PLoS ONE: Kontrol af Etableret Colon Cancer Xenografter Ved hjælp af en Novel humaniseret enkeltkædet antistof-streptokok superantigen Fusion Protein Målretning af 5T4 onkoføtalt Antigen

Abstrakt

Superantigener (afskalninger) er mikrobielle toksiner, cross-link T-cellereceptorer med major histocompatibility class II (MHC-II) molekyler, der fører til aktivering af et stort antal T-celler. Heri beskriver vi udviklingen og præklinisk afprøvning af et hidtil ukendt tumor-målrettede SAG (TTS) terapeutiske bygget ved hjælp af streptokok-pyrogent exotoksin C (SPEC) SAG og målretning cancerceller, der udtrykker 5T4 tumor-associeret antigen (TAA). Til hæmning potentielt skadelig udbredt aktivering af immunceller, en spec mutation i den høje affinitet MHC-II-bindende grænseflade blev genereret (Spec

D203A), der demonstrerede en markant reduktion i mitogen aktivitet, men denne mutant kunne stadig inducere immun cellemedieret kræft celledød

in vitro

. For at målrette 5T4

+ kræftceller, vi manipuleret et humaniseret enkelt kæde variable fragment (scFv) antistof til at genkende 5T4 (scFv5T4). Specifik målretning af scFv5T4 blev verificeret. Spec

D203A fusioneret til scFv5T4 fastholdt evnen til at aktivere og forsøgt immun cellemedieret cytotoksicitet kolorektal cancer celler. Ved hjælp af en xenograftmodel af etableret human tyktarmskræft, viste vi, at Spec-baserede TTS var i stand til at kontrollere væksten og spredningen af ​​store tumorer

in vivo

. Dette krævede både TAA målretning af scFv5T4 og funktionel SAg aktivitet. Disse undersøgelser lægge fundamentet for udvikling af streptokok afskalninger som ‘næste generation’ TTS’er for kræft immunterapi

Henvisning:. Patterson KG, Dixon Pittaro JL, Bastedo PS, Hess DA, Haeryfar SMM, McCormick JK (2014 ) Kontrol af Etableret Colon Cancer Xenografter Ved hjælp af en Novel humaniseret enkeltkædet antistof-streptokok superantigen Fusion Protein Målretning af 5T4 onkoføtalt Antigen. PLoS ONE 9 (4): e95200. doi: 10,1371 /journal.pone.0095200

Redaktør: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus Technical University-Dresden, Tyskland

Modtaget: Februar 3, 2014 Accepteret: 25 marts 2014; Udgivet 15. april, 2014

Copyright: © 2014 Patterson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af canadiske Institutes of Health Research (CIHR) driftstilskud til JKM (MOP-64.176). SMMH har en Canada Research Chair i Viral Immunitet og Patogenese og JKM var modtageren af ​​en ny Investigator Award fra CIHR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Superantigener (afskalninger) er mikrobielle toksiner, der fungerer som potente T-celle-aktivatorer og er mediatorer for det toksiske shock-syndrom [1]. Disse molekyler fungerer ved at binde til sideflader major histocompatibility class II (MHC-II) -molekyler [2] – [5], samtidig indgreb kimcellelinje-kodet regioner inden den variable region af T-cellereceptoren (TCR) β-kæde ( Vp) [6] – [9]. Da der er -50 funktionelle Vp gener i mennesker [10], [11], og fordi forskellige sags ofte kan målrette flere Vβs [12], disse toksiner stimulerer en meget stor procentdel af eksponerede T-celler, der fører til den efterfølgende frigivelse af pro- inflammatoriske cytokiner (fx IL-2, IFN-γ, og TNF-α) [1]. Selvom sags ikke udøver MHC I-molekyler, er disse toksiner aktivere både CD4

+ og CD8

+ T-celler [13], og det kan efterfølgende medføre bystander aktivering af accessoriske celler, herunder NK-celler [14]. I særlige tilfælde kan SAg også aktivere utraditionelle T-celle delmængder såsom invariant natural killer T (

jeg

NKT-celler) [15] og γδ T-celler [16].

Det ultimative mål for cancer immunterapi er at udnytte immunmedierede mekanismer til specifikt målrettet og udrydde tumorceller. Der har været en betydelig indsats for at designe SAg-baserede immunotoksiner, også kendt som tumor-målrettede superantigener (TTS), med henblik på at kunstigt ‘tvinge’ T-celler til at genkende tumor-associerede antigener (TAA’er) i en ikke-HLA-begrænset måde. De første TTS repræsenterede fusionen af ​​et muse-antistof-fragment (Fab) rettet mod en kolorektal cancer antigen, til vildtype-stafylokok-enterotoksin A (SEA) SAg. I dette pionerarbejde, Fab :: SEA TTS demonstrerede en væsentlig reduktion i tumorbyrde og mortalitet under anvendelse af en B16 mus metastase-model [17]. Senere studier udnyttede fusionen af ​​et muse Fab at målrette 5T4 onkoføtalt antigen med en muteret version af SEA (designet til at reducere MHC-II-bindende), og dette resulterede i ~ 95% reduktion af tumormasse i en ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC) model [18]. Desuden har kombinationsterapier med TTS’er også vist sig lovende i prækliniske modeller sammenholdt med cytokin terapier (fx IFN-a) [19] og blokade af CTLA-4 [20]. Disse og andre undersøgelser har klart vist potentialet i TTS’er for kræft immunterapi. Ikke desto mindre har de TTS’er hidtil blevet bygget udelukkende af medlemmer i SE klasse af SAg, og SES er også agenter for stafylokok fødevarebåren sygdom, en aktivitet, som menes at være uafhængig af evnen til at aktivere T-celler [21]. Selvom håndterbar, nogle af de bivirkninger, der ses i TTS fase I og kliniske fase II studier omfattede kvalme, opkastning og diarré [22] – [24], og kan have været relateret til de emetiske egenskaber SEA [25]. Derudover er der mange patienter havde allerede eksisterende antistoffer til SEA, der krævede individualiseret TTS dosering [26]. For at reducere antigenicitet TTS terapeutisk, blev anti-5T4 Fab bundet til en manipuleret SEA /SE fusion (kaldet Naptumomab estafenatox; ABR-217.620) [27]. Denne seneste TTS terapeutisk har gennemgået en fase I klinisk forsøg som monoterapi hos patienter med fremskreden NSCLC, bugspytkirtelkræft og renalcellecarcinom (RCC), og som en kombinationsbehandling med Docetaxel hos patienter med NSCLC, der viser, at ABR-217.620 var veltolereret med nogle beviser for antitumoraktivitet [24]. Tidlig information fra et nyligt afsluttet fase II /III-studie med ABR-217.620 patienter med RCC sammenligne ABR-217.620 og interferon-α, at interferon-α alene, ikke nåede det primære endepunkt samlet overlevelse; Men det viser sig, at mange patienter havde højere end forventet baseline niveauer af anti-SEA /SEE antistoffer, som kan have bidraget til suboptimal behandling [28].

Bakterielle genomiske sekventering indsats i det seneste årti har nu afsløret en omfattende ‘familie’ af Sag exotoksiner i både

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

. Et generelt træk ved disse toksiner er, at genetisk forskellige afskalninger er også antigent forskellige, og desuden, distinkte sags også typisk vise unikke Vp aktivering profiler [12]. Således

S. aureus

S. pyogenes

har givet en overflod af T-celle mitogener, der potentielt kan manipuleret som TTS’er for kræftbehandling. I den nuværende arbejde, vi søgte at udvide repertoiret af TTS’er at føje den første streptokok SAg hjælp streptokok-pyrogent exotoksin C (SPEC) som prototypen. En potentiel fordel ved engineering en streptokok SAg som TTS er, at disse giftstoffer mangler bona fide opkastningsaktivitet [29], hvilket kan resultere i færre bivirkninger. Også Spec er meget godt undersøgt, både hvad angår struktur [4], [30], [31] og funktion [9], [32] – [35] for engagement af host-receptorer, hvilket giver en platform for at skræddersy aktivitet. Heri, viser vi, at SPEC mutageniseret i zink-afhængige, høj affinitet MHC-II-bindende domæne (Spec

D203A) reduceret superantigenicitet samtidig bevare tumordræbende egenskaber. Vi genererede en Spec

D203A-baserede TTS fusionsprotein ved hjælp af en manipuleret humant scFv, der specifikt er rettet mod human 5T4 (scFv5T4). I et humaniseret musemodel for tyktarmskræft, viser vi, at det scFv5T4 :: Spec

D203A TTS styrer vækst og metastatiske potentiale af en fastlagt tyktarmskræft tumor, og at denne antitumoraktivitet kræver både specifik målretning af scFv5T4 delen samt SAg funktion.

Materialer og Metoder

Etik udsagn

Forsøg med primære humane lymfocytter blev gennemgået og godkendt af Western University Research Ethics Board for Health Sciences Research Inddragelse mennesker. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle bloddonorer. Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care Guide til Pleje og anvendelsen af ​​forsøgsdyr, og protokollen blev godkendt af Animal Brug underudvalget ved Western University (London, Ontario).

Antistoffer og farvestoffer

følgende monoklonale antistoffer og farvestoffer blev anvendt: PE anti-human CD4 (klon RPA-T4, BD Pharmingen); AlexaFluor700 anti-human CD8 (klon RPA-T8, BD Pharmingen); APC anti-human CD3 (klon UCHT1; BD Pharmingen); CellTrace CFSE (carboxyfluorescein diacetat, Molecular Probes); 7-AAD (7-aminoactinomycin D Molecular Probes); anti-human 5T4 (ab88091; Abcam); IgG2b isotype (eBioscience); FITC anti-mus IgG (eBioscience); strepativdin-IRDye800 (Rockland Immunochemicals); streptavidin-FITC (Rockland Immunochemicals).

Bakteriestammer

Escherichia coli

XL1-Blå (Stratagene) eller DH5a (Invitrogen) blev anvendt til kloning formål og

E. coli

BL21 (DE3) (Novagen) blev anvendt som proteinet ekspressionsværten.

E. coli

stammer blev dyrket aerobt ved 37 ° C i Luria-bouillon (LB) indeholdende kanamycin (50 ug /ml), ampicillin (200 ug /ml) eller chloramphenicol (10 pg /ml) for at opretholde plasmider.

Kloning procedurer

plasmidkonstruktioner blev enten tidligere publiceret [34], [35] eller genereret af standard kloningsteknikker [36], i enten pET-41a (Novagen) eller pET-32a (Novagen), og er opsummeret i tabel S1. Alle plasmid inserter blev sekventeret ved Robarts Research Institute Sequencing Facility (London, Ontario, Canada). Proteinekspression kloner i pET-32a eller PET-41a blev ændret således, at enterokinasespaltningsstedet (DDDDK ↓ X) blev erstattet med en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltningssted (ENLYFQ ↓ S). Transfektion vektorer pCMV6-XL5, pCMV6-XL5 :: 5T4 og pEGFP-N1 blev købt fra Origene Technologies og Clonetech Laboratories, hhv. Alle andre transfektions- plasmider blev dannet ved standard kloningsteknikker. Det murine scFv5T4 cDNA [37] blev recoded og derefter fremstillet af genscript Inc. at generere et humaniseret sekvens. Aminosyresubstitutioner blev foretaget i skelettet sekvensen af ​​scFv5T4 fra den oprindelige muse scFv-sekvens, bestemt ved en tilpasning til en human konsensussekvens. CDR loops specifikt for 5T4 [37], og de umiddelbare aminosyrer flankerer de forudsagte sløjfer ændredes ikke at opretholde antistofspecificitet.

Proteinekspression

Rekombinante proteiner blev produceret under anvendelse af en

E. coli

BL21 (DE3) ekspressionssystem indeholdende pBirACm plasmid. Celler blev dyrket aerobt ved 37 ° C i LB-medium til OD

600 = 0,5 og proteinekspression blev induceret natten over (18-24 timer) ved stuetemperatur (RT) med 0,2 mM isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG; BioBasic Inc .) og biotinyleret med tilsætningen af ​​50 pM D-biotin (BioBasic Inc.). Cellerne blev pelleteret ved 4 ° C og resuspenderet i kold 20mM Tris-HCI, pH 7,4, 200 mM NaCl indeholdende 0,25 mg /ml lysozym (Sigma-Aldrich) og 0,02 mg /ml DNase I (Sigma-Aldrich). Celler blev inkuberet på is i 1 time inden lyse med en kontinuerlig hoved flowcelle disruptor (Constant Systems Ltd.) ved 25 psi, efterfulgt af lydbehandling med udgang 4, 1 puls /ml. Cellerester blev pelleteret ved 4 ° C ved 10000 x g. Supernatanter blev påført på en ladet Ni-NTA affinitetssøjle (Novagen) og stigende koncentration af imidazol blev anvendt til at eluere det oprensede protein. Oprensede fraktioner blev dialyseret 3 × mod 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 200 mM NaCl puffer og de N-terminale tags blev spaltet ved autoinactivation-resistente His

7 :: TEV [38], som beskrevet [39]. Spaltede proteiner blev anvendt og elueret fra en anden Ni-NTA affinitetssøjle for at fjerne TEV-protease og opnå et rent protein. Proteiner blev dialyseret 3 × mod 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 200 mM NaCl buffer eller 0,9% NaCl (saltvand) og vurderet for homogenitet ved SDS-PAGE og kvantificeret (BCA Protein Assay, Pierce).

cellelinier

Humane colorektale adenocarcinom cellelinjer (HT-29 og WiDr) blev dyrket i komplette Dulbeccos modificerede Eagle-medium (cDMEM; Gibco) og HEK293-celler blev dyrket i komplet Minimum Essential Media (cMEM; Gibco). Alle dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco), 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 100 uM ikke- essentielle aminosyrer (Gibco), 100 pg /ml streptomycin (Gibco), og 100 U /ml penicillin (Gibco).

scFv5T4 specificitet assays

HEK293 celler (1 x 10

5) blev podet i plader med 24 brønde (Corning) med 500 pi cMEM og lodes vokse natten over (24 timer) ved 37 ° C med 5% CO

2. Liposome:DNA komplekser blev dannet under anvendelse lipofectamin 2000 (Invitrogen) og plasmid-DNA af valg som pr fremstilling protokol. Komplekser blev dannet i cMEM uden FBS eller antibiotika. Transfektion af celler skete i de samme medier i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO

2, hvorefter mediet blev fjernet og erstattet med cMEM for plasmid ekspression i 24 timer. Når udtrykt, scFv5T4 :: mRFP1 (1:100; 2 mg /ml) blev inkuberet med cellerne i 1 time ved stuetemperatur og efterfølgende vasket og ses med fluorescens mikroskopi under anvendelse af et Olympus IX71 fluorescerende mikroskop. Alternativt transficerede HEK293-celler (som ovenfor) eller HT-29-celler (1,0 x 10

6) blev inkuberet i 1 time med mAb5T4 (1:200) eller scFv5T4-biotin (1:100; 2 mg /ml), efterfulgt af anti-muse-IgG-FITC (1:1000) eller streptavidin-FITC (1:1000) henholdsvis i 1 time ved 4 ° C og set med fluorescensmikroskopi eller FACS (BD FACSCanto II) hhv. Mikroskopi billeder blev taget med ImagePro Plus Software, og FACS-analyse blev gennemført med Flowjo Software.

Proliferationsassay

Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev fremstillet af hele blod fra raske donorer og isoleret ved densitetscentrifugering over Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences). Humane lymfocytter blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) med 10% FBS og suppleret som ovenfor (cRPMI). Alle vævskulturceller blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2. Humane PBMC’er blev mærket med CellTrace CFSE (Molecular Probes) i henhold til producentens anvisninger. Celler (0,8 x 10

6-1,0 × 10

6) blev dyrket i cRPMI indeholdende 2 pg /ml polymyxin B (ICN Biomedicals Inc.) og behandlet med enten vildtype-Spec (Spec

WT) eller varianter spec

Y15A, spec

D203A eller spec

Y15A /D203A (1 pg /ml) og inkuberes i 5 dage ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev derefter vasket og farvet med anti-human CD3 (1:200), anti-humant CD4 (1:200) og anti-humane CD8 (1:200) antistoffer i 30 minutter på is og analyseret ved FACS (BD Canto II ) ved anvendelse FlowJo software. For radioaktive proliferationsassays, menneskelige PBMC’er (2,0 × 10

5) blev dyrket i cRPMI indeholdende 2 pg /ml polymyxin B (ICN Biomedicals Inc.) med titrering Spec varianter, scFv5T4, scFv5T4 :: Spec

D203A eller scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A i U-bund 96-brønds mikrotiterplader (BD Biosciences). Celler blev inkuberet i 72 timer og efterfølgende mærket med

3H-thymidin (Perkin Elmer Inc.) i 18 timer ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev høstet på glasfiberfiltre og DNA-inkorporeret

3H-thymidin blev målt i en beta-scintillationstæller (Wallac 1450 Microbeta Counter).

Cytotoksicitetsassays

To assays blev anvendt at måle evnen af ​​forskellige proteiner til at inducere PBMC-medieret drab af cancerceller. Først

in vitro

drab blev evalueret ved co-dyrkning menneskelige PBMC’er med enten WiDr celler eller HT-29 i forholdet 10:01 og titrering afskalninger herunder Spec

WT, Spec

Y15A, spec

D203A eller spec

Y15A /D203A i 48 timer. Celler blev mærket med 7-AAD efter producentens protokol og analyseret ved FACS (BD Canto II). Brug af FlowJo softwaren, WiDr eller HT-29 populationer blev gated på ved sammenligning af humane alene PBMC prøver og efterfølgende vurderet for tilstedeværelsen eller fraværet af 7-AAD. For det andet blev humane PBMC’er behandlet med SAg, scFv5T4 eller fusionsproteiner som i FACS-assay i 48 timer i en U-bundet mikrotiterplade (BD Biosciences). Target HT-29-celler blev mærket med (Na)

2

51CrO

4 (Perkin Elmer Inc.) i cRPMI. PBMC’er blev tilsat ved effector:target celle forhold mellem enten 01:01, 05:01 eller 10:01 mod HT-29. Cytotoksicitet blev målt efter 4-6 timers inkubation ved 37 ° C med 5% CO

2 i et standard chromfrigivelsesassay måle

51Cr indhold af kultursupernatanter under anvendelse af en gamma-tæller (Wallac Wizard 1470 Automatisk Counter). kontrol totale frigivelse blev opnået ved at eksponere targetceller til 1% natriumdodecylsulfat (EMD Millipore). Den specifikke lyse blev beregnet efter formlen:

Evaluering af tumor byrde og metastaser

immundefekte NOD.Cg-Prkdc

scid Il2rgt

m1Wjl /SzJ (NSG) mus opdrættet i et dyr barriere facilitet, og opstaldet under sterile betingelser med foder og vand ad libitum. Baseret på en tidligere udviklet protokol [18], [40], 13 uger gamle mus blev injiceret intraperitonealt med 3 × 10

6 HT-29-celler i 0,2 ml vehikel (PBS). Tre uger senere, efter tumorer var palpable, blev musene injiceret intraperitonealt med enten vehikel alene (n = 3) eller 1 x 10

6 humane PBMC’er i 0,2 ml vehikel (n = 20). PBMC-behandlede mus blev grupperet (n = 4) med et tilfældigt tal generator til at modtage enten scFv5T4 :: Spec

D203A, eller kontrollerer Spec

D203A, scFv5T4, scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A, eller vehikel alene. To timer efter modtagelse af PBMC’er blev 2 uM /kg behandling, kontrol eller vehikel alene injiceret intravenøst. Mus uden PBMC’er modtog bærer alene. Intravenøs behandling injektioner blev givet dagligt i 7 ekstra dage. Efter 4 uger blev musene aflivet, og det samlede tumorvolumen blev bestemt. Musene blev også undersøgt visuelt for makro-metastaser og scorede derfor baseret på graden af ​​regional spredning fjernt fra den primære tumor. Alle tumorer blev fjernet, størrelse-og vægt-målt i en blindet måde.

Statistisk analyse

Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en uparret Student

t

test eller ved 2- ANOVA med Bonferroni multiple sammenligning test (GraphPad Prism). Forskelle blev betragtet som signifikante, når p. 0,05

Resultater

Generering af en spec-baserede TTS

spec er en potent og godt karakteriseret streptokok SAg kendt for at målrette primært Vβ2

+ humane T-celler [32], som udgør ca. 7% af de ca. 25 millioner forskellige TCR’er [41]. Tidligere arbejde indikerer, at Tyr

15 er en kritisk rest for denne SAg at engagere TCR [34], og Asp

203 er nødvendigt at koordinere en zink-medieret høj affinitet grænseflade med β-kæden af MHC-II [4], [35], [42] (figur 1A). Faktisk enkelt Asp

203 → Ala mutation i spec har vist sig at dramatisk reducere toksicitet i en dødelig model af toksisk chok syndrom [42]. Vi først evalueret evne vildtype Spec (Spec

WT), Spec

Y15A, Spec

D203A, og Spec

Y15A /D203A at aktivere de menneskelige PBMC’er og fremkalde PBMC-medieret drab af kræft celler. Både Spec

Y15A og Spec

D203A værdiforringet for evnen til at udvide PBMC’er ved -100 gange sammenlignet med Spec

WT, og spec

Y15A /D203A dobbelt mutant ikke var i stand til at fremkalde PBMC proliferation (figur 1B). Dernæst blev PBMC-afhængig drab af den humane kolorektal cancer cellelinje WiDr evalueret. Spec

Y15A forårsagede en signifikant reduktion i WiDr cytotoksicitet sammenlignet med Spec

WT, og begge spec

D203A og Spec

Y15A /D203A mutanter undladt at fremkalde WiDr cytotoksicitet (figur 1C). Vi vurderede også evnen af ​​de rekombinante proteiner til specifikt at inducere proliferation af humane CD3

+ CD4

+ og CD3

+ CD8

+ T-cellepopulationer på 1 ug /ml. SPEC

WT og hver af de enkelte mutanter var i stand til at inducere proliferation af begge delmængder, mens den dobbelte mutant inducerede ikke proliferation af enten delmængde (figur 1D og 1E). Disse data indikerer, at TCR og MHC-II engagement er vigtige for induktion af immun cellemedieret drab af Spec

WT, og at Spec

D203A kan være en egnet mutant at reducere eller forebygge systemisk aktivering af immunceller og samtidig opretholde fuld engagement med TCR.

A) Strukturel overblik over spec i kompleks med TCR og MHC-II. TCR Va-kæde er farvet orange, er TCR Vp-kæde farvet grå, er MHCα-chains farvet rød, er MHCβ-chains farvet grøn, er antigene peptider farvet sort, og zink atom er farvet magenta. SPEC er farvet blå med vigtige interface-rester Y15 og D203 fremhævet med gult. Den ternære model af TCR-spek- (MHC)

2 blev produceret som tidligere [9] og bånddiagram blev genereret ved hjælp PyMOL (https://www.pymol.org) beskrevet. B) Proliferation af humane PBMC’er medieret af Spec

WT eller proteiner indeholdende muterede rester Y15A (TCR-bindende mutant), D203A (MHC-II-bindende mutant) eller Y15A /D203A blev bestemt ved optagelsen af ​​

3H- thymidin efter 72 timer efter stimulering (n = 5 i tre eksemplarer, data, der repræsenterer et individ). C) Dosis-cytotoksicitet af 7-AAD

+ WiDr celler efter 48 timers inkubation med menneskelige PBMC’er og enten Spec

WT, Spec

Y15A, Spec

D203A eller Spec

Y15A /D203A (n = 3-6 pr gruppe). (D-E) Proliferation af CFSE mærket-humane PBMC’er medieret af Spec

WT eller proteiner indeholdende muterede rester blev bestemt ved FACS fem dage efter stimulering, specifikt måling af total CD3

+ T-celle population, CD3

+ CD4

+ T-celler og, CD3

+ CD8

+ T-celler (n = 4; FACS data repræsentant for en individuel).

Udviklet menneskelig scFv5T4 specifikt retter sig mod 5T4 tumor-associeret antigen

for at udvikle en særlig mekanisme for sÃ

D203A, genereret vi et humaniseret scFv baseret på komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) af karakteriseret musen scFv specifik for den menneskelige 5T4 målretning TAA [37]. CDNA-sekvensen er designet til at inkorporere en “humaniseret” rygrad sekvens, med CDR’erne resterende specifikt for human 5T4. Aminosyresubstitutioner blev bestemt ved at tilpasse den tidligere beskrevne muse scFv5T4 med 10 humane scFv-sekvenser generering af en konsensussekvens. Denne cDNA-sekvens blev kodon optimeret til

E. coli

og syntetiseret, og blev efterfølgende anvendt til generering af en række af rekombinante proteiner (tabel S1).

For at først undersøge specificiteten af ​​humaniseret scFv5T4 for binding til humant 5T4, den scFv5T4 cDNA var manipuleret til at indeholde en C-terminal biotin tag eller genetisk fusioneret til monomert rødt fluorescerende protein 1 (mRFP1) [43]. Efter inkubation med de humane HT-29 colorektale cancerceller vides at udtrykke 5T4 [44], hvorfra WiDr cellerne stammer [45], scFv5T4 bundet til overfladen af ​​disse celler sammenligneligt med kommerciel anti-human 5T4 mAb (figur 2A). HEK293-celler manipuleret til at udtrykke den 5T4-antigen bundet både mAb5T4 samt scFv5T4 fragmentet som vist ved immunfluorescens mikroskopi, hvorimod kontrol HEK293-celler, der kun indeholder vektoren farvede ikke med nogen af ​​antistofferne (figur 2B). scFv5T4 specificitet for 5T4 blev også bestemt ved inkubering af scFv5T4 :: mRFP1 med HEK293-celler transficeret med pEGFP-N1 :: 5T4, eller kontrol vektor pEGFP-N1. Mikroskopisk analyse af GFP :: 5T4-udtrykkende HEK293-celler viste, at scFv5T4 bundet kun til de celler, der udtrykker 5T4 :: GFP-fusionen, men ikke til at styre transficerede celler (figur 2C). Tilsammen indikerer disse data, at det humaniserede scFv5T4 kan binde specifikt til human 5T4.

A) Histogrammer demonstrerer overflade binding af de angivne antistoffer, enten kommercielt mAb5T4 eller genereres scFv5T4 (tomme kurver), til 5T4 TAA på kolorektal cancer cellelinie HT-29 målt ved FACS. De skraverede Kurverne viser IgG2b isotype kontrol (øverste felt) eller streptavidin-FITC alene (nederste panel). B) Visualisering af kommerciel mAb5T4 eller scFv5T4, målretning af HEK293 celler transficeret med tom vektor (pCMV6-XL5) eller pCMV6-XL5 :: 5T4 ved fluorescens mikroskopi. Repræsentative billeder taget ved 400 × forstørrelse. C) Visualisering af HEK293 transficeret med pEGFP-N1 eller pEGFP-N1 :: 5T4 og inkuberet med scFv5T4 :: mRFP1. Samme synsfelt fotografierne blev taget under fase kontrast og grønne og røde fluorescerende filtre ved 100 × forstørrelse.

Generation of scFv5T4 :: Spec

D203A

For at mål spec til 5T4, spec blev translationelt fusioneret til scFv5T4 og rekombinant scFv5T4 :: spec

D203A blev udtrykt fra

E. coli

BL21 (DE3) og oprenset (figur 3). Desuden blev kontrolreagenser genereret herunder scFv5T4 alene og et ikke-funktionelt fusionsprotein, der indeholder Spec

Y15A /D203A, hver som opløselige proteiner indeholdende C-terminale biotin tags (figur 3).

A) skematisk illustration repræsenterer komponenterne i de genererede fusionsproteinkonstruktioner. Proteinet består af de genererede 5T4-målrettede humaniserede enkeltkædede variable fragmenter, V

H og V

L (grå søjle), der er genetisk fusioneret til streptokok superantigen Spec (blå bjælke) enten indeholder en alanin-substitution i rest D203 eller en yderligere alanin-substitution ved rest Y15. Alle konstruktioner blev genereret til at indeholde et C-terminalt biotin tag. De oprensede rekombinante proteiner er vist ved SDS-PAGE (panel B), og påvist ved Western blot-analyse ved streptavidin-IRDye800 (felt C)

human T-celle-proliferation og cytotoksicitet induceret af scFv5T4.: : spec

D203A

Vi først afprøvet scFv5T4 :: spec

D203A og proteiner til evnen til at formere sig inducerede humane PBMC’er kontrol. scFv5T4 :: Spec

D203A inducerede en dosisafhængig proliferative respons af humane lymfocytter, der var sammenlignelig med Spec

D203A (figur 4A). Vigtigt er det, gjorde scFv5T4 antistoffragment alene og dobbelt mutant fusion (scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A) ikke fremkalde signifikante proliferative responser. Dette indikerer, at Spec

D203A del af fusionen er ansvarlig for induktion af PBMC aktivering. Det immunterapeutiske middel blev derefter bedømt for evnen til at mediere tumorcelledrab af humane Spec-reaktive PBMC’er i to assays. Først blev humane kolorektal cancer cellelinie WiDr anvendt som mål i en 7-AAD-baserede drab assay. Effektiv celledrab blev observeret efter humane PBMC’er blev stimuleret med 200 nM af midlet i 48 timer, sammenlignet med vildtype-spec og ustimulerede kontroller (figur 4B). For det andet, HT-29-celler mærket med

51Cr blev anvendt som mål. Effektiv celledrab blev observeret på en dosis-afhængig måde efter humane PBMC’er blev stimuleret med midlet i 48 timer, og derefter tilsættes til tumorceller med stigende effektor og mål (E:T) -forhold (Figur 4C). Endvidere enkelt mutant fusion (scFv5T4 :: Spec

D203A) var mere effektiv end den tilsvarende dobbelt mutant fusion (scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A) eller antistof alene, men blev reduceret sammenlignet med spec

WT. Disse data indikerer, at scFv5T4 :: Spec

D203A er funktionelle for at inducere immun cellemedieret kræft celledød og at Spec

D203A, scFv5T4, og scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A proteiner kan fungere som præcise kontroller at vurdere kravet til målretning og SAG-aktivitet

in vivo

.

A) spec proteiner blev anvendt til at sammenligne scFv5T4 alene, scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A og efterfølgende scFv5T4 :: spec

D203A i optagelsen af ​​

3H-thymidin som et mål for PBMC proliferation efter 4 dage inkubation (n = 5). B-C) Dosisafhængig Spec-medieret PBMC cytotoksicitet scFv5T4 :: Spec

D203A blev bestemt ved at sammenligne spec kontroller, scFv5T4 alene og scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A efter 48 timers inkubation ved hjælp af FACS-analyse af WiDr (panel B), måling procent kræft celledød med 7AAD-udelukkelse farvning (n = 3) og

51Cr-frigivelse for at måle den specifikke cytotoksiske potentiale (panel C), når inkuberet med stigende effector:target nøgletal og

51Cr-mærkede HT-29 cancerceller. De viste data (middel ± SEM) er fra fire uafhængige menneskelige donorer hver udført i tre eksemplarer. * P 0,05, *** p 0,001, sammenlignet med den inaktive Spec

Y15A /D203A kontrol protein

Immunterapi af etablerede tyktarmskræft hjælp scFv5T4 :: Spec

D203A

spec er specifikt for humant Vβ2

+ T-celler, men dette SAg genkender ikke muse-T-celler [32]. Således teste Spec-baserede TTS kræves en model under anvendelse af humane lymfocytter. Endvidere den humane 5T4 målretning scFv har minimal krydsreaktivitet med murine 5T4 [37]. Derfor humane tumorceller, der udtrykker human 5T4 var nødvendige til forsøgene. Baseret på en tidligere udviklet model [18], [40], vi ansat immundefekte NOD SCID IL2Rγ

– /- (NSG) mus til engraftment af 5T4

+ human HT-29 kolorektal adenocarcinom celler. NSG mus mangler T, B og NK-celler [46] og udgør en optimal musestamme for human tumor indpodning [47]. Desuden er disse mus tillader overlevelse af overførte humane immunceller [46], [48]. HT-29-celler blev injiceret intraperitonealt i NSG mus og når faste tumorer blev palpable (ved 3 uger efter injektion), behandlinger blev initieret med intraperitoneal injektion af humane PBMC’er, efterfulgt af 8 daglige intravenøse injektioner af scFv5T4 :: Spec

D203A (figur 5A). Kontrol NSG mus modtog ikke PBMC’er eller modtaget PBMC’er uden yderligere behandlinger. Ekstra grupper omfattede scFv5T4 alene, Spec

D203A alene, eller inaktiv scFv5T4 :: Spec

Y15A /D203A. Tumor overfladearealet blev overvåget ved anvendelse caliper måling hele forsøget og viste lidt til ingen vækst af tumorerne i scFv5T4 :: Spec

D203A behandlingsgruppe, mens der blev observeret vækst i alle andre grupper (figur 5B). Mus blev aflivet i uge 8 af eksperimentet og tumorer blev evalueret i et blindet måde. Dette forsøg viste en dramatisk reduktion i den samlede tumor volumen efter behandling med scFv5T4 :: Spec

D203A, der var signifikant forskellig fra mus, der ikke har modtaget PBMC’er, skin-behandlede mus (saltvand), og mus behandlet Spec

D203A eller scFv5T4 :: spec

Y15A /D203A (figur 5C). Vigtigere er det, scFv5T4 :: Spec

D203A behandlingsgruppe viste også en signifikant reduktion i de samlede metastaser score sammenlignet med alle andre grupper (figur 5D og 5E).