PLoS ONE: granulin-epithelin forstadium en onkoføtalt Protein Definition Nedsat Cancer Stamceller

Abstrakt

Baggrund og Formål

Stigende beviser har foreslået, at hepatocellulært carcinom (HCC) kan stamme fra en særskilt subpopulation kaldet kræft stamceller (CSCS), der er ansvarlige for begrænset effekt konventionelle behandlinger. Vi har tidligere vist, at granulin-epithelin precursor (GEP), en pluripotent vækstfaktor, opreguleres i HCC, men ikke i den tilstødende ikke-tumor, og at GEP er et potentielt terapeutisk mål for HCC. Her har vi karakteriseret sit udtryk mønster og stamceller ejendomme i føtale og kræft lever.

Metoder

Protein udtryk for GEP i føtale og voksne lever blev undersøgt i humane og musemodeller af immunhistokemisk farvning og flowcytometri. Liver cancer cellelinjer, isoleres baseret på deres GEP og /eller ATP-afhængig binding kassette (ABC) drug transportør ABCB5 ekspression, blev bedømt for hepatiske CSC egenskaber med hensyn til kolonidannelse, kemoresistens og tumorigenicitet.

Resultater

Vi viste, at GEP var en hepatisk onkoføtalt protein, som udtrykkes i føtale levere, men ikke i de normale voksne lever. Vigtigere, GEP + føtale leverceller co-udtrykte de embryonale stamceller (ES) celle-relaterede signalmolekyler, herunder β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og DLK1, og også hepatiske CSC-markører CD133, EpCAM og ABCB5. Fænotypisk karakterisering i HCC kliniske prøver og cellelinier afslørede, at GEP + kræftceller co-udtrykte disse stamcelle markører på samme måde som den GEP + føtale leverceller. Endvidere GEP blev vist at regulere ekspressionen af ​​ES-relaterede signalmolekyler β-catenin, Oct4, Nanog, og Sox2. Isolerede GEP

høje kræftceller viste forbedret kolonidannelse evne og kemoresistens sammenlignet med de GEP

lave modstykker. Co-ekspressionen af ​​GEP og ABCB5 bedre defineret CSC befolkninger med forbedret tumorigen evne hos immunkompromitterede mus.

Konklusioner

Vores resultater viser, at GEP er en hepatisk onkoføtalt protein regulerer ES celle-relaterede signalmolekyler . Co-ekspressionen af ​​GEP og ABCB5 beriger endvidere en delpopulation med forbedrede CSC egenskaber. De aktuelle data giver ny indsigt i den terapeutiske strategi

Henvisning:. Cheung PFY, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) granulin-epithelin forstadium en onkoføtalt Protein Definition Nedsat cancerstamceller. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10,1371 /journal.pone.0028246

Redaktør: Young Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Republikken Korea

Modtaget: Juni 2, 2011; Accepteret: November 4, 2011; Udgivet: 16. december 2011

Copyright: © 2011 Cheung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Sun CY Grundforskningsfond for Lever og pancreas kirurgi, National Natural Science Foundation of China og Hong Kong Research Grants Council (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), Seed Funding Program og Small Project Finansiering Program ved University of Hong Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC), den tredje hyppigste årsag til kræft dødelighed på verdensplan, er en meget malign sygdom med nogen effektiv behandling for tiden [1]. Mens de molekylære mekanismer i HCC patogenese forbliver stort set ukendt, er HCC betragtes som en heterogen sygdom på grund af sine mange molekylære profiler og varierede kliniske resultater [2]. Den heterogene karakter af HCC og manglen på egnede biomarkører har hæmmet patient prognose og behandling.

I årevis tumor celle heterogenitet er blevet forklaret ved klonal evolution model [3]. nye oplysninger tyder dog, at tumorer hierarkisk er organiseret med en tydelig delpopulation kaldet kræft stamceller (CSCS) ligger i spidsen af ​​hierarkiet. Disse celler er ikke kun ansvarlig for tumor initiering og progression, men også udstyret med stamcelle egenskaber, herunder selvfornyelse, differentiering kapacitet og kemoresistens [4]. Selvom eksisterende behandlinger begynde med kan eliminere hovedparten population af tumor, stamcelle egenskaber CSCS at de kan overleve og genbefolke tumoren, hvilket resulterer i sygdom tilbagefald [5].

Begrebet CSCS er blevet dokumenteret i forskellige maligniteter herunder bryst- [6], colon [7] og leverkræft [8], [9]. Trods de seneste fremskridt inden for hepatisk CSC identifikation, nøjagtige oprindelse af disse celler er stort set ukendt. Tumorigenese og embryogenese er kendt for at dele mange fælles egenskaber, herunder cellulære plasticitet, dynamisk celle motilitet [10] og konvergens af signalveje, hvilket tyder på en mulig forbindelse mellem embryonale og cancerceller [11]. Interessant er begrebet CSC er især svarer til “embryonal resten” teori, som blev foreslået baseret på de histologiske ligheder i embryonale og cancervæv, hvilket antyder, at voksne væv indeholder embryonale rester, der normalt ligger i dvale, men kan aktiveres til at blive til kræft [12]. Derfor identifikation af centrale molekyle, der ligger til grund for ensartethed i embryonale stamceller (ES) celler og tumorceller kan resultere i nye terapeutiske strategier til at undertrykke den maligne transformation af normale stamceller, eller udrydde den CSCS.

granulin-epithelin precursor (GEP, også kaldet progranulin, proepithelin, acrogranin eller PC vækstfaktor) er en pluripotent vækstfaktor regulerer fostrets udvikling [13], vævsreparation [14] og tumorigenese i forskellige kræftformer [15]. Det blev konstateret at regulere udviklingsmæssige begivenheder, herunder kavitation i præimplantationsperioden musefostre [16] og han-specifik hjerne differentiering af hypothalamus af neonatale rotter [17]. Vi har tidligere demonstreret GEP overekspression i størstedelen af ​​humane HCC prøver [18], [19] og dens rolle i reguleringen af ​​HCC celleproliferation, invasion og tumorgenicitet [19]. Desuden kunne neutralisering af GEP inhibere væksten af ​​etablerede HCC [20]. Trods betydelig interesse i sine dobbelte roller i embryogenese og tumorigenese, information til dens udtryk mønster og biologiske funktioner i lever stadig sparsomme.

I denne undersøgelse rapporterer vi for første gang, at GEP er en hepatisk onkoføtalt protein, regulerer ekspressionen af ​​stamcelle-relaterede signalmolekyler β-catenin, Oct4, NANOG og Sox2. Funktionelle undersøgelser bekræftede, at GEP-udtrykkende celler besad større evne i kolonidannelse og kemoresistens. Endvidere demonstrerede cancerceller coudtrykker GEP og ATP-afhængig binding kassette (ABC) B5 forbedret tumorigene evne hos immunkompromitterede mus. Vores resultater er afgørende ikke blot for forståelsen af ​​føtal lever udvikling, men også til konstruktion af specifikke behandlingsformer rettet mod GEP og ABCB5 at udrydde de kemoterapi CSCS i HCC patienter.

Materialer og metoder

Cell assays Salg

humanlever cancercellelinier, Hep3B og HepG2, blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket som tidligere beskrevet [19], [20]; mens Huh7 blev indkøbt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stabile transfektanter for GEP overekspression og dæmpning er blevet beskrevet [19]. GEP blokering i Hep3B blev udført ved at inkubere cellerne med eller uden 50 ug /ml anti-GEP monoklonale antistof A23 (hjemmelavet, tidligere beskrevet [20] eller muse-IgG isotype kontrol antistof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 24 h.

Kliniske prøver

undersøgelsen protokollen blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Hong Kong /Hospital Myndighed Hongkong West Cluster (HKU /HA HKW IRB). Seks patienter gennemgik helbredende partiel hepatektomi eller levertransplantation for HCC på Queen Mary Hospital, Hongkong, blev rekrutteret med skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen. patienterne var blevet diagnosticeret med primær HCC og bekræftet ved patologiske undersøgelser. alderen af ​​patienterne varierede fra 42 til 67 år, med en gennemsnitsalder på 60 år. Der var 4 mænd og 2 kvinder, og alle var hepatitis B virus bærere. størrelsen af ​​tumorerne varierede fra 3,5 til 19,5 cm, med en median størrelse på 8,3 cm. især hver prøve har begrænset antal celler (små forskningsprojekter prøven for at sikre ingen interferens til patologisk undersøgelse), og derfor ikke tilstrækkeligt for den fuldstændige panel af stamceller markør udtryk analyse. Udtrykket data for hver markør præsenterede de gennemsnitlige data fra mindst fire prøver. De normale lever- prøve blev opnået fra organdonor under transplantation operation, og donoren havde nogen underliggende leversygdom og var negativ i hepatitis B serologi test. De føtale lever prøve blev opnået fra genfinding af arkiveret formalin fast paraffin indstøbt væv blok taget under rutinemæssig patologisk undersøgelse af abortus efter spontan abort på 10 uger 6 dage. Etik godkendelse til anvendelse af arkiverede fostervæv identificeret fra en computerdatabase er opnået fra Institutional Review Board fra University of Hong Kong /Hospital Myndighed Hongkong West Cluster (HKU /HA HKW IRB).

Mus prøver

Lever fra voksen, neonatal og føtale ICR mus blev indsamlet og forsøgsprotokollen blev godkendt af Udvalget om brugen af ​​levende dyr i undervisning og forskning ved University of Hong Kong (Godkendelse reference nr CULATR 1968 -09). Til isolering af muse hepatocytter blev leverne hakket og fordøjet med type IV collagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Efter filtrering og lyse af røde blodlegemer blev celler talt for immunfluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Celler isoleret fra embryonale levere blev farvet med anti-AFP-antistof (R 80% med minimal celledød ( 10%).

doxorubicin akkumulering og apoptose

Celler blev inkuberet med eller uden 0,5 pg /ml doxorubicin i 24 timer. Intracellulær doxorubicin akkumulering blev analyseret ved flowcytometri på FL2-spektrum; mens celle apoptose blev bestemt ved Annexin V-FITC (FL1) og propidiumiodid (PI) (FL2) farvning og flow-cytometrisk analyse.

Kolonidannelse assay

Friskt isolerede celler blev podet ved en densitet på 1000 celler /brønd og fik lov at vokse i 10 dage. Kolonidannelse blev vurderet ved en kolorimetrisk assay under anvendelse krystalviolet (Sigma Aldrich).

In vivo

tumorigenisitetsforsøg eksperimenter

BALB /c athymiske nøgne mus af 5 uger gamle, blev anvendt at teste

in vivo

tumorigent potentiale af cellerne. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Udvalget om brugen af ​​levende dyr i undervisning og forskning ved University of Hong Kong. Forskellige antal af celler blev inokuleret subkutant i den dorsale region i stammen af ​​hvert dyr. Musene blev aflivet mellem 8 og 16 uger efter injektion, hvor tumorerne blev høstet for yderligere undersøgelse. Disse mus injiceret med HCC-celler, men uden tegn på tumorbelastning var generelt afsluttet 5 måneder efter celleinjektion.

statistiske analyser

Alle data blev udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse (SD) fra mindst tre uafhængige forsøg. Forskelle mellem grupper blev vurderet af Students t-test. En sandsynlighed (p) 0,05 blev betragtet signifikant forskellige. Alle analyser blev udført ved hjælp af den statistiske software GraphPad Prism til Windows, version 3.00 (GraphPad Software, CA, USA).

Resultater

GEP er en hepatisk onkoføtalt protein

Tidligere , GEP mRNA blev rapporteret i embryonale mus leveren [13], men om GEP oversætter til protein og dets tid af switch-on /-off under leveren udvikling er fortsat ukendt. Da føtal lever har masser af hæmatopoietiske stamceller i tillæg til føtale hepatocytter, er vi nødt til at identificere den celletype (r), der udtrykker GEP. Her har vi beskrevet for første gang proteinet ekspressionsmønsteret for GEP i humane og muselevere. Ved immunohistokemisk farvning blev GEP protein påvist i mus og humane føtale lever, mens voksne lever var blottet for GEP-udtrykkende hepatocytter (figur 1A).

(A) Immunohistokemisk analyse viser GEP protein i føtale lever fra mus ( embryonal dag 17,5) og human (10 uger 6 dage), men ikke i voksne lever (forstørrelse x 400). (B) Flowcytometrisk analyser, der påviser ekspression af GEP og hepatisk stamcellemarkører i muse embryonale hepatocytter. Co-ekspressionen af ​​GEP og hepatiske stamcellemarkører CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin blev udført ved firedobbelt-farve flowcytometri, gating på AFP + og /eller albumin + hepatocytter af embryonale lever. Celler co-udtrykker de respektive markører er vist i øverste højre kvadrant af dot plots. Data er udtrykt som middelværdi procentdelen af ​​celler + SD.

I musemodel, for at skelne GEP-ekspression specifikt i hepatocytter, blev analyse af GEP niveau udføres af triple-farve flowcytometri, gating på AFP + og /eller albumin + for hepatocytter overhovedet udviklingsstadiet. Inddragelse af AFP + og /eller albumin + celler i alle udviklingsstadier ville bedre afspejle hepatocyt befolkning i leveren, fordi andelen af ​​AFP + celler og albumin + celler var forskellige i embryonale, neonatale og voksne lever (Figur S1). GEP udtryk steget gradvist fra embryonale dag E11.5 (14,8% + 6,9%) til E17.5 (30,8 + 9,2%). Umiddelbart efter fødslen, GEP niveau faldt brat fra dag 1 (4,4 + 1,5%) til Dag 7 (1,2 + 0,4%), og blev næsten upåviselig i voksne mus lever (0,9 + 0,4%) (figur S1). Sammen med vores tidligere resultater, GEP udtrykt i de fleste HCC prøver, men ikke i de tilstødende ikke-tumor levervæv [18], [19], vi bekræftet, at GEP var en hepatisk onkoføtalt protein.

Til karakterisere stamceller underskrift GEP + føtale hepatocytter, undersøgte vi co-ekspression af GEP og flere hepatisk stamcelle eller stamcelletransplantation-relaterede markører herunder CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin [21], [22], [23] [24] i de embryonale lever (figur 1B). Hepatoblasts ville have serielle ændringer langs udviklingsstadier og giver anledning til hepatocytter og cholangiocytes. På embryonal dag 11,5 (E11.5), udtryk for CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin var høj i de hepatoblasts og flertallet af GEP-positive celler co-udtrykte alle disse hepatiske stamcellemarkører. Ved E13.5, udtryk for CD133 og EpCAM begyndte at falde og det meste af CD133 + eller EpCAM + celler blev observeret at co-udtrykker GEP. For DLK1 og β-catenin, deres ekspressionsniveauer forblev høj ved E13.5 og størstedelen af ​​GEP-udtrykkende celler var også positive for begge markører. Ved E17.5, udtrykkene for CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin faldt til lave niveauer, mens GEP udtryk nået toppen på dette stadium. Forskellen af ​​udtryk tendenser mellem GEP og disse stamcelle markører kunne tilskrives de vækstfaktor egenskaber GEP. Mens yderligere undersøgelser for at belyse den mekanisme, der ligger til grund ekspressionsmønsteret for GEP, co-ekspression af GEP med disse hepatisk stamcelle eller stamcelle-relaterede markører foreslår en stamcelle-fænotype af GEP-udtrykkende celler.

Den GEP udtryk i mus hepatocytter blev undersøgt af vores hjemmelavede anti-GEP antistof A23. Specificiteten af ​​A23 blev undersøgt ved western blot (figur S2 og resultatet viste, at det kunne genkende musen GEP som enkelt bånd fra musen embryonale leveren proteinekstrakt. Desuden GEP ekspressionsmønster den som vist i western blot var konsistent med flow cytometri data i at GEP protein niveau steg fra E11.5 og E13.5 til E17.5, der giver konsistente data for at afspejle GEP udtryk i embryonale lever.

Fænotypisk karakterisering af GEP-udtrykkende celler i HCC

for bedre karakterisere hvis GEP-udtrykkende celler havde stamcelle ejendomme i HCC, undersøgte vi co-ekspression af GEP og et panel af stamceller markører ved hjælp af flowcytometri i menneskelig HCC cellelinjer Hep3B og Huh7. markører undersøges, er hæmatopoietisk precursor celleoverflademarkører CD31, CD34, CD117, hepatisk precursor celleoverflademarkør CD123, stængel celleoverflademarkører CD24, CD29, hepatisk CSC overflademarkører CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES-relaterede signalmolekyler β-catenin, Oct4, Nanog og Sox2, ABC narkotika transportører ABCC1 og ABCB5. Bemærk, at ABC narkotika transportører også blev medtaget, fordi både normale og cancer stamceller udtrykte højere niveau af ABC narkotika transportører, der bidrager til større modstand mod kemoterapeutiske stoffer end differentierede celler [4], [21]. Blandt markørerne, der undersøges, blev GEP + -celler vist sig fortrinsvis co-udtrykker med β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 og EpCAM sammenlignet med GEP- celler i både HCC-cellelinier Hep3B (fig S3) og Huh7 (figur S4 ). Vores resultater foreslog derfor en stamcelle funktion i GEP-udtrykkende celler i både embryonale og kræft leverceller.

GEP regulerer ekspressionen af ​​stamceller markører

Vi moduleret de GEP ekspressionsniveauerne i Hep3B celler ved transfektion tilgang og undersøgt hvis proteinet niveauer af stamcellemarkører ville blive ændret. Resultaterne viste, at opregulering af GEP niveau forstærket, mens undertrykkelse af GEP niveau faldt ekspressionen af ​​β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og ABCB5 (tabel 1). Modulation på GEP niveauer ikke ændret udtryk for hepatisk stamceller celleoverflademarkører CD133 og EpCAM. Årsagen kan skyldes det faktum, at størstedelen af ​​Hep3B celler var positive for CD133 og EpCAM (større end 95%), kan således ændring på ét molekyle (fx GEP) ikke kunne flytte befolkningen. Mens GEP tidligere er blevet rapporteret af vores gruppe at regulere ABCB5 at mediere kemoresistens i HCC-celler [25], den positive korrelation mellem GEP og β-catenin, Oct4, Sox2 og Nanog foreslog, at GEP kunne regulere ekspressionen af ​​disse ES-celle-relaterede signalmolekyler at opretholde pluripotens af stamceller.

for yderligere at validere den regulerende rolle GEP på ekspressionen af ​​disse signalmolekyler, GEP blokering af anti-GEP monoklonale antistof A23 blev udført i Hep3B celler ( tabel 2). A23 fandtes at reducere endogene GEP-niveauer i Hep3B celler. GEP blokering også betydeligt undertrykt udtryk for β-catenin, Oct4, Nanog og Sox2, hvilket bekræfter de lovgivningsmæssige rolle GEP på ekspressionen af ​​disse stamceller-relaterede signalmolekyler.

GEP-udtrykkende celler besidder CSC egenskaber

in vitro

for bedre karakterisere stamcelle egenskaber GEP-udtrykkende celler, GEP

høj og GEP

lave subpopulationer blev isoleret fra human lever cancer cellelinjer Hep3B, HepG2 og Huh7, og undersøgt for deres ekspression af stamcellemarkører anvendelse af flowcytometri. Celler blev sorteret baseret på overfladeekspression af GEP, men ikke i sig intracellulær ekspression, fordi permeabilisering ikke var muligt at holde cellerne levedygtige i efterfølgende funktionelle assays. Efter celleisolering blev 2 millioner af hver sorteret population indsamles til vurdering cellelevedygtigheden ved trypanblåt-farvning og renhed ved flowcytometri under anvendelse af en anden anti-GEP-antistof som genkendte forskellige epitoper fra de antistoffer, der anvendes til cellesortering. Renheden af ​​GEP

høje og GEP

lave subpopulationer var omkring 80% til 90%, henholdsvis som afsløret af post-sortering analyse (figur 2A). GEP

høje celler viste sig at udtrykke højere niveauer af ES-celler relateret signalmolekyler p-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og ABC drug transportør ABCB5 end GEP

lave modstykker i de tre HCC-cellelinier (figur 2B) . For hepatisk CSC overflade markør CD133, højere overflade udtryk i GEP

høje celler end GEP

lav modstykke blev fundet i HepG2 og Huh7, men ikke Hep3B, hvilket sandsynligvis skyldes den ekstremt høje niveau af CD133 ( 95 %) udtrykkes konstitutivt i Hep3B celler (data ikke vist). For EpCAM, blev højere overflade udtryk observeret i GEP

højt end GEP

ringe bestande i Huh7, men ikke Hep3B og HepG2, hvor størstedelen af ​​celler ( 95%) blev fundet at udtrykke EpCAM. Dataene er derfor i overensstemmelse med de tidligere resultater, der GEP-udtrykkende celler i forbindelse med stamceller markør udtryk sammenlignet med GEP negative celler.

(A) GEP udtryk i usorterede Hep3B, HepG2 og Huh7 celler, og frisk isoleret GEP

høj, og GEP

lave subpopulationer efter celle sortering. Celler blev sorteret baseret på overfladeekspression af GEP, men ikke i sig intracellulær ekspression, for at holde cellerne levedygtige i efterfølgende funktionelle assays. Efter celleisolering, 2 millioner af hver sorteret population blev opsamlet for at vurdere cellernes levedygtighed ved trypanblåt-farvning og renheden af ​​de sorterede subpopulationer ved flowcytometri under anvendelse af en anden anti-GEP antistof (genkende forskellige epitoper sammenlignet med antistofferne, der anvendes til cellesortering ). Data er udtrykt som middelværdi procentdelen af ​​GEP + celler ± SD. (B) Protein ekspressionsniveauer for stamcelle markører β-catenin, Oct4, NANOG, Sox2 og ABCB5 i de sorterede subpopulationer blev målt ved intracellulær farvning og flowcytometrisk analyse. Data er udtrykt som middelværdi procentdelen af ​​positive celler ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 sammenlignet med GEP

lave celler. (C) kolonidannelse effektivitetsgevinster af GEP

høje subpopulationer var højere end deres respektive GEP

lav og usorterede Hep3B og HepG2-celler. (D, E) Efter udsættelse for doxorubicin (0,5 mg /ml for 24 timer), GEP

høje subpopulationer bibeholdt betydeligt mindre doxorubicin og færre celle apoptose end GEP

lav og usorterede Hep3B og HepG2-celler. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001 sammenlignet med usorterede kontroller

for at bestemme om GEP-udtrykkende celler blev beriget for CSCS, vi sammenlignede tumorigent potentiale og stamceller egenskaber GEP

høje celler med deres kolleger

in vitro

i Hep3B og HepG2-celler, som repræsenterer høje og lave GEP-udtrykkende cellelinier hhv. Clonogenicity af cellerne blev vurderet ved kolonidannelse assayet. GEP

høje Hep3B celler var i stand til at danne signifikant flere kolonier sammenlignet med GEP

lave celler og usorteret kontrol. Lignende observationer blev vist med en uafhængig leverkræft celle HepG2 (Figur 2C).

For at undersøge, hvilken rolle GEP i kemoresistens, celler blev inkuberet med doxorubicin og vurderet for intracellulær akkumulering og celle apoptose. GEP

høje subpopulationer, i både Hep3B og HepG2-celler, viste signifikant lavere doxorubicin optagelse (figur 2D) og celle apoptose (figur 2E) sammenlignet med usorteret kontrol; mens GEP

lave subpopulationer viste øget doxorubicin optagelse og celle apoptose sammenlignet med usorterede befolkninger.

GEP

highABCB5 + celler demonstrerer højere kolonidannelse evne og kemoresistens

Ifølge CSC hypotese, CSCS kun udgør en sjælden population af tumor [4]. Dette indebærer, at GEP

høj subpopulation er stadig heterogen, og muligvis består af delmængder med differentierede tumorigene potentialer. Derfor søgte vi yderligere dissekere GEP

stor befolkning med yderligere co-udtrykkende markør.

I Hep3B celler, de fleste af ABCB5 + celler udtrykte GEP, men kun en delmængde af GEP + celler var ABCB5 + (figur 3A, venstre felt). Desuden har vi for nyligt vist, at ABCB5 regulerede hepatiske cancer stamcellemarkører CD133 og EpCAM [21]. Vi hypotese derfor, at GEP i kombination med ABCB5 kunne definere mere præcist leverens CSC befolkning.

(A) GEP og ABCB5 udtryk i usorterede Hep3B celler, og frisk isolerede GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- og GEP

lowABCB5- subpopulationer. Celler blev sorteret baseret på overfladen udtryk for GEP og ABCB5. Efter celleisolering blev 2 millioner af hver sorteret subpopulation indsamles til vurdering renhed ved flowcytometri ved anvendelse af forskellige anti-GEP og anti-ABCB5 antistoffer, som genkendte epitoper forskellige fra dem af antistofferne anvendes til cellesortering. Bemærk at de fleste ABCB5 + -celler blev også GEP +, således var der ingen GEP

lowABCB5 + -celler (venstre felt). Betyde procentdelen af ​​celler ± SD er vist i hver kvadrant. (B) kolonidannelse effektivitetsgevinster af GEP

highABCB5 + delpopulation var højere end GEP

highABCB5-, GEP

lowABCB5- og usorterede celler. (C, D) Efter eksponering for doxorubicin (0,5 ug /ml i 24 timer), GEP

highABCB5 + -celler bibeholdes signifikant mindre doxorubicin og færre celle apoptose end de andre subpopulationer. *

P

0,05, **

P

0,01 sammenlignet med usorterede kontroller; #

P

0,05, # #

P

0,01, # # #

P

. 0,001 mellem grupperne betegnet med vandrette linjer

Vi isoleret GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- og GEP

lowABCB5- celler fra Hep3B. Celler blev sorteret baseret på overfladeekspression af GEP og ABCB5, men ikke på deres intracellulær ekspression, fordi permeabilisering ikke var muligt at holde cellerne levedygtige i efterfølgende funktionelle assays. Efter celleisolering, blev sorteret subpopulationer vurderet for cellelevedygtighed ved trypanblåt-farvning og renhed ved flowcytometri under anvendelse forskellige anti-GEP eller anti-ABCB5 antistoffer som genkendte forskellige epitoper fra de antistoffer, der anvendes til cellesortering. Mindst 80% renhed blev opnået i hver delpopulation (figur 3A) og deres tumorigene potentialer blev undersøgt både

in vitro

in vivo

.

GEP

highABCB5 + celler viste induktion af det største antal kolonier, mens GEP

highABCB5- celler viste mellemliggende evne til at danne kolonier men stadig betydeligt højere end den usorterede kontrol. Vigtigere, GEP

lowABCB5- subpopulation var næsten ikke i stand til at danne kolonier (figur 3B).

Ved udsættelse for doxorubicin, GEP

highABCB5 + celler viste signifikant lavere niveau af doxorubicin optagelse og celle apoptose sammenlignet med GEP

highABCB5- celler og usorteret kontrol. Tværtimod GEP

lowABCB5- celler var meget følsomme over for doxorubicin i form af akkumulering og celleapoptose (figur 3C og D)

GEP

highABCB5 + -celler er mere tumorigene

in vivo

Tumor udvikling eksperimenter med GEP

highABCB5 + og GEP

lowABCB5- subpopulationer isoleret fra Hep3B celler blev udført i immunsvækkede nøgne mus. Alle mus injiceret med GEP

highABCB5 + celler udviklede tumorer. Mus injiceret med 1 x 10

6 dobbelt positive celler dannede tumorer indenfor 2 til 4 uger efter inokulering. Tværtimod kun 2/10 mus injiceret med GEP

lowABCB5- celler genereret relativt små tumorer og krævede længere latenstid (12 uger) (figur 4A og B).

(A) nøgne mus injiceret subkutant med GEP

highABCB5 + og GEP

lowABCB5- celler efter 8 uger. Højre panel viser de subkutane tumorer afledt af 2,5 × 10

5 GEP

highABCB5 + og 1 × 10

6 GEP

lowABCB5- celler i uge 16. (B) tumorfremkaldende i GEP

highABCB5 + og GEP

lowABCB5- celler.