PLoS ONE: Specifik Hæmning af Nuclear Exporter exportin-1 Dæmper nyrekræft Vækst

​​

Abstrakt

Formål

På trods af fremkomsten af ​​FDA-godkendte lægemidler til et begrænset antal af tilgængelige mål (kinaser og mTOR), PFS for nyrekræft (RCC) er blevet forlænget én til to år som følge af udviklingen af ​​lægemiddelresistens. Her vurderer vi en ny terapeutisk for RCC, som retter sig mod exportin-1 (XPO1) hæmmer.

Materialer og metoder

RCC celler blev behandlet med oralt tilgængelige XPO1 hæmmer, KPT-330, og cellelevedygtighed og Annexin V (apoptose) assays, og cellecyklus-analyser blev udført for at evaluere effekten af ​​KPT-330 i to RCC-cellelinier. Immunoblotting og immunofluorescens-analyse blev udført for at validere mekanismer XPO1 inhibering. Effekten og on-target effekter af KPT-330 blev yderligere analyseret in vivo i RCC xenograft mus, og KPT-330-resistente celler blev etableret for at vurdere de potentielle mekanismer KPT-330 modstand.

Resultater

KPT-330 svækket RCC levedygtighed gennem vækstinhibering og apoptose induktion både in vitro og in vivo, en proces, hvor øget nuklear lokalisering af p21 ved XPO1 inhibering spillet en stor rolle. Desuden KPT-330 resistente celler forblev følsomme over for i dag godkendt til RCC multi-kinase inhibitorer (sunitinib, sorafenib) og mTOR-hæmmere (everolimus, temsirolimus), hvilket tyder på, at disse målrettede lægemidler ville forblive anvendelig som anden linje terapi efter KPT-330 behandling.

Konklusion

oralt tilgængelige XPO1 hæmmer, KPT-330, repræsenterer en ny målsætning for RCC hvis in vivo effekten nærmer sig sunitinib. Desuden celler resistente til KPT-330 bevarer deres evne til at reagere på tilgængelige RCC lægemidler tyder på en ny tilgang til behandling i KPT-330-naive samt resistente RCC patienter

Henvisning:. Wettersten HI, Landesman Y, Friedlander S, Shacham S, Kauffman M, Weiss RH (2014) specifik Hæmning af Nuclear Exporter exportin-1 Dæmper nyrekræft vækst. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10,1371 /journal.pone.0113867

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 23, 2014, Accepteret 31. oktober, 2014, Udgivet: December 2, 2014

Copyright: © 2014 Wettersten et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1, og 1R01DK082690-01A1 og Karyopharm Therapeutics. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Mens nogle af arbejdet blev finansieret, og nogle af forfatterne ansat ved Karyopharm , ændrer dette ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Desuden blev ingen af ​​forsøgene eller konklusioner af papiret påvirket på nogen måde af Karyopharm

Introduktion

Nyrekræft (nyrecellecarcinom, RCC). Er den 13

th fleste almindelige kræftform i verden og er en af ​​få kræft, hvis forekomsten er stigende, en finde ikke alene på grund af forbedrede diagnostiske teknikker [1], [2]. Tegn og symptomer på RCC ofte subtil eller endog fraværende, sådan at mere end halvdelen af ​​patienterne er diagnosticeret øvrigt og ofte på metastatisk stadium, mens at blive evalueret for andre sygdomme, såsom akut nyreskade [3]. Mens de fem-års overlevelse for dem, der præsenterer med lokaliseret RCC er mere end 70%, for dem med metastatisk sygdom, den femårige overlevelse falder til en trist 16-32%. Omkring halvdelen af ​​RCC patienter udvikler fremskreden sygdom og kræver systemisk behandling. På trods af fremkomsten af ​​flere FDA-godkendt målrettede lægemidler i løbet af de sidste mange år, som er begrænset til multi-kinase inhibitorer og mTOR-hæmmere, progressionsfri overlevelse (PFS) er forlænget kun et til to år med disse målrettede lægemidler grund stort set til udviklingen af lægemiddelresistens [4]. Således er det kritisk at udvikle nye lægemidler til andre mål end kinaser og mTOR pathway

p21 blev oprindelig beskrevet som en cyclin-afhængig kinase inhibitor (CKI) af cyclin-CDK2, -CDK1, og. – CDK4 /6-komplekser, hvis ekspression er klassisk reguleret af p53 [5]. Men i løbet af årene er det blevet påvist, at have pleiotrop, og til tider tilsyneladende modstridende, virkninger på celleproliferation, apoptose, og ældning i cancer og i vaskulær sygdom uafhængig af p53 [5], [6]. Generelt når p21 er lokaliseret i kernen, det binder til cyclin-cdk-komplekser og derved hæmmer deres funktion i cellecyklusprogression, hvilket resulterer i cellecyklusstop [5]. Men når p21 er lokaliseret inden for den cytosoliske rum, det hæmmer apoptose ved kompleksdannelse med pro-apoptotiske proteiner, såsom pro-caspase-3 eller ASK [7], [8]. I overensstemmelse med disse formodede mekanismer, har tidligere arbejde i vores laboratorium vist, at øget cytosole p21 er en indikator for dårlig prognose i RCC patienter [9], en konstatering også observeret i andre kræftformer [10], [11].

det nukleare eksportør, exportin11 (XPO1, CRM1), styrer nucleo-cytoplasmatisk lokalisering af mere end 200 Nuclear Export Signal (NES) -holdige proteiner, hvoraf mange er tumor suppressor proteiner (tsps), herunder p21 [12]. Det er tidligere blevet vist, at XPO1 inhibitorer har en terapeutisk virkning i RCC [13]. I denne undersøgelse, vi testede effekten af ​​KPT-330, den oralt tilgængelige XPO1 inhibitor, som i øjeblikket er i fase I /II kliniske forsøg for at vurdere dets potentiale kliniske, enten enkeltvis eller som kombinationsbehandling, i avanceret RCC. Vi viser nu, at, sandsynligvis via en mekanisme, relateret til subcellulær lokalisering af p21, dette oralt tilgængelig XPO1 inhibitor repræsenterer en levedygtig ny terapeutisk handler om en hidtil uprøvet mål i RCC.

Materialer og metoder

Cell kultur

RCC-cellelinjer ACHN og 786-O blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og evalueres regelmæssigt for tilstedeværelsen af ​​Mycoplasma. Normale human nyre proximale epithelial (NHK) -celler blev opnået fra Lonza (Allendale, NJ). Alle celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml streptomycin og 100 mg /ml penicillin ved 5% CO

2 ved 37 ° C. Disse to cellelinjer blev valgt til at undersøge effekten af ​​KPT-330 i begge primære tumor-afledte celler (786-O; der kan betragtes som “tidlige” tumorer). Samt metastatiske celler (ACHN)

Materialer

lipofectamin RNAiMAX transfektion reagens, Stealth RNAi negativ kontrol siRNA, og Stealth RNAi XPO1 siRNA blev opnået fra Life Technologies (Grand Island, NY). KPT-330 blev syntetiseret ved Karyopharm Therapeutics (Natick, MA). Sunitinib og sorafenib frie base blev opnået fra LC Laboratories (Worburn, MA). Everolimus og temsirolimus var gaver fra Dr. Prasit på Inception Sciences (San Diego, CA). Dimethylsulfoxid (DMSO) og muse monoklonale anti-β-actin-antistof blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). Kanin polyklonalt anti-XPO1 antistof og monoklonalt muse-anti-p53-antistof blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Muse monoklonalt anti-p21WAF1 /Cip-antistof blev opnået fra Millipore (Billerica, MA). Kanin monoklonalt anti-p21WAF1 /Cip-antistof og anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluor 488 konjugat) opnåedes fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Ged anti-mus og gede-anti-kanin-HRP-konjugeret IgG blev opnået fra Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield HardSet Mounting Medium med DAPI blev opnået fra Vector Laboratories (Burlingame, CA).

KPT-330, sunitinib, sorafenib, everolimus, og temsirolimus blev opløst i DMSO for in vitro-undersøgelser. KPT-330 blev kombineret med køretøjer Poloxamer 188 (Pluronic F68; opnået fra Spectrum Laboratory Products, Inc.) og PVP K-29/32 (Plasdone K-29/32; fremstillet af ISP Technologies, Inc.) i opløsning og sunitnib var opløst i vegetabilsk olie til in vivo-undersøgelse.

Immunoblotting

Immunoblotting var som tidligere [14] beskrevet. Kort fortalt, efter passende behandlinger, blev cellerne vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og lyseret i lysepuffer, og cellelysater blev immunoblottet. Membraner blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk i en time ved stuetemperatur og undersøgt med egnede antistoffer. Membraner blev derefter probet med HRP-mærkede anti-muse- eller anti-kanin IgG-antistoffer. Signal blev detekteret ved anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL) løsninger. Densitometri analyse blev udført udnytte ImageJ 1,440 software (https://imagej.nih.gov/ij), og efter normalisering til lastning kontrol (β-actin) er angivet ovenfor hver immunoblot.

Immunofluorescens

Efter angivne behandling i otte godt kammer slides blev immunfluorescens udført som tidligere [14] beskrevet. Kort fortalt blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og anbragt i blokerende buffer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med den angivne antistof, inkuberet med anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘)

2 Fragment (Alexa Fluor 488 konjugat), og dækglas med Vectashield med DAPI. Prøverne blev undersøgt ved konfokal mikroskopi.

MTT assay

Cell levedygtighed assay blev udført som tidligere [14] beskrevet. Kort beskrevet blev celler udpladet i plader med 96 brønde, og efter passende behandlinger blev cellerne inkuberet i opløsning /blanding MTT medier. Derefter blev MTT-opløsning fjernet, og den blå krystallinsk bundfald i hver brønd blev opløst i DMSO. Synlig Absorbansen af ​​hver brønd ved 540 nm blev kvantificeret under anvendelse af en mikropladelæser.

Cellecyklusanalyse

Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af MUSE Cell Analyzer (Millipore, Billerica, MA) ved at følge fabrikantens instruktion. Kort fortalt, efter de angivne behandlinger blev cellerne vasket med PBS og farvet med propidiumiodid (PI). Efter farvning blev cellerne behandlet til cellecyklus analyse

Annexin V assay

Annexin V Dead Cell Assay blev udført under anvendelse af MUSE Cell Analyzer efter producentens anvisninger. Kort fortalt efter egnede behandlinger, blev cellerne inkuberet med Annexin V og Dead Cell Reagens (7-AAD) og begivenhederne for døde, sent apoptotiske, tidlig apoptotiske, og levende celler blev talt.

Immunhistokemi

Biogenex I6000 automatiseret immunostainer blev brugt til at udføre IHC på formalin fast paraffin indlejret xenotransplantater. Antigen blev hentet ved dampning med Cell Marque Declere reagens. Baggrund blev blokeret med Biogenex Power blok. Primært antistof blev anvendt i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af påvisning med totrins-, Hi-Def Polymer Detection kit fra Cell Marque, efterfulgt af Cell Marque DAB chromagen. Prøver blev modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret, ryddet, og dækglas. Vi brugte følgende primære antistoffer: p21 (Abcam) og Ki67 (Cell Marque). Den Millipore Apoptose kittet blev anvendt ifølge producentens protokol.

siRNA transfektion

Lipofectamine RNAiMAX transfektionsreagens blev blandet med Stealth RNAi siRNA efter producentens anvisninger. Derefter blev cellerne inkuberet med blandingen i væksten medier uden penicillin /streptomycin for passende tidspunkt for transfektion af siRNA’er og knockdown blev bekræftet ved immunoblotting.

ACHN xenograft mus eksperiment

UC Davis Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) udvalg specifikt godkendt denne undersøgelse. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med University of California IACUC. Mandlige athymiske nu /nu mus blev hver injiceret med 5 x 10

5 ACHN celler subkutant i flanken region. Tumorprogression blev overvåget ugentligt med en skydelære (tumorvolumen = x bredde x længde bredde /2). Når tumor størrelser nået omkring 80-100 mm

3, mus blev inddelt tilfældigt i fem grupper (køretøj, sunitinib, KPT-330 lav eller høj dosis, eller KPT-330 lav og sunitinib) for medicinsk behandling. For køretøjet gruppen blev Bilmodeller (Pluronic F-68 og PVP K-29/32-blanding og vegetabilsk olie) gives oralt (to gange om ugen og fem gange om ugen henholdsvis n = 8). For sunitinib gruppen, køretøjet løsning for KPT-330, blev Pluronic F-68 og PVP K-29/32-blanding, og sunitinib (40 mg /kg) indgivet oralt (to gange om ugen og fem gange om ugen henholdsvis n = 8) [15]. På KPT-330 lav gruppe, blev lav dosis af KPT-330 (7,5 mg /kg) og vegetabilsk olie indgivet oralt (to gange om ugen og fem gange om ugen henholdsvis n = 8). På KPT-330 høj gruppe, blev høj dosis af KPT-330 (15 mg /kg) og vegetabilsk olie indgivet oralt (to gange om ugen og fem gange om ugen henholdsvis n = 8). På KPT-330 lav og sunitinib gruppe, blev lav dosis af KPT-330 (7,5 mg /kg) og sunitinib (40 mg /kg) indgivet oralt (to gange om ugen og fem gange om ugen henholdsvis n = 8). Efter 25 dages behandling, blev dyrene aflivet og tumorvæv blev indsamlet i 10% formalin til immunhistokemi analyse.

Statistiske metoder

For in vitro-undersøgelser, sammenligninger af middelværdier blev udført ved hjælp af uafhængige stikprøver t-test. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant. For in vivo-undersøgelse, blev tumorvækst sammenlignet parvis mellem alle behandlinger ved hjælp af Tukey HSD-metoden.

Resultater

Dæmpning af XPO1 af KPT-330 hæmmer RCC levedygtighed gennem cellecyklus arrest og induktion af apoptose

Vi først bekræftet, at KPT-330 svækkede niveauer af XPO1 i to RCC cellelinjer på et tilsvarende størrelsesorden (fra 0,1 uM) til det, der blev observeret med tidligere udviklede inhibitorer af denne nukleare transporter (fig. 1A) [13]. At evaluere effekten af ​​XPO1 hæmning af KPT-330 mod celle overlevelse, vi fastslået, at cellelevedygtighed som reaktion på denne inhibitor var tydelig i en koncentration på 0,1 pM i RCC-cellelinjer, men på en størrelsesorden højere dosis (10 uM) i normal renale tubulære epitel (NHK) celler (fig. 1B), en konstatering muligvis på grund af øget XPO1 niveauer i RCC væv sammenlignet med normale nyrevæv, som vi tidligere har vist, [13]. Til at begynde at undersøge mekanismerne i KPT-330-induceret nedsat levedygtighed celle i RCC blev cellecyklus og apoptose analyse udført. Når inkuberet med KPT-330 viste begge RCC-cellelinier en forøgelse af celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus på mere end 10% (fig. 1C), samt en apoptotisk celle fraktion på ca. 10% (Fig . 1D og fig. S1), tyder på, at nedsat levedygtighed RCC celler ved KPT-330 sker via både cellecyklusstandsning og induktion af apoptose.

RCC celler 786-O og ACHN blev dyrket til -60% konfluens og behandlet med KPT-330 ved angivne doser i 24 timer og immunoblotting blev udført med specifikke antistoffer (A). RCC og NHK-celler blev dyrket til -30% konfluens, behandlet med KPT-330 ved angivne doser i 72 timer, og MTT-assays blev udført (B). Cellecyklusanalyse (C) og Annexin V assay (D) blev udført efter den 24. timers inkubation med DMSO (Cont) eller KPT-330 (1 uM). * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse.

XPO1 inhibering begrænset p21 til kernen i RCC-celler, men ikke i en normal renal epitelcellelinie

Øget cytosolisk p21, som er blevet vist at inhibere apoptose [5], og dermed muligvis forpurre tumor overvågning, er en indikator for dårlig prognose for RCC [9]. Af denne grund og i lyset af den kendte egenskab af nuklear p21 i svækkende cellecyklusprogression, spurgte vi, om nuklear p21 kræves til KPT-330 til at forårsage de observerede virkninger i RCC-celler. Når visualiseret ved immunofluorescens cytokemi blev p21 vist i vidt omfang til at være begrænset til kernen efter KPT-330 behandling i begge RCC-cellelinier (fig. 2A). I overensstemmelse med cellecyklus-data, KPT-330 undlod at ændre lokalisering af p21 i NHK celler (Fig 2A.); dette kan forklare den fejlslagne KPT-330 for at mindske overlevelse i de normale celler og er relevant for fremtidig klinisk oversættelse af disse fund (

se nedenfor

). Interessant nok blev p21-niveauer forøget med KPT-330 i RCC-celler (Fig. 2B), hvilket antyder, at p21 var ikke kun begrænset i kernen af ​​KPT-330, men viste også forhøjede niveauer, sandsynligvis mediere den observerede G2 /M-cellecyklusstandsnings ( se fig. 1C og [16]).

RCC-celler 786-O og ACHN blev dyrket til -60% konfluens og behandlet med KPT-330 ved angivne doser i 24 timer. Immunofluorescens blev udført ved konfokal mikroskopi (20x) og antallet af celler, hvori p21 var overvejende i kernen blev talt i tre tilfældigt udvalgte felter og divideres med det samlede celleantal (A). Immunoblotting blev udført med specifikke antistoffer (B). Blå, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejl søjler indikerer standardafvigelse.

siRNA hæmning af XPO1 øget nuklear p21 i RCC celler

For at demonstrere specificiteten af ​​KPT-330 på niveauer og lokalisering af p21, og at disse virkninger er grundet XPO1 inhibering, RCC (786-O og ACHN) -celler blev transficeret med enten et siRNA specifikt for XPO1 eller en kodet sekvens kontrol siRNA. Begge cellelinjer demonstreret nedsatte niveauer af XPO1 ledsaget af en stigning i den samlede p21 på XPO1 knockdown (fig. 3A), med immunfluorescensfarvning viser, at p21 var stort set begrænset til kernen under disse betingelser (fig. 3B), svarende til, hvad der blev observeret med KPT-330 (se fig. 2B). Således er effekten af ​​KPT-330 på p21 skyldtes specifikt til XPO1 dæmpning.

RCC (786-O og ACHN) celler blev dyrket til -60% konfluens og transficeret med scrambled sekvens kontrol eller XPO1- specifikke siRNA i 48 timer. Immunoblotting blev udført med specifikke antistoffer (A) og immunfluorescens blev udført ved konfokal mikroskopi (20x) (B). Antallet af celler, hvori p21 var overvejende i kernen blev talt i tre tilfældigt udvalgte felter og divideres med det samlede celleantal. Blå, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejl søjler indikerer standardafvigelse.

Oralt administreret KPT-330 svækket tumorvækst, forbundet med øget nuklear p21

Til at begynde at oversætte dette arbejde til sengekanten, effekten af ​​KPT- 330 i en RCC mus xenograft model blev evalueret. Når subkutant implanterede tumorer blev palpable, blev musene behandlet med sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 lav (7,5 mg /kg) og høj (15 mg /kg) doser, en kombination af sunitinib og KPT-330 lavdosis eller vehikel (som var den samme for KPT-330 og sunitinib). Sunitinib blev udnyttet både som et lægemiddel kontrol og som en potentiel kombinationsbehandling partner siden sunitinib er den første linje behandling for RCC [17]. Både KPT-330 høj dosis og kombinationen af ​​sunitinib og KPT-330 lavdosis inhiberede RCC vækst betydeligt sammenlignet med køretøjet (fig. 4), hvilket antyder, at KPT-330 kan anvendes som enkelt terapi og er også gavnligt, når det kombineres med den nuværende første linje terapeutisk, sunitinib.

5 × 10

5 ACHN celler blev subkutant injiceret til flanken region. Når tumorerne var palpable, blev musene behandlet med bærer, sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 lav (7,5 mg /kg), KPT-330 høj (15 mg /kg) eller sunitinib og KPT-330 lav for 25 dage som diskuteret i materialer og metoder. Tumorvækst blev overvåget ved caliper (tumorvolumen = længde x bredde x bredde /2) og tumor vækst (tumorvolumen på dag X /tumorvolumen på dag 0) blev beregnet. * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejl streger indikerer standardafvigelser.

For at validere på target effekter af KPT-330 blev xenograft væv behandlet efter offer for immunhistokemi analyse. Som sammenlignet med kontrol xenograft væv, KPT-330 (høj dosis) behandlede dyr viste en stigning i p21 kernefarvning, en stigning i apoptose markør Apoptag farvning, og et fald i farvning af proliferationsmarkør Ki67 (fig. 5), alle i overensstemmelse med vores in vitro observationer. Disse resultater tyder på, at KPT-330 dæmper RCC vækst gennem hæmning af cellevækst og induktion af apoptose i RCC xenograft model, og at reguleringen af ​​p21 lokalisering spiller en stor rolle i effekten af ​​KPT-330.

Efter afslutningen af ​​eksperimentet beskrevet i fig. 6, xenograft væv blev indsamlet og behandlet for immunohistokemi med de angivne antistoffer som beskrevet i Materialer og Metoder. Bar = 20 um.

KPT-330 resistente celler var følsomme over for FDA godkendte lægemidler for RCC

På grund af den hyppige forekomst af kemoterapi modstand i RCC patienter behandlet med målrettede lægemidler, det er afgørende for at give alternative behandlingsmuligheder for dem, der kan udvikle resistens over for XPO1 hæmning med den foreslåede i denne undersøgelse strategi. For at evaluere den mekanisme, som RCC-celler bliver resistente over for KPT-330 har vi fokuseret på VHL-mut 786-O-celler, eftersom VHL mutation ses hos ca. 90% af RCC patienter [18]. 786-O-celler blev indledningsvis inkuberet med en lav (50 nM) koncentration af KPT-330, og serielt overført til medier med stigende koncentrationer af KPT-330 over en periode på seks måneder. Celler, som begyndte at vokse ved 1 uM KPT-330 blev defineret som “KPT-330 resistent”; fra de parentale 786-O-celler (P), blev etableret i alt to separate resistente cellelinier (R1 og R2). Som defineret, R1 og R2 celler var mindre følsomme for KPT-330 end P-celler, når de behandles med forskellige doser af KPT-330 (fig. 6A) uden dæmpning af XPO1 (fig. 6B). Interessant lokalisering af p21 var upåvirket i KPT-330 resistente celler (fig. 6C), hvilket yderligere understøtter betydningen af ​​dette protein i KPT-330-signalering.

KPT-330 resistente 786-O (R1 og R2) celler blev etableret som beskrevet i teksten, og disse samt de parentale (P) celler blev behandlet med KPT-330 i de angivne doser i 72 timer, hvorefter MTT-assays blev udført (A). R1, R2, og P-celler blev behandlet med KPT-330 i 24 timer, derefter immunoblotting og immunofluorescens blev udført. Antallet af celler, hvori p21 blev overvejende kernen blev talt i tre tilfældigt udvalgte felter og divideret med det samlede celleantal (Blå, nucleus (DAPI); Green, p21) (B). * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejl søjler indikerer standardafvigelse.

For at vurdere potentialet for bjærgning behandlingsformer, overlevelsen af ​​de resistente celler blev vurderet med konventionelle målrettede midler. Når KPT-330 resistente celler blev behandlet med hver af de i dag godkendt til RCC kinaseinhibitorer (sunitinib og sorafenib) og mTOR inhibitorer (everolimus og temsirolimus-), R1 og R2 celler bibeholdt følsomhed på samme måde som P-celler (fig. 7), hvilket indebærer, at de konventionelle målrettede lægemidler kan anvendes som anden linje behandling, hvis patienter udvikler resistens over for KPT-330.

KPT-330 resistente 786-O (R1 og R2) og parentale (p) celler blev behandlet med KPT-330 i de angivne doser i 72 timer, hvorefter MTT-assays blev udført. * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Fejl søjler indikerer standardafvigelse.

Diskussion

Nye lægemidler til avanceret RCC er blevet godkendt af FDA næsten hvert år siden indførelsen af ​​sorafenib, den første målrettede RCC terapeutisk. Men selv med disse lægemidler, forlænget PFS for dem med metastatisk RCC er kun et til to år på grund af udviklingen af ​​lægemiddelresistens; situationen for patienter med fremskreden sygdom er gjort mere dystre af, at der er, men en begrænset repertoire af tilgængelige terapeutiske mål (i øjeblikket kun kinaser og mTOR) [4]. Det er således afgørende at identificere nye mål for RCC, som adskiller sig fra dem, der nu udnyttes. I lyset af tidligere undersøgelser, der viser, at XPO1 inhibitorer har en terapeutisk virkning i RCC in vitro og in vivo [13], i denne undersøgelse vi vurderede effekten og mekanismen for KPT-330, den XPO1 inhibitor, som er i øjeblikket fase 1 forsøg, for at bestemme potentiel klinisk anvendelse af KPT-330 til avanceret RCC. Faktisk resultaterne af flere igangværende fase I /II kliniske forsøg med KPT-330 (selinexor, clinicaltrials.gov) tyder på, at oral KPT-330 har klart anti-cancer aktivitet med acceptabel tolerabilitet tværs af flere faste og blodkræftsygdomme, men der er sparsomme data på dette middel i RCC og ingen mekanistisk information.

Cytosolisk p21 er en indikator for dårlig prognose i RCC, og det kunne tænkes at anvendes som en sådan markør i andre cancere, såsom brystcancer, der også er kendetegnet ved overudtrykt cytosolisk p21 [10]. Både når inkuberet

in vitro

i flere RCC-cellelinier og ved oral indgivelse

in vivo

i et menneske muse RCC xenotransplantat, KPT-330 forøgede nuklear p21 gennem specifik inhibering af XPO1, hvilket resulterer i en signifikant fald af RCC cellelevedygtighed gennem cellecyklusstandsning (og inhibering af proliferation in vivo) og induktion af apoptose. Overraskende, der var minimal effekt af KPT-330 på normal renal tubulær epitelcelle levedygtighed eller p21 lokalisering i disse celler, en konklusion, som understøtter sandsynligheden for minimale bivirkninger på nyre- (såvel som andre organer) -funktionen hos patienter, som indgives dette medicin. Når i kernen, p21 anholdelser cellecyklussen ved binding cyclin /CKD komplekser i alle faser, mens når i cytosolen, p21 inhiberer apoptose ved at interagere med pro-apoptotiske proteiner, herunder pro-caspase 3 og ASK [5]. Således vores resultater tyder på, at nuklear p21 er involveret i den mekanisme, hvormed KPT-330 påvirker RCC celler, en hypotese understøttes af, at NHK celler, hvis p21 lokalisering blev ikke påvirket af KPT-330 ikke var så følsom over for KPT-330 som RCC celler og at KPT-330 resistente celler undladt at lokalisere p21 til kernen.

i mange cancerformer, er nuklear eksport af proteiner forstærket under sygdomsprogression og kan faktisk bidrage til processen af ​​lægemiddelresistens [19]. For eksempel er højere niveauer af XPO1 udtryk positivt korreleret med grad progression samt øgede spredning satser i gliom [20], pancreascancer [21], og livmoderhalskræft [22]. Baseret på vores data, er det sandsynligt, at nuklear eksport af p21 ved XPO1 er mere udtalt i RCC end i NHK celler som cytosolisk p21 i tumorerne forøges, især i de RCC sager med dårligere prognoser [9]. Denne observation (færre effekter ved XPO1 hæmning i normale celler end deres kræftceller) er i overensstemmelse med andre offentliggjorte undersøgelser med SINE der viser, at SINE mål syge celler og samtidig skåne normale celler [12]. Desuden vores fund, at KPT-330 resistente celler beholdt følsomhed over for alle de nuværende FDA godkendt målrettede lægemidler til avanceret RCC (sunitinib, sorafenib, everolimus, og temsirolimus) antyder, at patienter, der ikke KPT-330, eller for hvem modstand udvikler, kunne stadig reagere på disse ældre lægemidler [4].

konklusioner

De viste data indikerer, at XPO1 hæmning af KPT-330 dæmper RCC levedygtighed gennem cellecyklusstop samt induktion af apoptose, og at øget nuklear p21 ved XPO1 hæmning spiller en stor rolle i effekten af ​​KPT-330 i RCC. Vi viser, at KPT-330 forstærker antitumoraktiviteten af ​​sunitinib, hvilket resulterer i fuldstændig inhibering af RCC tumorvækst in vivo med denne kombination. Desuden støtter vores data sandsynligheden for, at patienter resistente til KPT-330 vil reagere på ældre målrettede lægemidler. Da fremskreden RCC har en dårlig prognose selv med målrettede lægemidler, vores arbejde introducerer KPT-330 som en ny terapeutisk for RCC, som hurtigt kan flyttes ind i den kliniske realm at evaluere effekten af ​​sig selv eller kombineret behandling med andre RCC terapeutika.

Støtte Information

Figur S1.

KPT-330 inducerede apoptose i RCC-celler. RCC-celler 786-O og ACHN blev dyrket til -60% konfluens. En Annexin V assay blev udført efter den 24. timers inkubation med DMSO eller KPT-330 (1 uM) som beskrevet i Materialer og Metoder. Den gating vises

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113867.s001

(PPTX)