PLoS ONE: prognostiske værdi og målrettet hæmning af Survivin Expression i spiserøret adenocarcinom og kræft-Støder Pladecellekræft Epithelium

Abstrakt

Baggrund

Survivin er en inhibitor af apoptose og dens overekspression er forbundet med dårlig prognose i flere maligniteter. Mens flere undersøgelser har analyseret survivin ekspression i esophageal pladecellecarcinom, har få fokuseret på esophageal adenocarcinom (EAC) og /eller cancer-tilgrænsende pladeepitel (SAG). Formålet med denne undersøgelse var 1) for at bestemme graden af ​​survivin opregulering i prøver af ØK og CASE, 2) at vurdere om survivin udtryk i ØK og CASE korrelerer med tilbagefald og /eller død, og 3) at undersøge effekten af survivin hæmning på apoptose i EAC celler.

Metoder

Friske frosne prøver af ØK og CASE fra den samme patient blev anvendt til QRT-PCR og Western blot-analyse, og formalin-fikseret, paraffin- indlejret væv blev anvendt til immunhistokemi. EAC cellelinjer, OE19 og OE33, blev transficeret med små interfererende RNA’er (siRNA’er) til Knockdown survivin ekspression. Dette blev bekræftet ved QRT-PCR for survivin ekspression og Western blot-analyse af spaltet PARP, spaltet caspase 3 og survivin. Survivin udtryk data var korreleret med kliniske resultat.

Resultater

survivin udtryk var signifikant højere i EAC tumorprøver i forhold til sagen fra den samme patient. Patienter med høj ekspression af survivin i ØK tumor havde en øget risiko for død. Survivin udtryk blev også bemærket i CASE og korreleret med øget risiko for fjernt recidiv. Cell line evaluering viste, at hæmning af survivin resulterede i en stigning i apoptose

Konklusion

Højere udtryk for survivin i tumorvæv var forbundet med øget risiko for død.; mens survivin udtryk i CASE var en overlegen prædiktor for tilbagefald. Hæmning af survivin i EAC cellelinjer viste yderligere øget apoptose, støtte de potentielle fordele ved terapeutiske strategier målrettet til denne markør

Henvisning:. Malhotra U, Zaidi AH, Kosovec JE, Kasi PM, Komatsu Y, Rotoloni CL, et al. (2013) prognostiske værdi og målrettet hæmning af Survivin Expression i spiserøret adenocarcinom og kræft-Støder pladeepitel. PLoS ONE 8 (11): e78343. doi: 10,1371 /journal.pone.0078343

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: Juli 29, 2013; Accepteret: September 13, 2013; Udgivet: November 4, 2013 |

Copyright: © 2013 Malhotra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. David Gold og Irene Blumenkranz for at yde gavebistand. Grant tal og URL er ikke tilgængelige. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er i dag den ottende mest almindelige kræftform i verden; med esophageal adenocarcinom (EAC) tegner sig for 50% af esophageal kræfttilfælde [1] – [5]. Overlevelsen femårige for kræft i spiserøret er mindre end 20%, og forekomsten er steget med næsten tre gange på den vestlige halvkugle i de sidste 20 år [6], [7]. De fleste ØK patienter er diagnosticeret med fremskreden sygdom og har dårlige langsigtede overlevelse med de aktuelt anvendte kemoterapeutiske stoffer [5], [8], [9]. Effekten af ​​nuværende behandlingsplaner har nået et plateau og yderligere intensivering af cytotoksiske midler eller stråling dosisoptrapning har vist sig at være forbundet med betydelige bivirkninger. Derfor er behovet for udvikling af effektive målrettede behandlinger rettet mod behandling af specifikke mekanismer carcinogenese kræves for at forbedre overlevelsen [2] -. [4], [10], [11]

Survivin, også kendt som baculovirale inhibitor af apoptose gentagelser og 5 eller BIRC5, er en inhibitor af apoptose eller programmeret celledød [10] – [13]. Virkningsmekanismen gennem indre vej er som følger: survivin binder sig til og hæmmer caspase 9, hvilket forårsager deaktivering af apoptotiske vej; procaspase 3 ikke spaltes, og således ikke spalter PARP (Poly ADP-ribose-polymerase); som et resultat, PARP forbliver aktiv og fortsætter med DNA-reparation, hvilket resulterer i inhibering af apoptose (figur 1) [8], [10], [11], [13], [14]. Normalt survivin kun fundet under embryo- og fosterudvikling som et middel til at regulere korrekt celledeling og vækst og kan ikke påvises i de fleste terminalt differentierede normale væv [15]. Nogle normale voksne væv med vedvarende survivin ekspression omfatter hæmatopoietiske stamceller [16], thymocytter [17], melanocytter [18], gastrisk mucosa [19] og tyktarmsepitelet [19]. Undersøgelser har rapporteret forøget ekspression af survivin i en række af cancere, herunder bryst-, lunge-, melanom, leukæmi, lymfom, colon, pancreas, og osv [15]. Beviser støtter også overekspression af survivin i esophageal pladecellecarcinom og dens association med en dårlig prognose [3], [4], [8], [10], [11], [20]. Fordi survivin ikke udtrykkes i de fleste af sunde væv, det repræsenterer et ideelt mål for udvikling af nye cancer [3], [4], [8], [10], [11], [13], [20 ], [21]. I virkeligheden agenter rettet survivin er i øjeblikket i fase I og kliniske fase II forsøg i patienter med fremskreden kræft, hvor metoder til hæmning omfatter antisense oligonukleotider (Asos), transkriptionelle repressorer og immunterapi [10], [14], [22]. Nogle af disse stoffer har vist lovende første resultater, men ingen har forbedret samlet overlevelse [3], [4], [7], [10], [11], [14], [22] – [24].

Survivin binder sig til og hæmmer caspase 9, caspase 9 er ude af stand til at spalte caspase 3, caspase 3 er ude af stand til at spalte PARP, PARP fremmer DNA-reparation og ikke inducere apoptose.

Selv om der har været mange rapporter, der analyserer rolle survivin i esophageal planocellulært karcinom (SCC), har meget få studier rettet sin rolle i esophageal adenocarcinom (EAC) [3], [4], [7] – [9], [21] , [25], [26]. Desuden ekspression af denne anti-apoptotisk gen i cancer-tilstødende pladeepitel (CASE) er ikke undersøgt. Formålet med vores undersøgelse var derfor 1) for at bestemme graden af ​​survivin opregulering i prøver af EAC patienter og SAG, 2) at evaluere recidiv og overlevelse med survivin udtryk i ØK og CASE væv, og 3) at undersøge effekten af survivin hæmning på apoptose i EAC cellelinjer.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev udført efter at have indhentet godkendelse fra University of Pittsburgh Institutional Review Board. Prøverne blev taget fra UPMC Cancer Center – Esophageal Cancer Risk Registry, University of Pittsburgh IRB Study Number 98-122 med URL: https://www.upmccancercenter.com/trials/trialDisplay.cfm?id=2277 type=D. Som en del af undersøgelsen blev alle patientprøver opnået med fuld skriftlig tilladelse.

cellelinier

ØK cellelinier OE19 (JROECL19) og OE33 (JROECL33) blev opnået gennem Sigma-Alderich (St. Louis, MO). De blev begge opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 cellevækstmedier (Life Technologies, Carlsbad, CA, 21.870.076), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, 26.140.079), 1% L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25.030.081), 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Carlsbad, CA, 15.070.063). Alle celler blev opbevaret i 25 cm

2 kolber og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 befugtet luft. Trypsin-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25.200.072) blev anvendt til at høste celler fra deres kolbe og fremstille en enkelt cellesuspension til Western blot-analyse og revers transkription -. Polymerasekædereaktion (RT-PCR)

siRNA transfektion

OE33 og OE19 blev podet i en 6-brønds plade med en tæthed på 4 x 10

5 24 timer før transfektion. Celler blev enten transficeret med små interfererende RNA’er (siRNA’er) eller ubehandlet. SiRNA kategorier anvendte inkluderet survivin specifikke siRNA eller negativ kontrol (scramble) (Dharmacon, Lafayette, CO, D-001810-10-05). Hver siRNA opløsning blev fortyndet fra 100 uM stock til 5 um i RNase-fri H

2O, derefter fortyndet til 0,25 pM i Opti-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, 31.985.062). Samtidig blev 2 pi transfektionsreagens 4 (Dharmacon, Lafayette, CO, T-2004) pr reaktionsblandingen fortyndet med 98 pi Opti-MEM. Opløsningerne blev separat inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur, blandet sammen og inkuberet i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur. Den endelige siRNA opløsning blev fortyndet til 1 ml pr omsætning med Opti-MEM for en slutkoncentration på 25 nM. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet luft, med et RPMI media ændring efter 24 timer. Hele cellelysat blev indsamlet på 48 timer for RNA-analyse eller 72 timer for protein analyse.

Patienter og Tissue Forberedelse

Undersøgelsen blev udført efter at have indhentet godkendelse fra University of Pittsburgh Institutional Review Board. Patienter, som gennemgik esophagectomy til lokaliseret esophageal adenocarcinom fra begyndelsen af ​​2008 til slutningen af ​​2010 blev inkluderet i undersøgelsen. Syvogfyrre prøver blev screenet, og efter at udelukke pladecellekræft, adenosquamøst cancer og vævsblokke med mindre end 70% tumor, blev i alt 37 patientprøver analyseres til denne undersøgelse. Kliniske data, herunder alder, køn, etnicitet, klinisk fase, vital status, rygevaner, total overlevelse og tid til tilbagefald blev opnået fra Institut for Hjerte-lunge kirurgi kliniske database. For at sikre patientens fortrolighed, blev en ærlig mægler-system anvendes til at tilvejebringe de-identificerede kliniske datasæt knyttet til vævsprøver [27]. Frisk frosset væv indlejret i OCT blev anvendt til kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) og Western blot analyse. Formalinfikseret, blev paraffin-indlejret (FFPE) væv, der anvendes til immunhistokemi.

Western blot-analyse

Protein blev opsamlet fra hver cellelinie behandlingsgruppe ved tilsætning lysepuffer (RIPA-buffer indeholdende 0,1% proteaseinhibitorcocktail mix, 0,1% Halt phosphatase inhibitor cocktail mix og 1% PMSF) og under anvendelse af en celle løfteren. Opløsningen blev roteret i en time ved 4 ° C til fuldstændig lysere cellerne, derefter centrifugeret ved 12.000 g ved 4 ° C i 20 minutter for at separere proteinet. Supernatanten indeholder proteinet blev opsamlet og kvantificeret under anvendelse BCA Pierce Assay (ThermoFisher, Rockford, IL, 23227). Femogtredive ug protein fra hver prøve blev denatureret og opløst ved 4-20% SDS-PAGE-gradient gel (Bio-Rad, Hercules, CA, 161-1159), derefter elektroblottet til en Immobilon-P PVDF nitrocellulosemembran (Millipore Corporation , Billerica MA, IPVH08100). Membranen blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk i TBS-T ved stuetemperatur i en time. Antistoffet af interesse blev inkuberet med membranen ved 4 ° C natten over, efterfulgt med 1,5 timers inkubation ved stuetemperatur i den tilsvarende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Cell Signal, Boston MA, 7074 eller 7076, 1:3,000) Survivin antistof ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Tx, sc-47.750) blev anvendt ved 1:200, caspase-3 (Cell Signal, Boston, MA, 9665) ved 1:1,000, kløvet-PARP (Cell Signal, Boston, MA, 9546) ved 1:2,000 og β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A1978) ved 1:30,000 blev anvendt som en loading kontrol. Signaler blev udviklet under anvendelse af en kemiluminescens-reagens (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 509.049.324)

Kvantitativ Reverse Transcription -. Polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Totalt RNA blev oprenset fra cellelinier under anvendelse RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, 74.004). Kort beskrevet pellets indeholdende 1 x 10

6 celler blev hvirvelbehandlet i RLT lysepuffer og RNA blev ekstraheret efter fabrikantens protokol under anvendelse af et elueringsvolumen på 14 ul. Ved hjælp af en ND-2000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), blev kvaliteten og mængden af ​​RNA vurderet af OD

260/280. Komplementær DNA (cDNA) blev revers transkriberet fra 3 ug totalt RNA under anvendelse af RNA til cDNA ecodry forblanding i et samlet volumen på 20 ul (Clontech, Mountain View, CA, 639.547) ifølge fabrikantens protokol. Reaktionsbetingelserne var 42 ° C i 60 minutter, efterfulgt af 70 ° C i 10 minutter under anvendelse af ABI Prism 7900HT PCR thermocycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). PCR blev udført i et totalt volumen på 20 ul under anvendelse af 600 ng cDNA, 1 × Taqman PCR universal mastermiksens (Invitrogen, Grand Island, NY, 4.304.437), og 1 × Survivin eller GAPDH primer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA hs03043576_m1 og hs99999905_m1) for hver reaktion. De cykliseringsparametre var: en cyklus på 95 ° C i ti minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 sekunder, og 60 ° C i et minut på et StepOne Plus-systemet (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Alle reaktioner blev kørt i tekniske dubletter.

Ekstraktion af totalt RNA fra frisk frosset væv blev udført ved anvendelse af Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA 74.104). Kort fortalt blev 10 um OLT sektioner skæres i RLT-buffer, lyseret under anvendelse af en 20 gauge stump ende nål og RNA blev ekstraheret efter producentens instruktioner under anvendelse af et elueringsvolumen på 50 ul. QRT-PCR blev udført med et-trins QRT-PCR-kittet (Life Technologies, Carlsbad, CA 4.310.299) ifølge producentens instruktioner i et samlet volumen på 20 ul under anvendelse af 2 ul af væv lysat og 1 × Survivin eller 1 × GAPDH primer ( Life Technologies, Carlsbad, CA hs03043576_m1 og hs99999905_m1) for hver reaktion. Cyklus anvendte betingelser var: 1 cyklus ved 50 ° C i 30 minutter, 95 ° C i 2 minutter og 50 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 45 sekunder med ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Carlsbad, CA). Alle reaktioner blev kørt i tekniske triplikater. Amplifikationsprodukter grunde til både prøve kategorier, cellelinjer og friske frosne væv blev undersøgt med StepOne software, der følger med StepOne Plus-systemet, til at bestemme tærsklen cyklus (CT). GAPDH blev brugt til normalisering af udtryk data. De 2

-ΔCT metode blev anvendt til at bestemme survivin fold udtryk i tumorvæv og CASE.

Immunhistokemi

FFPE sektioner blev immunofarvede at vise survivin udtryk i ØK tumor og parrede pladeepitelceller prøver . Reaktiv human tonsil og ikke-immunt serum blev kørt parallelt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Vævsprøver blev skåret ved 4 um på ladede objektglas og afparaffineres. Objektglassene blev nedsænket i 0,01% Triton X-100 i ti minutter ved stuetemperatur, skyllet i ledningsvand H

2O, nedsænkes derefter i 10 mM citrat, pH 6,0 ved 95 ° C i 20 minutter for antigen-genvinding. Blokering forekom med 3% H

2O

2 efterfulgt af en vandhane vask. Efter tre vaskninger med 1 × Tris-bufret saltvand med 0,001% Tween 20 (TBS-T) blev objektglassene yderligere blokeret i 2,5% normalt hesteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401). Den survivin primære antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc47750) blev påført ved 1:50, natten over ved 4 ° C. Objektglas blev vasket tre gange i TBS-T, derefter inkuberet i ImmPress anti-kanin-reagens (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401) i 30 minutter til at støtte i survivin ekspression detektion. Igen blev objektglassene vasket tre gange i TBS-T, og fremkaldt under anvendelse IMMPACT DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK4105).

Statistical Analysis

Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS software (IBM, Armonk, NY, Version 20). En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Inden for hver vævsprøve, middelværdier for Survivin mRNA ekspressionsniveauerne (bestemt af 2

-ΔCT metode) blev evalueret i både ØK tumorvæv (tumor survivin niveau) og CASE vævsprøver (normal survivin niveau). Students t-test blev anvendt til at sammenligne middelværdien tumorvæv og normalt survivin niveauer. Receiver operating characteristic (ROC) analyse blev anvendt til bestemmelse af, om survivin niveauer kunne anvendes til at definere høj og lav risikogrupper for tilbagefald; høj risiko /tærskler de lave risiko, der er etableret i ROC analyser blev anvendt til at kategorisere patienter som høj risiko /lav risiko for både CASE væv survivin niveauer og ØK væv survivin niveauer. Separate ROC analyser blev udført forudsige tilbagefald fra CASE væv survivin niveauer og fra EAC væv survivin niveauer. I begge tilfælde visuel inspektion af de producerede grafiske figurer blev anvendt i forbindelse med listet survivin score skærepunkter med tilsvarende følsomhed og (1 minus) specificitet for at bestemme optimale tærskler til at definere høje og lave risikogrupper.

Vedrørende ROC proceduren for tærskel beslutsomhed, vi brugte den standard metode til visuel inspektion kurven til at bestemme, at nærmeste punkt til det øverste venstre hjørne af ROC figuren, sammen med inspektion af tilsvarende følsomhed og specificitetsværdier langs tilgængelige værdier. Dette gav en middel til at bestemme hvilken værdi forudsat den bedste balance mellem sensitivitet og specificitet. Ved inspektion af ROC tal, denne inspektion var relativt ligetil for CASE dog var noget mindre ligetil for tumor celle niveauer. I dette tilfælde blev en værdi valgt at understregede følsomhed på bekostning af specificitet, som falske negative blev bedømt til at være farligere end var falske positiver. Dette påberåbt mere tungt på de beregnede følsomhed /specificitet værdier, som der var en ikke-signifikant AUC (areal under kurven) og derfor ikke umiddelbart synlige cut point.

Kaplan-Meier-kurve blev genereret for at bestemme overlevelsen baseret på høj og lav risiko gentagelse grupper. En Mantel-Cox log rank test blev udført for at sammenligne den samlede overlevelse mellem risikogrupper. En Cox proportionel risiko model blev brugt til at vurdere effektiviteten af ​​survivin niveau inden for både CASE og EAC vævsprøver forudsige dødelighed.

Resultater

Overekspression af survivin i EAC cellelinjer, menneskelig tumor og CASE væv

Survivin mRNA-ekspression var betydeligt højere i tumorprøver i sammenligning med prøver CASE væv på QRT-PCR-analyse (figur 2A). I gennemsnit tumorprøver demonstrerede niveauer af survivin ekspression 3 × større end den for CASE væv (p. 0.00001 Figur 2B). Immunhistokemi (figur 3) og Western Blot-analyse (data ikke vist) bekræftede også survivin ekspression i både ØK tumor samt CASE

A:. QRT-PCR blev udført for at sammenligne survivin ekspression mellem tumor og tilstødende skællede epitel væv. B: I gennemsnit viste tumorprøver 3 × større survivin udtryk end parret tilstødende væv

Survivin udtryk blev evalueret gennem IHC farvning, tumorvæv og tilstødende pladeepitel viste tilstedeværelse af farvning indikerer survivin udtryk.. Pile repræsenterer positiv farvning.

Hæmning af survivin i EAC cellelinjer medførte øget apoptose

siRNA målrettet til survivin resulterede i nedsat udtryk for survivin i OE19 og OE33 cellelinjer sammenlignet med kontroller på QRT-PCR (figur 4A). Tilsvarende siRNA inkubation resulterede i nedregulering af survivin ekspression i begge cellelinier på Western blot-analyse. Faldet i survivin ekspression resulterede i opregulering af den nedstrøms apoptotisk protein, spaltet PARP. Spaltet caspase 3 blev forbrugt gennem omsætning med PARP, hvilket resulterer i opregulering af spaltet PARP (Figur 4B).

OE19 og OE33 EAC cellelinier transficeret med siRNA og survivin ekspression blev analyseret mellem kontrol og transficerede cellelinier. Begge cellelinier transficeret med siRNA viste tydelig hæmning og nedregulering af survivin ekspression. B: Western blot af siRNA inhibering af survivin i ØK cellelinie. siRNA blev inkuberet med OE19 og OE33 cellelinier til at inhibere survivin ekspression. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. Survivin blev nedreguleret, mens downstream apoptotiske proteiner spaltes caspase 3 og spaltes PARP blev opreguleret. Den opregulering af downstream apoptotiske proteiner indikerer apoptose sker gennem inkubation med siRNA.

Kliniske konsekvenser af survivin overekspression

Syvogtredive EAC patienter, som gennemgik esophagectomy til lokaliseret esophageal adenocarcinom var medtaget i den undersøgelse (tabel 1). Prøverne bestod tredive mænd (81%) og syv kvinder (19%) med aldre spænder fra 44 til 90 år (gennemsnit = 62,76, sd = 10,94). Stage fordeling af undersøgelsen kohorte baseret på The American fælles udvalg om kræft (AJCC) kræft iscenesættelse bekræftede 6 patienter med stadium I sygdom, 13 med trin II og 18 patienter med stadium III sygdom (tabel 2). Syv patienter fik neo-adjuverende terapi og atten patienter fik adjuverende kemoterapi efter operationen. To patienter i neo-adjuvant gruppe modtog samtidig kemo-stråling og størstedelen af ​​patienterne modtog platin /fluoruracil baseret kombinationskemoterapi (tabel 3). Ved en gennemsnitlig opfølgning på 12.06 måned, tretten patienter udviklede recidiv, 12 patienter med fjernmetastaser og en patient, som der ikke blev rapporteret data. Af de 12 patienter med fjernmetastaser, 3 havde også lokalt recidiv. Ti patienter (77%) var død på tidspunktet for langsigtet opfølgning. Vejviser

ROC analyse viste, at en tærskel på større end eller lig med 2,85 for gennemsnitlig survivin mRNA-ekspression i CASE var tegn på en øget risiko for fjernmetastaser med en følsomhed på 0,77, specificitet 0,83, og en AUC på 0,73 (p. 0,05 PPV = 0,71, NPV = 0,87) (Figur 5). Således patienter, der udviser gennemsnitlig survivin udtryk for 2,85 eller større i CASE blev klassificeret i højrisikogruppen og dem med ekspressionsniveauer af mindre end 2,85 blev kategoriseret i gruppen med lav risiko. På trods af en normal histologiske udseende, survivin overekspression i CASE viste sig at være en indikator for fjernt recidiv. Survivin ekspression i tumorvæv korrelerede ikke med tilbagefald. Kategorisering i høj og lav risikogrupper ved hjælp af en tærskel

tumor

survivin udtryk for 3,66 ikke forudsige recidiv (p = 0,55), men gjorde forudsige en stigning i oddsene for død fra ØK (beskrevet senere).

sandsynligheden for fjernmetastaser blev bestemt for survivin niveauer i human ØK tumor og tilstødende skællede epitel væv. En øget survivin niveau i tilstødende skællede epitel væv blev bestemt til at være en risikofaktor for fjernmetastaser (p = 0,02).

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret for høj og lav risikogrupper baseret på CASE survivin ekspression. Den højrisikogruppe demonstrerede en forening med øget dødelighed, selv om sammenhængen ikke nåede signifikans (p = 0,12, figur 6). Kaplan-Meier analyse for tumor survivin høje og lave risikogrupper gav lignende resultater (p = 0,11).

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret for høje og lave grupper risiko baseret på tilstødende skællede epitel survivin CASE-udtryk. Den højrisikogruppe demonstrerede en forening med øget dødelighed, selv om sammenhængen ikke nåede signifikans. Kaplan-Meier analyse for tumor survivin høje og lave risikogrupper gav lignende resultater (p = 0,11).

en Cox proportionel risiko model blev brugt til at vurdere effektiviteten af ​​survivin niveau inden for såvel CASE og EAC tumor vævsprøver i forudsige dødeligheden. Andre risikofaktorer overvejes var alder på tidspunktet for esophagectomy, rygning (i pakker per år), alkoholforbrug, og en historie af Barretts øsofagus (tabel 4). Rygning var forbundet med en højere dødelighed (p = 0,06) med odds for dødelighed er 1,018 større for hver pakke pr røget. Survivin ekspression i tumorvæv var forbundet med øget risiko for død (p = 0,05). Sandsynligheden for en patient i tumoren survivin højrisikogruppen oplever død var 5,23 gange større end for en patient kategoriseret i gruppen med lav risiko (p 0,05)

Diskussion

.

Undersøgelser har vist højere niveauer af survivin i metaplastisk søjleformet epitel og dysplastiske Barretts epitel sammenlignet med skællede væv således understøtter den hypotese, at opregulering af dette gen er sandsynligvis en tidlig arrangement forud udvikling af adenocarcinom [12]. Rapporter har også støttet survivin som en potentiel biomarkør i esophageal planocellulært karcinom [28], men der er modstridende evidens for dets prognostisk rolle i esophageal adenocarcinom [29]. I en undersøgelse af Rosato og kolleger, survivin udtryk havde nogen prognostisk værdi for patienter med ØK. [9] Formålet med den aktuelle undersøgelse var at evaluere rollen af ​​denne anti-apoptotisk gen mere indgående i esophageal adenocarcinom og SAG under hensyntagen tumor heterogenitet samt ekspression af genetiske ændringer forud for histologisk manifestation af tumor fænotype i tilstødende epitel .

Analyse af humant væv ved hjælp af IHC, Western blot, og QRT-PCR bekræftede opregulering af survivin i ØK tumorvæv i forhold til CASE. Vores resultater fastslået, at øget survivin udtryk i ØK tumorvæv er en risikofaktor for død med tumoren survivin højrisikogruppen er 5 gange mere tilbøjelige til at dø end dem, kategoriseret i survivin gruppen med lav risiko. Det er muligt, at den højere ekspression i ØK tumorvæv kan vedrøre den aggressivitet af tumoren (dvs. forværring cellulær dysregulering), dermed korrelerer med dødelighed. Men baseret på vores stikprøve størrelse, denne undersøgelse er sandsynligvis underdimensioneret og ville være behov for større serier af patienter til at studere disse foreninger yderligere.

Derudover udtryk for survivin i CASE var ikke helt fraværende, som ville forventes for uhelbredeligt differentieret normale pladeepitel [10], [11]. Overvejer dokumentation opregulering af dette gen i præmaligne metaplastisk og dysplastiske søjleformet epitel, vore data antyder, at survivin overekspression kan være et tidligt genetisk hændelse forekommer i histologisk normalt udseende pladeepitel før udvikling af metaplasi og transformation til adenocarcinom. Selvom slimhinden støder op til tumoren opretholder pladedifferentiering, det huser overekspression af denne anti-apoptotisk gen, som kunne være en potentiel drivkraft for tumorigenese. Alternativt kunne det postuleres, at baseret på korrelation med tilbagefald, kunne survivin udtryk i CASE opfattes som den molekylære svarer til en positiv margin og /eller en indikator for fjernt recidiv. Hvis forhøjede survivin niveauer i CASE repræsenterer molekylære beviser for, at tilstødende væv viser tegn på malignitet, kan prognosen være værre end forudsagt klassifikationssystem for pTNM. Det kunne postuleres, at den omstændighed, at der ikke var en stigning i dødeligheden hos patienter med forhøjede survivin niveauer i CASE kunne repræsenterer en type II fejl sekundært til den lille stikprøve. Større undersøgelser kan bidrage til at afklare disse foreninger

Det faktum, at survivin udtryk i tumor ikke korrelerer med tilbagefald kunne være fra det faktum, at disse patienter døde før tilbagefald kunne have været dokumenteret.; denne antagelse støttes af, at der var flere patienter med fremskreden sygdom i tumoren udtryk højrisikogruppen. Som det fremgår af tidligere undersøgelser, hver tumor udviser signifikant heterogenitet med intra-tumor variationer i somatiske mutationer, allelisk sammensætning, tumor suppressor og oncogen dysregulering [30]. Overvægten af ​​flere unikke kloner i samplet tumorvæv kan føre til forskellige resultater, når du udfører molekylær profilering af en given kræft. I den foreliggende undersøgelse gange ændring i survivin mRNA var meget variabel i tumorvæv i sammenligning med tilfældet, og dette kan afspejle tumor heterogenitet og tilvejebringe en potentiel forklaring på den manglende korrelation med tumor tilbagefald. SAG demonstrerede mere ensartede niveauer og er måske et bedre substrat for evaluering af survivin som prognostisk markør hos patienter med ØK. Disse data understreger behovet for en samordnet indsats til bank og analysere kræft-tilstødende histologisk normalt udseende væv til molekylær profilering i ØK og måske andre tumorer.

Cell line analyse i nærværende undersøgelse bekræftede klar hæmning af survivin gennem transfektion med siRNA. Survivin blev effektivt nedreguleret og spaltes caspase 3 blev forbrugt i reaktionen fører til opregulering af spaltet PARP, hvilket indikerer, at inhibering af survivin fører til aktivering af den apoptotiske vej. Da survivin ikke udtrykkes i normalt væv, er det potentielt et ideelt mål for nye stoffer [10], [11]. Derfor effektiv hæmning gennem siRNA med nedstrøms aktivering af apoptose understøtter gyldigheden af ​​fremtidige kliniske forsøg i ØK evaluering af effektiviteten af ​​et nyt middel, der bruger siRNA eller andre hæmmende veje [10].

Som konklusion Den foreliggende undersøgelse understøtter opregulering af survivin som en potentiel tidlig genetisk ændring i ØK forekommer i normalt udseende CASE. Survivin udtryk inden ØK væv var en signifikant prædiktor for dødelighed, mens udtrykket niveau survivin i CASE var en mere pålidelig indikator for tumor tilbagefald. Derudover vi viste også, at hæmning af survivin i EAC cellelinjer fører til opregulering af apoptose støtte yderligere evaluering af terapeutiske strategier målrettet til denne markør.

De begrænsninger af undersøgelsen omfatter den lille stikprøvestørrelse og en relativt kortere opfølgning. Yderligere undersøgelser med større stikprøvestørrelser og længere opfølgning kan hjælpe med at afklare nogle af de foreninger bemærkede i undersøgelser af survivin udtryk i ØK og CASE. Dette ville også hjælpe med at kontrollere for flere faktorer, der påvirker tilbagefald og overlevelse hos patienter med ØK.

Tak

Dr. James D. Luketich for hans støtte af undersøgelsen.