PLoS ONE: CD147 Expression i Human Gastric Cancer er forbundet med Tumor Gentagelse og Prognosis

Abstrakt

CD147 er korreleret med tumor aggressivitet i forskellige menneskelige maligniteter. Her undersøgte vi CD147 proteinekspression i 223 patienter med mavekræft ved immunhistokemi og analyseret sin tilknytning til sygdomsfri og samlet overlevelse. CD147 blev forøget i gastrisk cancer sammenlignet med normale væv. Desuden blev CD147 udtryk forbundet med mavekræft invasion, metastase og TNM stadie, det ikke var relateret til alder, køn, differentiering status, tumor eller Lauren klassificering. Kaplan-Meier-analyse bekræftede, at CD147 var forbundet med sygdomsfri og samlet overlevelse for patienter med gastrisk cancer; dvs. patienter med positiv CD147 farvning tendens til at have dårligere sygdomsfri og samlet overlevelse. Desuden Cox ‘proportionale farer analyse viste, at CD147 var en uafhængig markør for sygdomsfri og samlet overlevelse for patienter med mavekræft. Disse resultater bekræfter sammenslutning af CD147 med mavekræft invasion og metastase og bevise, at CD147 kan være en indikator for tumor tilbagefald og prognose i mavekræft

Henvisning:. Chu D, Zhu S, Li J, ji G, Wang W, Wu G et al. (2014) CD147 Expression i Human Gastric Cancer er forbundet med Tumor Gentagelse og Prognose. PLoS ONE 9 (6): e101027. doi: 10,1371 /journal.pone.0101027

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: August 30, 2013; Accepteret: Juni 2, 2014, Udgivet: 30 juni 2014

Copyright: © 2014 Chu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.201.927, 81.272.204 og 31.270.812) og Kina Postdoc Science Foundation (nr 2012M521862). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige humane maligniteter verdensplan [1], [2]. De højeste satser for mavekræft er i østlige asiatiske lande. Næsten 42% af mandlige og 19% af de kvindelige mavekræft patienter over hele verden er fundet i Kina, hvor mavekræft er den tredje hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald [3], [4]. Kirurgisk resektion er stadig den vigtigste behandling for mavekræft. Imidlertid har ca. 60% af patienter med gastrisk cancer lokalt fremskreden og metastatisk sygdom på tidspunktet for kirurgi, hvilket resulterer i en relativ lav terapeutisk effektivitet med kirurgisk resektion. Nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix (ECM) er kritisk for gastriske cancerceller at invadere i det omgivende væv. Nylige undersøgelser, som fokuserer på de mekanismer, der ligger gastrisk invasion antyder, at matrixmetalloproteinaser (MMP’er) spiller en kritisk rolle i denne proces [5].

ekstracellulær matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN), også kendt som CD147, er en 57- kilodalton (kDa) transmembrane glycoprotein, der hører til immunoglobulin (IgG) superfamilien [6]. CD147 består af 2 ekstracellulære Ig-domæner, et enkelt transmembrant domæne kræves til counter receptorbindingsaktivitet som er involveret i matrix metalloproteinaser (MMP’er) induktion og en kort cytoplasmatisk domæne, som interagerer med KAV-1 [7], [8]. CD147 er rigeligt udtrykt på den ydre overflade af mange typer af tumorvæv sammenlignet med normalt væv, og det kan lette tumormetastase ved at modulere cellulære substrat og adhæsionsprocesser [9] – [11]. CD147 kan stimulere tilstødende interstitielle normale celler til at producere MMP’er, en gruppe af zink-afhængige proteiner, der kan nedbryde den ekstracellulære matrix (ECM) [12], [13]. Nedbrydning af ECM på både den primære tumorsted og på den sekundære kolonisering site er kritisk for tumorinvasion og metastase [12]. For nylig blev den rolle, CD147 i tumorindtrængen bekræftet i flere humane maligniteter, herunder gastrisk cancer [14] – [16]. Inhibering af CD147 ekspression ved RNA-interferens reduceret tumorcelleinvasion og tumorigenicitet, samt øget kemosensitivitet til paclitaxel [17]. For nogle tumortyper, såsom pulmonal adenocarcinom, seminomer, spytudførselsgang carcinom, prostatacancer, colorektal cancer, blærecancer og brystcancer, har EMMPRIN ekspression blevet forbundet med patientens prognose [18] – [22]. I mavekræft, øges CD147 Udtryk med relation til dårlig samlet overlevelse [23]. Imidlertid har sammenslutningen af ​​CD147 med mavekræft tilbagefald ikke blevet undersøgt.

I denne undersøgelse har vi analyseret ekspression af CD147 i kliniske gastrisk prøver og sin tilknytning til sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse hos patienter efter kirurgi.

Materialer og metoder

Kliniske mavekræft prøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i den fjerde Military Medical University. Alle patienter eller familiemedlemmer involveret forudsat informeret skriftligt samtykke. Kort fortalt blev friske kliniske mavekræft prøver og tilstødende normale væv indsamlet fra 223 patienter, som gennemgik kirurgi mellem januar 2006 og juni 2007 for Xijing Hospital i Digestive Diseases. Ingen af ​​disse patienter fik kemoterapi før kirurgi. Desuden blev normale vævsprøver taget fra 21 patienter, som gennemgik operation for andre end malignitet grunde, svarende til normale kontrolprøver. Den histomorphology af alle vævsprøver blev bekræftet af Patologisk Institut, Xijing Hospital. Prøver blev fikseret i 10% formaldehyd og indlejres i paraffin til histologisk sektionering. Patient klinisk information, såsom alder, køn, differentiering status og TNM fase blev opsamlet og lagret i en database. Opfølgning information for alle deltagere blev opdateret hver 3 måned ved hjælp telefoninterviews og spørgeskemaer. Sygdomsfri overlevelse er defineret som den tid der er gået fra kirurgi til den første forekomst af en af ​​følgende begivenheder: gentagelse af mavekræft; gastrisk cancer fjernmetastase; udvikling af anden ikke-gastrisk malignitet, eksklusive basalcellekarcinomer i huden og carcinoma in situ i cervix; eller død uanset årsag uden dokumentation for en cancer-relateret begivenhed. Diagnosen af ​​tilbagefald og fjernmetastaser var baseret på billeddannende metoder, herunder endoskopi, ultrasonografi, computertomografi, magnetisk resonans og Positronemissionstomografi, og når det er muligt, cytologisk analyse eller biopsi. Samlet overlevelse er defineret som den tid der er gået fra kirurgi til død uanset årsag hos patienter med mavekræft.

Immunohistokemiske assays

Friske vævsprøver blev afparaffiniseret i xylen og dehydreret gennem en gradueret alkohol serie. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 0,5% H

2O

2 i methanol i 10 min. For antigen hentning blev snit microwaved i 0,01 M natriumcitrat (pH 6,0). Ikke-specifik binding blev blokeret ved at inkubere sektionerne med 10% normalt gedeserum i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Uden vask blev disse sektioner inkuberet med muse-anti-humant CD147 monoklonalt antistof (1:200), som er blevet valideret af tidligere undersøgelser, i PBS ved 4 ° C natten over i en fugtig boks [24], [25]. Derefter blev sektionerne inkuberet med biotinyleret kanin-anti-muse-IgG (1:400) i 1 time ved stuetemperatur, og CD147 ekspressionen blev detekteret under anvendelse af et streptavidin-peroxidase-kompleks. Den brune farve, der viser peroxidaseaktivitet blev udviklet ved at inkubere sektionerne med 0,1% 3, 3-diaminobenzidin i PBS indeholdende 0,05% H

2O

2 i 5 minutter ved stuetemperatur. Passende positive og negative kontroller blev udført i hvert forsøg.

Evaluering af farvning

Vævet prøver blev isoleret set af to patologer uden forudgående kendskab til det kliniske eller klinisk-patologisk status af prøverne. Farvningen blev evalueret ved at scanne hele vævsprøve under lav forstørrelse (x 40), efterfulgt af bekræftelse under høj forstørrelse (× 200 og × 400). En immunoreaktivitet score (IRS) system baseret på andelen og intensiteten af ​​positivt farvede kræftceller blev anvendt: A: antal positive farves celle ≤5%, scoret 0; 6% -25%, scorede 1; 26% -50%, scorede to; 51% -75%, scorede 3; 75%, scorede 4. B: intensitet plet: farveløs, scoret 0; lysegul, scorede 1; gul, scorede to; brun, scorede 3. Pointene fra A og B blev ganget, og farvningen klasse blev stratificeret som negativ (-, 0 point), svag (+, 1~4 score), moderat (++, 5~8 score) eller stærk (+++, 9~12 score). En anden patolog, der var blind for undersøgelsen data fortolkes også de farvede objektglas. Prøver blev rescored hvis forskellen i scoren fra de to patologer var mere end 3 [26], [27].

Statistisk analyse

Foreninger mellem CD147 udtryk og kategoriske variabler blev analyseret af Mann Whitney-test eller Kruskal Wallis test, alt efter omstændighederne. Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og forskelle i overlevelse distributioner blev evalueret ved log-rank test. Cox ‘proportionale farer modellering af faktorer potentielt relateret til overlevelse blev udført for at identificere faktorer, der kan have en betydelig indflydelse på overlevelse. Forskelle med ap-værdi på 0,05 eller mindre blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

CD147 farvning i Gastric Cancer

I immunhistokemi analyseresultater, CD147 farvning blev primært lokaliseret i cellen membraner og i cytoplasmaet af gastriske cancerceller. Negativ, svag, moderat og stærk farvning af CD147 evalueret af IRS blev vist i figur 1. farvning mønster af CD147 i gastrisk cancer var i overensstemmelse med tidligere rapporter [28]. Blandt de 223 mavekræft prøver, negativ (-) blev CD147 farvning påvist i 90 prøver blev svagt positiv (+) CD147 farvning påvist i 57 prøver blev moderat positiv (++) CD147 farvning påvist i 44 prøver og stærk positiv (+ ++) CD147-farvning blev påvist i 32 prøver. I modsætning hertil blandt de 223 tilgrænsende normale væv, negativ (-), svagt positive (+) og moderat positiv (++) CD147-farvning blev påvist i 175 prøver, 36 prøver og 12 prøver, hvorimod ingen stærk positiv (++ +) farvning blev detekteret. Forskellen i CD147 ekspressionen mellem mavekræft og tilstødende normale væv var statistisk signifikant (

P

0,001)., Indikerer, at CD147 ekspression er forøget i gastrisk cancer sammenlignet med normale tilstødende væv

A negativ farvning (-) af CD147 i gastrisk cancer; B Svag positiv farvning (+) af CD147 i gastrisk cancer; C Moderat positiv farvning (++) af CD147 i gastrisk cancer; D Stærk positiv farvning (+++) af CD147 i mavekræft.

Foreningen af ​​CD147 Farvning med klinisk-patologisk Karakteristik

Baseret på IRS snesevis af immunhistokemisk farvning, vi yderligere analyseret forholdet mellem CD147-farvning og klinisk-patologiske karakteristika af patienter med gastrisk cancer (tabel 1). CD147 farvning blev associeret med gastrisk invasion kræft, som stærkere positiv farvning af CD147 blev oftere fundet i T3 og T4 tumorer i forhold til T1 og T2 tumorer (

P =

0,035). Endvidere blev CD147-farvning forbundet med lymfeknudemetastaser og fjernmetastaser, som stærkere positiv farvning var mere tilbøjelige til at blive detekteret i tumorer med lymfeknudemetastaser (

P

0,001) eller fjernmetastaser (

P

0,001). CD147 farvning blev tæt forbundet med TNM stadium af mavekræft, som farvning var progressivt kraftigere fra lønklasse I til lønklasse IV tumorer (

P

0,001, tabel 1). Imidlertid blev CD147 farvning ikke er relateret til patientens køn, alder, tumor differentiering, tumor eller Lauren klassificering (tabel 1). Disse resultater indikerer, at CD147 farvning er relateret til mavekræft invasion og metastase.

Forholdet mellem CD147 Expression og sygdomsfri overlevelse

Da CD147 farvning var relateret til mavekræft invasion og metastase vi yderligere analyseret sin tilknytning til sygdomsfri overlevelse, som hovedsageligt bestemt af omfanget af invasion og metastase. Under opfølgningsperioden, 129 af de 223 patienter med mavekræft præsenterede begivenheder. Medianen sygdomsfri overlevelse tid for alle patienter var 41,8 måneder (95% CI: 36.2-47.4 måneder). Da der var et relativt lille antal af prøver i den stærke positive CD147 farvning gruppe på grund af lille prøvestørrelse, vi kombineret stærk, moderat og svag positiv CD147 farvning i en enkelt gruppe, defineret som den positive CD147-farvning (+) gruppe. Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til at evaluere sygdomsfri overlevelse af patienter med gastrisk cancer i forhold til CD147 ekspression. Vores resultater viser, at patienter med CD147 positive tumorer haft værre sygdomsfri overlevelse sammenlignet med patienter med CD147 negative tumorer (figur 2A, log-rank test:

P

= 0,008). Den postoperative median sygdomsfri overlevelse tid af patienter med positiv CD147 farvning var 34,4 måneder (95% CI: 27.3-47.5), mens den for patienter med negativ CD147 farvning var 48,9 måneder (95% CI: 35,2-62,6). Yderligere analyse om sygdomsfri overlevelse i undergrupper af positive CD147 farvning tumorer viste, at overlevelsesraten blev reduceret fra svagt positive (+), moderat positive (++) til stærk positiv (+++) CD147 farvning gruppe (figur 2B, log -rank test:

P

0,001). Når den ujusterede hazard ratio (HR) blev sat til 1,0 (som reference) i CD147 negative (-) farvning gruppe, patienter med CD147 positiv mavekræft havde en 1,63 gange højere risiko for tilbagefald sammenlignet med dem med CD147 negativ gastrisk kræft (95 % CI: 1,13-2,36;

P

= 0,009). Med hensyn til klinisk-patologiske karakteristika, tumor invasion status (log-rank test:

P

= 0,016), lymfeknude metastaser (log-rank test:

P

0,001) og TNM stadie (log- rank test:

P

0,001) blev også forbundet med sygdomsfri overlevelse for patienter med mavekræft. Patienter med mavekræft viser dyb invasion, lymfeknude metastaser eller avancerede TNM stadie haft værre sygdomsfri overlevelse og en højere risiko for recidiv end dem uden. Imidlertid køn, alder, tumor placering, differentiering status eller Lauren klassifikation havde nogen prognostisk værdi på sygdomsfri overlevelse af patienter med gastrisk cancer. Den justerede HR fremgår af tabel 2.

En Kaplan-Meier postoperativ overlevelse analyse på sygdomsfri overlevelse af primære gastrisk patienter (n = 223) med positiv CD147 farvning (n = 133) og negative CD147-farvning ( n = 90). Det sygdomsfri overlevelse for patienter i negativ CD147 farvning gruppe var signifikant bedre end for patienter i positiv farvning gruppe (log rank test:

P

= 0,008); B Kaplan-Meier postoperativ overlevelse analyse på sygdomsfri overlevelse af primære gastrisk patienter med positiv CD147 farvning (n = 133). Det sygdomsfri overlevelse sats blev reduceret fra svagt positive (+, n = 57), moderat positive (++, n = 44) til stærk positiv (+++, n = 32) CD147 farvning gruppe (log-rank test:

P

. 0,001)

i multivariat analyse blev Cox proportional hazards model justeret for køn, alder og TNM stadie, og CD147 ekspressionen blev en uafhængig prognostisk faktor sygdomsfri overlevelse af patienter med gastrisk cancer. Den justerede HR var 1,00 (som reference), og 1,51 i CD147 negative og positive patienter henholdsvis (95% CI: 1,05-2,16;

P

= 0,026, tabel 2). Således kunne CD147 ekspressionen i gastrisk cancer være en uafhængig prædiktor for sygdomsfri overlevelse for patienter, hvilket indikerer, at patienter med positiv CD147 farvning har en højere risiko for recidiv end dem med negativ farvning. Desuden TNM etape var også en prognostisk faktor for sygdomsfri overlevelse i multivariat analyse. (Tabel 2)

Forholdet mellem CD147 Expression og samlet overlevelse

Da CD147 farvning var relateret til sygdomsfri overlevelse for mavekræft, vi yderligere analyseret sin tilknytning til den samlede overlevelse. Den mediane samlede overlevelse tid for alle patienter var 58,0 måneder (95% CI: 46.7-69.3 måneder). Kaplan-Meier analyse blev anvendt til at vurdere den samlede overlevelse af patienter med mavekræft viser, at patienter med CD147 positive tumorer haft værre samlet overlevelse sammenlignet med patienter med CD147 negative tumorer (figur 3A, log-rank test:

P

= 0,003). Den postoperative overlevelse tid af patienter med positiv CD147 farvning var 45,0 måneder (95% CI: 32.5-57.5), mens den for patienter med negativ CD147 farvning ikke kunne estimeres på grund af bedre samlet overlevelse. Undergruppe analyse på samlet overlevelse viste, at overlevelsesraten blev reduceret fra svagt positive (+), moderat positive (++) til stærk positiv (+++) CD147 farvning gruppe (figur 3B, log-rank test:

P

0,001). Patienter med CD147 positiv mavekræft havde en 1,79 gange højere risiko for at dø sammenlignet med dem med CD147 negativ mavekræft. (95% CI: 1,20-2,67;

P

= 0,004, tabel 3)

En Kaplan-Meier postoperativ overlevelse analyse på samlet overlevelse af primære gastrisk patienter (n = 223) med positiv CD147 farvning (n = 133) og negative CD147 farvning (n = 90). Den samlede overlevelse for patienter i negativ CD147 farvning gruppe var signifikant bedre end for patienter i positiv farvning gruppe (log rank test:

P

= 0,003); B Kaplan-Meier postoperativ overlevelse analyse på samlet overlevelse af primære gastrisk patienter med positiv CD147 farvning (n = 133). Den samlede overlevelsesrate blev reduceret fra svagt positive (+, n = 57), moderat positive (++, n = 44) til stærk positiv (+++, n = 32) CD147 farvning gruppe (log-rank test:

P

. 0,001)

i multivariat analyse blev Cox proportional hazards model justeret for køn, alder og TNM stadie, og CD147 ekspressionen var en uafhængig prognostisk faktor samlet overlevelse af patienter med gastrisk cancer. Den justerede HR var 1,59 i CD147 positive patienter (95% CI: 1,05-2,40;

P

= 0,028, tabel 3). Således kunne CD147 ekspressionen i gastrisk cancer være en uafhængig prædiktor for samlet overlevelse for patienter, hvilket indikerer, at patienter med positiv CD147 farvning har en højere risiko for at dø.

Diskussion

Tumor gentagelse er en stor trussel for patienter med gastrisk cancer i hele verden. Selv for trin I mavekræft, ca. 5% til 30% af patienterne udvikler tilbagevendende sygdom og til sidst dø af metastatisk sygdom. Således kontrollerende tumortilbagevenden er en af ​​de mest effektive strategier til forbedring prognose i gastrisk management cancer. Kemoterapi reducerer tumor tilbagefald og forøger levetiden af ​​patienter med gastrisk cancer. Men ud over sine terapeutiske virkninger i tumorceller, kemoterapi vil uundgåeligt resultere i signifikante kliniske toksicitet og bivirkninger i normale organer og væv. Således at administrere den mest effektive behandling og minimere bivirkninger, der er et presserende behov for mere følsomme markører for at forudsige tumor tilbagefald og prognose.

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi CD147 proteinekspression i 223 tilfælde af klinisk gastrisk cancer og dets associering med sygdomsfri overlevelse. CD147-protein-ekspression blev øget i gastrisk cancer væv sammenlignet med tilstødende normale væv, og stærkere positiv farvning af CD147 blev hyppigere detekteret i gastrisk cancer med dyb invasion, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser og avanceret TNM stadium, som var stemmer overens med tidligere undersøgelser på forholdet mellem CD147 og human mavekræft [23]. Imidlertid blev CD147 ekspressionen ikke korreleret med alder, køn, differentiering status, tumor eller Lauren klassificering. Nylige undersøgelser antydet, at RNAi-medieret nedregulering af CD147 nedsat celleproliferation, MMP-2 og MMP-9-aktivitet og den invasive potentiale SGC7901 celler, som understøtter vores resultater, som viser associering CD147 med gastrisk cancer invasion og metastase [16] . Taget sammen antyder disse data, at CD147 kan være involveret i gastrisk cancer progression.

Fordi CD147 er forbundet med gastrisk cancer invasion og metastase, hvilket kan bestemme tumortilbagevenden, vi yderligere analyseret sin association med sygdomsfri og samlet overlevelse. Kaplan-Meier-analyse afslørede væsentligt værre sygdomsfri og samlet overlevelse for patienter med CD147-positive tumorer, hvilket indikerer, at CD147-protein niveau er en markør for tilbagefald og prognose for patienter med gastrisk cancer. Cox proportionel risiko model justeret for alder, køn og TNM stadie viste samme tendens som Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, bekræfter CD147 udtryk som en markør for dårlig sygdomsfri og samlet overlevelse, uafhængigt af kendte kliniske prognostiske indikatorer såsom TNM stadie. Langvarig sygdomsfri overlevelse i CD147 negativ farvning gruppe foreslog, at CD147 kan være en potentiel prædiktiv markør for tidlig recidiv eller metastaser i gastrisk kræft. Og samlet overlevelse er et væsentligt klinisk måling for at evaluere risiko for patienterne. Derfor CD147 kan være en værdifuld klinisk indikator for at vurdere risikoen for patienter med mavekræft.

Foreningen af ​​CD147 med mavekræft invasion, metastaser og tilbagefald kan i det mindste være delvist skyldes dens virkning på MMP’er, som MMP’er tillader celler til aktivt omforme den ekstracellulære matrix. CD147 er kendt for at fremme tumorinvasion og metastase via stimulering MMP-syntese i tilstødende fibroblaster [8]. I dette perspektiv, CD147 stimulerer produktionen af ​​MMP, som kan forringe ECM og lette tumor celle invasion og metastase; således, fremme tumor tilbagefald. Nylige undersøgelser viste også, at EMMPRIN ikke kun inducerer forskellige MMP’er men også regulerer parametre for urokinase plasminogen aktivator (uPA), og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) [29], [30].

Afslutningsvis CD147 ekspression blev øget i kliniske gastrisk cancer prøver, og det blev forbundet med tumorinvasion og metastase. Vores undersøgelse giver også den første bevis på, at CD147 er en uafhængig prognostisk faktor både sygdomsfri og samlet overlevelse for patienter med gastrisk cancer. Disse resultater tyder også på, at CD147 kan være en potentiel prædiktiv markør for tumor tilbagefald og prognose for patienter med mavekræft.