forblev inden mitokondrier under hele autofagi. [24].

Sommetider bestræbelser på at klassificere induktion af specifik programmeret celledød, er vanskelig, da mere end ét dødsfald program kan aktiveres samtidigt [25]. Som det fremgår i denne undersøgelse, er en caspase-uafhængig tilstand af celledød induceret af behandling med coumarin-analoger, og der er tegn på involvering af ikke én, men flere apoptose-lignende programmeret celledød, nemlig autophagy, lysosomer (cathepsin B) og endoplasmatiske reticulum (calpain-2).

Lægemidler, der inducerer død gennem lysosomer og endoplasmatisk reticulum hold lovende som mål og formidlere af apoptotisk signalering, der kan være mindre påvirket af iboende eller kemoterapi-induceret resistens mekanisme [26]. Cancercellelinier lysosomer indeholder forøgede niveauer af cathepsiner, og frigivelsen af ​​disse enzymer i cytosolen anses at være nøglen aktiveringstrin af lysosomale død pathway [27]. Ikke-lysosomal calcium-afhængig cysteinprotease (calpain-2) er kendt som markør for ER celledød. Ca. 50 uM af calciumion (Ca

2+) er påkrævet for dets optimale aktivitet i celler. Calpain-2-ekspression vil blive reduceret som følge af auto-nedbrydning af dets aktivering. Cancerceller viser ofte tegn på konstitutiv ER stress, muligvis på grund af hypoxi og glucose depletion som derefter fører til caiciumindstrømning i celler [26]. Forskellige anti-cancer lægemidler, herunder cisplatin [28] og proteasominhibitorer [29], er blevet vist at inducere ER stress.

Mest cytotoksiske midler udløser kun mitokondrier pathway imidlertid forskellige midler, såsom paclitaxel [22] , camptothecin [30], staurosporin [31, 32], inducerede også caspase-uafhængig celledød medieret gennem cathepsin B /D og doxorubicin gennem calpainer [33]. Derfor celledød respons udløst af cytotoksiske forbindelser kan ikke kun omfatte caspaser men proteaser fra andre organeller, som kan handle selvstændigt eller i samarbejde med hinanden. For eksempel en “calpain-cathepsin kaskade” er blevet rapporteret, hvor aktiverede calpainer inducerer frigivelse af cathepsiner og efterfølgende celledød [34, 35].

Denne undersøgelse viste også, at DMDP-1 inducerer autophagy mens DMDP-