PLoS ONE: In vitro Model of Metastase til Bone Marrow formidler Prostata Cancer Kastration Resistant Vækst gennem parakrin og ekstracellulære matrix Factors

Abstrakt

Spredning af prostata kræftceller til knoglemarven mikromiljø og kastrationsresistent vækst er nøglen skridt i sygdomsprogression og betydelige kilder til sygelighed. Imidlertid er den biologiske betydning af mesenkymale stamceller (MSC’er) og knoglemarv afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM) i denne proces ikke fuldt forstået. Vi har derfor etableret en

in vitro

manipuleret knoglemarv væv model, der samler hMSC’er og BM-ECM at lette mekanistiske studier af prostatakræft celleoverlevelse i androgen-udtømte medier som reaktion på parakrine faktorer og BM-ECM. hMSC-afledte parakrine faktorer øget LNCaP celleoverlevelse, som var delvist tilskrives IGFR og IL6 signalering. Desuden BM-ECM øget LNCaP og MDA-PCa-2b celleoverlevelse i androgen-depleterede betingelser, og induceret kemoresistens og morfologiske ændringer i LNCaPs. For at bestemme virkningen af ​​BM-ECM på cellesignalering, blev phosphorylering status 46 kinaser undersøgt. Stigninger i phosphorylering af MAPK-vejen-relaterede proteiner samt vedvarende Akt phosphorylering blev observeret i BM-ECM-kulturer sammenlignet med kulturer dyrket på plasma-behandlet polystyren. Blokering MEK1 /2 eller PI3K pathway førte til en betydelig reduktion i LNCaP overlevelse ved dyrkning på BM-ECM i androgen-depleterede betingelser. Den kliniske relevans af disse observationer blev bestemt ved at analysere Erk fosforylering i human knogle metastatisk prostatacancer versus ikke-metastatisk prostatacancer, og øget fosforylering blev set i de metastatiske prøver. Her beskriver vi en manipuleret knoglemarv model, der efterligner mange funktioner hos patienter og giver en platform for mekanistiske

in vitro

undersøgelser

Henvisning:. Lescarbeau RM, Seib FP, Prewitz M, Werner C , Kaplan DL (2012) in vitro model af Metastase til Bone Marrow formidler Prostata Cancer Kastration Resistant vækst gennem parakrin og Ekstracellulære Matrix Faktorer. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10,1371 /journal.pone.0040372

Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA

Modtaget 11. april 2012; Accepteret: 7 jun 2012; Udgivet: 1. august, 2012 |

Copyright: © Lescarbeau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud P41 EB002520-05 (Tissue Engineering Resource center) (DL Kaplan). FP Seib understøttes af en Mildred Scheel Postdoc stipendium fra den tyske Cancer Aid. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

knoglemarvens mikromiljø giver mange signaler, som muliggør overlevelse og spredning af prostata cancer celler. Det er nu veletableret, at især osteoblast udskilles faktorer gør det muligt androgen uafhængig vækst af metastaseret prostatacancerceller [1], [2]. Desuden knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM) er impliceret i progressionen af ​​andre cancerformer, såsom multipelt myelom, via aktivering af pathways associeret med overlevelse [3].

På grund af den betydelige tropisme af prostatakræft for knoglemarv, talrige

in vivo Salg modeller er blevet udviklet for at studere denne interaktion. Disse omfatter xenograft musemodeller, hvor kræftceller er injiceret intratibially [4] humaniserede musemodeller, hvor menneskelig knogle er placeret subkutant og derefter podet med prostata kræftceller, subkutan implantation af manipuleret væv knogle [5], og hule fibre, der indeholder både prostatakræft og knogle lignende celler [6]. Disse

in vivo

modeller, dog er lille produktion og potentielt lider xenogene interaktioner. For at overvinde nogle af disse begrænsninger, og at tillade forbedrede mekanistiske og high throughput screening studier, forskerne bruger

in vitro

cellekultur modeller. Først for nylig har konventionel plasma behandlet polystyren (PTP) vævskultur ware blevet erstattet af kultur substrater, tættere efterligner

in vivo

tumor mikromiljø. Disse har omfattet modeller studerer parakrine interaktioner og for nylig ECM interaktioner [7], [8], [9]. Men ingen af ​​disse studier har brugt et konstrueret knoglemarv væv model i kombination med androgen forarmet medier til at modellere kastrationsresistent prostatacancer progression

in vitro.

vækst og overlevelse af prostata cancer celler i androgen forarmet betingelser er blevet tilskrevet en række mekanismer. Opregulering af androgenreceptoren tillader forøget sensitivitet, mutationer muliggør øget promiskuitet til andre ligander, samt intracrine syntese af androgen af ​​prostatacancerceller bidrager til androgenuafhængig vækst [10]. Andre fremgangsmåder til androgenuafhængig vækst indbefatter aktivering af mitogene veje og transkriptionsfaktorer, såsom MAPK, PI3K, STAT3, og β-Catenin [11], [12]. Aktivering af disse veje muliggør androgenuafhængig vækst eller celleoverlevelse via co-aktivering af androgenreceptoren.

Forrige

in vitro Salg undersøgelser antydet, at enkelte ECM komponenter kan fungere som ligander til at inducere mitogen cellesignalering og overlevelse. For eksempel fibronectin, som er en komponent af BM-ECM, inducerede MEK phosphorylering gennem FAK og Src [13]. Tilsvarende integrin β1 og IGF-1R interaktioner med fibronektin medieret kemoresistens i prostatacancer-cellelinie DU145 [14]. Disse studier indikerer en mulig rolle for BM-ECM ligander aktiverende pathways associeret med androgen uafhængig vækst og sygdomsprogression.

Co-kulturer af humane mesenkymale stamceller (hMSC’er) og prostatacancerceller tillader parakrin signalering, inducerer osteogenese, og støtter prostatakræft overlevelse. Til paneler A, B, blev C rå værdier normaliseret til den negative kontrolgruppe. (A) hMSC’er blev behandlet med normal vækst medier, LNCaP konditionerede medier, PC3 konditionerede medier eller osteogene medier 14 dage. De blev derefter farvet med alizarinrødt som efterfølgende blev ekstraheret og kvantificeret for at bestemme calcium deposition. (B) QRT-PCR for de angivne udskrifter. Hver gruppe blev dyrket som beskrevet i (A), og RNA ekstraheredes efterfølgende. (C) Indirekte co-kulturer af hMSC’er med LNCaPs i androgen slettede medier i nærværelse af IGFR inhibitoren AG1024 eller IL6-inhibitorer, AG490 og anti-IL6 mAb. Celler blev udpladet i vækstmedium, lodes restituere i 24 timer, og derefter skiftede til androgen forarmet medium plus inhibitor. LNCaP levedygtighed blev målt efter 7 dage. (D) IL6 koncentrationer i konditioneret dyrkningsmedium. (E) IGF-1 koncentrationer i konditionerede medier efter 48 timer fra hver celletype dyrket alene. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, ± SEM).

knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM) beskytter prostatakræft celler mod androgen udtynding og kemoterapi. Til paneler A, B, blev C rå værdier normaliseret til den negative kontrolgruppe. (A) Vækst af LNCaP-celler over tid dyrket i androgen forarmet medier som målt via MTT. Lige mange LNCaPs blev podet til BM-ECM eller PTP med en n af 4 pr gruppe pr tidspunkt, og analyseret på den pågældende dag. (B) MDA-PCa-2bs blev udpladet og skiftede til androgen slettede medier som beskrevet i (A) og blev bestemt cellelevedygtighed efter 4 dage. MDA-PCA-2BS celler var også dyrket på kommerciel ECM. (C) Cellelevedygtighed af LNCaP-celler efter 72 timer i vækstmedium med 25 nM docetaxel. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, bortset fra som anført i (A), ± SEM)

Knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix. (BM-ECM) inducerer klynge lignende vækst af LNCaPs der modstår androgen depletering. LNCaPs blev podet til BM-ECM og PTP, som beskrevet i figur 2A. Scanningselektronmikrografer af 7 dage gamle kulturer i (A) normale vækstmedier og (B) androgen depleteret medier. (C) Højere forstørrelse scanningselektronmikrografi af LNCaP (sort asterisk) celler dyrket på BM-ECM (hvid asterisk). (D) Den cirkulær LNCaPs på PTP i androgen forarmet og vækstmedium og LNCaPs på BM-ECM i androgen udtømte medier blev kvantificeret fra scanning elektron mikroskopi billeder efter 7 dage i kultur (* P 0,05; ** P 0,01; * ** P. 0,001, ± SEM)

Angivelse af avp3 integrin på LNCaP celler medierer adhæsion til knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM). (A) celleoverfladeekspression af avp3 integrin som målt ved flowcytometri. (B) Anti-avp3 integrin antistof reduceret celleadhæsion til BM-ECM. Rå værdier blev normaliseret til kontrol IgG gruppen. (N = 3, * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM).

Differential phospho-proteomics af LNCaP celler dyrket på knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM). (A) Hierarkisk klyngedannelse afslører LNCaPs på BM-ECM i androgen udtømte medier grupperet mest tæt med LNCaPs dyrket på PTP i vækstmedier (B) Differential fosforylering af LNCaPs på BM-ECM i androgen udtømte medier versus LNCaPs på PTP i androgen udtømte medier. (C) Differential fosforylering af LNCaPs på PTP i androgen udtømte medier versus LNCaPs på PTP i vækstmedier. (D) Differential fosforylering af LNCaPs på BM-ECM i androgen udtømte medier versus LNCaPs på PTP i vækstmedier.

knoglemarv-afledte ekstracellulære matrix (BM-ECM) inducerer forskellen signalering i LNCaP celler, medierer celle overlevelse. Figur paneler C, D, E rå værdier blev normaliseret til den negative kontrolgruppe. (A) Western blot af LNCaPs indikerer øget phospho-ERK1 /2-og phospho-p90RSK som reaktion på BM-ECM. (B) Effekt af PI3K, LY294002, eller MEK1 /2, U0126, inhibitorer på LNCaPs dyrket på BM-ECM. Celler blev udpladet ved lige densiteter til BM-ECM eller PTP i vækstmedier og efter 24 timer skiftet til androgen udtømte medier ± inhibitorer. Cellelevedygtighed blev målt efter 7 dage (n = 3). (C) Relativ apoptose som målt ved anvendelse af et glucose-6-phosphat-dehydrogenase-assay efter 72 timer. Klar bar indikerer vækstmedier, sorte bjælker androgen forarmet medier. Lyserede celler er en positiv kontrol (n = 8). (D) LNCaPs blev dyrket på PTP indirekte med hMSC’er, på BM-ECM, eller i begge tilstande samtidigt mens i androgen forarmet medier. Relativ cellelevedygtighed blev målt efter 7 dage (n = 3, bortset fra som anført i (D), * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM). (E) Reduktion i phospho-Erk1 /2 i LNCaP celler på BM-ECM når de behandles med U0126 og LY294002.

farvning for Erk fosforylering på et væv microarray fra primære tumor prøver, og knogle metastatiske prøver (A) Repræsentative vævssnit farvet for p-Erk fra primær prostata tumorprøver. Prøve VI indeholdt den eneste betydelige positiv farvning i primære prostata prøver. (B) Vævssnit farvet for p-Erk fra knogle metastatisk prostatacancer prøver (skala barer er 200 um).

Den gennemsnitlige score plottet for hver gruppe er taget fra to blindede efterforskere (sorte cirkler). Farvning i knoglemetastaser sektioner er betydeligt overforbrug både normale væv og primære tumorer sektioner (n = 8 for normal prostatavæv, n = 72 for primær tumor, og n = 4 knoglemetastaser, *** P 0,001, ± std dev.. ).

Her præsenterer vi en

in vitro

platform, som muliggør effektiv og præcis undersøgelse af knoglemarven tumor mikromiljø med særligt fokus på BM-ECM’er. Vi brugte dette system til at undersøge respons prostata kræftceller og var i stand til at identificere en række faktorer, der bidrog til sygdomsprogression herunder androgen uafhængig vækst og kemoresistens. De identificerede faktorer omfattede IGF1 og IL6 parakrin signalering, og aktivering af MAPK pathway via BM-ECM-signalering.

Materialer og metoder

Cell kultur og BM-ECM substrat

LNCaP, PC3, og MDA-PCa-2b celler blev for nylig købt fra ATCC (Manassas, VA), som validerer cellelinjer hjælp STR analyse. Hele knoglemarvsaspirater blev opnået fra Lonza (Basel, Schweiz), og hMSC’er blev isoleret og karakteriseret som beskrevet andetsteds [15]. Efter isolering hMSC’er blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% Penicillin Streptomycin, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 1 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor. LNCaP og PC3-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og 1% penicillin streptomycin. Mens MDA-PCa-2B-celler blev dyrket i BRFF-HPC1 medium (Athena ES, Baltimore, MD) suppleret med 20% FBS uden Penicillin Streptomycin. For undersøgelser med androgen forarmet medier blev phenolrødt frie base medier anvendes med 10% trækul strippet FBS. Indirekte co-kulturer anvendt 1 um porestørrelse transwell inserts (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) med én celletype podet på vævskulturpladen og en anden på celledyrkningsinsert. Indirekte co-kultur studier brugte en 1:01 forhold af medier fra de to celletyper af interesse. I androgen depleteret studier blev begge medietyper fremstillet som beskrevet ovenfor. Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Knoglemarven-afledte ECM blev genereret som beskrevet andetsteds [16]. Medmindre andet er angivet alle cellekultur reagenser blev erhvervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

Androgen udtømt vækst undersøgelser

For androgen uafhængige vækst /overlevelse undersøgelser, prostatacancerceller blev podet ved 5.000 celler /cm

2 i vækstmedier på enten PTP eller BM-ECM. Undersøgelser, herunder MDA-PCa-2b celler blev PTP kontrolplader også overtrækkes først med en proprietær cellebinding matrix, der indeholder fibronectin, collagen og albumin (Athena ES, Baltimore, MD) for at lette celleadhæsion. Celler lodes adhærere i 24 timer, hvorefter kulturerne blev vasket med PBS, og skiftede til androgen forarmet medier. LNCaP-celler på BM-ECM eller PTP blev analyseret som beskrevet nedenfor i de respektive tidspunkter for at fuldføre vækstkurven, eller mediet blev udskiftet. MDA-PCa-2b celler blev kultur i 4 dage, mediet blev udskiftet efter 2 dage, og de relative celleantal vurderet via 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, Invitrogen ) i slutningen af ​​dyrkningsperioden efter fremstillingen protokol. Gyldigheden af ​​MTT-analysen blev bekræftet ved at sammenligne med manuel optælling og DNA kvantificering (Fig. S1A, S1B). MTT-værdier blev normaliseret til den negative kontrol, som vilkårligt blev sat til en værdi på én. Salg

Integrin blokerende eksperiments

Suspenderede LNCaP-celler blev præinkuberet med et blokerende monoklonalt antistof mod avp3 (20 ug /ml), klon 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), eller IgG isotypekontrol i 30 minutter og derefter podet til BM-ECM. Efter 12 timer blev mediet aspireret, og cellerne blev vasket en gang med PBS. Det relative celleantal blev derefter målt under anvendelse af et MTT-assay som beskrevet ovenfor.

Docetaxel behandlingsstudierne

prostatacancerceller blev podet på PTP eller BM-ECM som beskrevet ovenfor og får lov at komme sig i 24 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS og erstattet med vækstmedium suppleret med 25 nM docetaxel eller kun vehikel. Celler blev udsat for behandling i 72 timer, og den relative cellelevedygtighed blev derefter målt ved hjælp af en MTT assay, som blev normaliseret som i tidligere MTT assays.

ELISA assays

At indsamle betingede medier prøver hver celletype blev seedet til PTP og co-kulturer udføres med transwell skær med hMSC’er på PTP og LNCaP celler podet til indlæggene. Konditionerede medier fra hver gruppe blev fjernet hver 48 timer og erstattet med frisk medium. Både IL6 og IGF-1 ELISA-kits blev udført ifølge producentens instruktioner (eBioscience og R 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001). Data blev repræsenteret som middelværdi ± SEM, medmindre andet er angivet. Billede cirkularitet analyse blev gennemført ved hjælp af ImageJ og foreslog tærsklingsrutine indstillinger. Stigende værdier på cirkularitet skala indikerer stigende cirkulære celler. Protein microarray data blev scannet som en billedfil og den integrerede pixel intensitet for hvert punkt målt med ImageJ. Gennemsnittet af dubletter blev taget, data blev betyder centreret, og blev udført hierarkiske clustering analyse. Differential protein fosforylering mellem grupperne blev udtrykt som forskellen mellem to målinger, divideret med befolkningen standardafvigelse.

Resultater

parakrine interaktioner af hMSC’er og LNCaPs fremmer osteogen differentiering af hMSC’er og androgen uafhængig overlevelse LNCaPs

for bedre at forstå den parakrin signalering mellem hMSC’er og prostata kræftceller, vi brugte indirekte co-kulturer af LNCaPs og hMSC’er. LNCaPs inducerer osteogen differentiering af hMSC’er (fig. 1A, 1B), som lignede osteoblast aktivering hyppigt ses hos patienter med prostatacancer [20]. Desuden blev overlevelsen af ​​LNCaP-celler i hMSC co-kulturer signifikant forøget i løbet monotypic LNCaP kulturer i androgen depleteret medier (Fig. 1C). At udspørge disse effekter blev IL6 signalering inhiberet med et anti-IL6 monoklonalt antistof eller, AG490, en småmolekyle-inhibitor af Jak2 kinase, en opstrøms aktivator af Stat3. Disse behandlinger væsentligt reduceret levedygtighed LNCaPs sammenlignet med den uhæmmede co-kultur gruppe i androgen udtømte betingelser (fig. 1C). Noterer sig, at reduktionen i levedygtighed var ikke til niveauet af LNCaPs dyrket alene, vi også testet effekten af ​​AG1024, en IGFR inhibitor. Dette stof også signifikant reduceret levedygtighed LNCaP-celler indirekte co-dyrket med hMSC’er. Disse inhibitorer alene, blev ikke cytotoksisk for cellerne (Fig. S2). Endelig blev ekspressionen af ​​IL6 over tid bekræftet via ELISA fra hMSC’er konditionerede medier med forskellige betingelser (fig. 1d). Især hMSC’er som var blevet præ-opdelte mod en osteogent linage konsekvent havde højere IL6 udtryk. Overvejer LNCaPs fremkalde hMSC’er til at gennemgå osteogen differentiering, kan det være en kilde til forøgelse IL6 ligander niveauer. Derudover blev IGF-1-niveauer målt i konditioneret medium med et ELISA-assay. Ingen tid varierende effekter blev set, blev observeret dog signifikant steady state frigivelse af hMSC’er i forhold til PC3 og LNCaP-celler (fig. 1E).

BM-ECM fremmer overlevelsen af ​​LNCaP celler i androgen udtømte medier og kemoresistens

Udover opløselige parakrine signaler, vi hypotese, at knoglemarv-lignende ECM kan spille en rolle i overlevelsen af ​​androgenafhængige prostatacancerceller. En decellulariseret matrix blev afledt fra ECM-proteiner udskilt af hMSC’er [16]. Efter en uges kultur i androgen berøvet medier var der en signifikant stigning i antallet af levedygtige celler på BM-ECM sammenlignet med celler i androgen depleteret medier på PTP (fig. 2A). Mekanismen for denne virkning blev bekræftet på en anden androgenafhængig cellelinie, nemlig MDA-PCa-2b celler (Fig. 2B). MDA-PCA-2b-celler dyrkes rutinemæssigt på kommercielt tilgængelige ECM at støtte celleadhæsion og vækst. Men dette ECM substrat ikke understøtter vækst af MDA-PCa-2b celler i androgen udtømte betingelser, der angiver effekten er specifik for BM-ECM komponenter eller struktur (fig. 2B). Dernæst undersøgte vi, om BM-ECM kunne give kemoresistens hjælp vækstmedium suppleret med docetaxel. BM-ECM dyrket LNCaP-celler viste en betydelig stigning i celleoverlevelse i sammenligning med PTP-kulturer (fig. 2C). Disse data indikerer, at komponenterne i BM-ECM spiller en rolle i fastlæggelsen af ​​overlevelse som reaktion på androgen deprivation og docetaxel behandling.

BM-ECM ændrer LNCaP morfologi

For at give en bedre forståelse af BM-ECM og LNCaP krydstale, analyserede vi cellemorfologi ved scanningselektronmikroskopi. LNCaPs kunne observeres fastgjort til ECM fibre og matrix (fig. 3A, 3B og 3C). LNCaP celler dyrket i androgen udtømte medier havde en væsentlig stigning i forlængelse som kvantificeret følgende SEM billeddannelse efter 4 dage (fig. 3B). Imidlertid var dette morfologisk ændring forhindres i at forekomme, når cellerne blev dyrket i androgen forarmet medier på BM-ECM. I denne tilstand syntes cellerne til at vokse i klynger resulterer i en betydelig stigning i målt cirkularitet (fig. 3D).

Blokering avp3 integrin grænser tilknytning til BM-ECM

Dernæst forsøgte vi at undersøge den rolle, avp3 integrin kompleks for BM-ECM fastgørelse, fordi dette integrin kompleks har været impliceret i ECM fastgørelse og efterfølgende knoglemarv metastaser [21]. Flowcytometri viste mærkning celleoverfladen for avp3 integrin (fig. 4A). For at bestemme funktionelle betydning blev suspenderede celler inkuberet med en blokerende antistof mod avp3 integrin eller isotypekontrol og cellebinding til BM-ECM blev derefter målt. Et signifikant fald i cellebinding blev målt, hvilket antyder, at avp3 integrin i dette tilfælde spiller en rolle ved mediering fastgørelse til BM-ECM (fig. 4B). Salg

Effekt af BM-ECM på MAPK og PI3K signalveje

for at bestemme den mekanisme mægle svaret fra de LNCaPs til BM-ECM vi undersøgte den relative fosforylering tilstand af 46 proteiner fra flere veje ved hjælp af en omvendt fase protein microarray. Hvornår blev udført hierarkisk clustering analyse, LNCaPs på BM-ECM i androgen udtømte medier klynger mest tæt med LNCaPs i vækstmedier på PTP (fig. 5A). Differential phosphorylering blev derefter vurderet mellem LNCaPs på BM-ECM i androgen forarmet medier og LNCaPs på PTP i androgen forarmet medier, og mange proteiner syntes at være differentielt phosphoryleret (fig. 5B). Men når vi også undersøgt phosphorylering forskelle mellem LNCaPs på PTP i vækstmedier versus androgen forarmet medier adskillige proteiner blev tilsvarende reguleret (fig. 5C).