PLoS ONE: Inddragelse af TGF-induceret Phosphorylering af PTEN C-terminalen på TGF-induceret Køb af Ondartede fænotyper i lungekræft Cells

Abstrakt

transformerende vækstfaktor β (TGF) afledt af tumormikromiljøet inducerer maligne fænotyper, såsom epitel-mesenkymale overgang (EMT) og aberrerende celle motilitet i lungecancere. TGFp-induceret translokation af β-catenin fra E-cadherin-komplekser i cytoplasmaet er involveret i transkription af EMT målgener. PTEN (phosphatase og tensin homolog udgår fra kromosom 10) er kendt for at udøve phosphataseaktivitet ved binding til E-cadherin-komplekser via β-catenin, og nylige undersøgelser viser, at phosphorylering af PTEN C-terminus hale kan forårsage tab af denne PTEN phosphataseaktivitet . Imidlertid, om TGFp kan modulere både β-catenin translokation og PTEN phosphataseaktivitet via phosphorylering af PTEN C-terminus stadig vanskeligt at definere. Endvidere har den rolle, phosphorylering af PTEN C-terminus i TGFp-inducerede maligne fænotyper ikke evalueret. For at undersøge om modulation af phosphorylering af PTEN C-terminus kan regulere maligne fænotyper, her etablerede vi lungecancerceller udtrykker PTEN-protein med mutation af phosphoryleringssites i PTEN C-terminus (PTEN4A). Vi fandt, at TGFp stimulation gav en to-fold stigning i den phosphorylerede -PTEN /PTEN ratio. Ekspression af PTEN4A undertrykt TGFp-induceret EMT og cellemotilitet selv efter snegl ekspression. Vores data viser, at PTEN4A kunne undertrykke EMT gennem fuldstændig blokade af β-catenin translokation ind i cytoplasmaet, foruden den inhiberende virkning af PTEN4A på TGFp-induceret aktivering af Smad-uafhængige signalveje. I en xenograftmodel blev tumorvækst forholdet undertrykt i celler, der udtrykker PTEN4A. Tilsammen tyder disse data, at phosphoryleringssites i PTEN C-terminalen kan være et terapeutisk mål for TGF-inducerede maligne fænotyper i lungekræft celler

Henvisning:. Aoyama D, Hashimoto N, Sakamoto K, Kohnoh T , Kusunose M, Kimura M, et al. (2013) Inddragelse af TGF-induceret Phosphorylering af PTEN C-terminalen på TGF-induceret Køb af Ondartede fænotyper i lungekræft Cells. PLoS ONE 8 (11): e81133. doi: 10,1371 /journal.pone.0081133

Redaktør: Yulia Komarova, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 8. maj 2013; Accepteret: 18 Oktober 2013; Udgivet: 22 november, 2013 |

Copyright: © 2013 Aoyama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Kowa Life Science Foundation og Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (21.590.987 og 24.591.162). Denne undersøgelse blev delvist støttet af en bevilling til den diffuse lungesygdomme Forskningsgruppen fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Montering tyder betydningen af ​​tumormikromiljøet hvori lungecancerceller interagerer med carcinom-associerede fibroblaster (CAF) og den ekstracellulære matrix (ECM) og dermed opnå forskellige maligne fænotyper, herunder epitel-mesenkymale overgang (EMT) og afvigende cellemotilitet [1,2]. Transformerende vækstfaktor β (TGFp), en af ​​de mest kritiske væv-afstivende elementer afledt af tumormikromiljøet, forårsager erhvervelse af maligne fænotyper, ledsaget af ændret ekspression af EMT-beslægtede gener såsom sneglen [3]. En nylig undersøgelse viser, at TGFp-induceret transkription af EMT target gener, såsom fibronectin og vimentin fremskyndes ved translokation af β-catenin fra E-cadherin-komplekser på cellemembranen ind i cytoplasmaet [4]. TGFp stimulering forårsager også aberrerende celle motilitet selvom Smad-uafhængige veje, såsom dem, der involverer fokal adhæsion kinase (FAK) og phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) [5,6]. Selv om mange SMAD-uafhængige veje i tumor mikromiljø negativt er reguleret af de samordnede lipid og protein phosphatase aktiviteter PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10) [7], lungekræft, hvor der sjældent observeres mutation af PTEN genet [8,9], der ofte viser hyperaktivering af disse veje [9-11]. Selvom PTEN udøver sin fosfatase aktivitet ved binding til E-cadherin komplekser via β-catenin [12], de seneste undersøgelser har antydet, at phosphorylering af PTEN C-terminale hale kan være tæt forbundet med tabet af PTEN aktivitet [13]. Rahdar et al. foreslået, at substitution med fire alanin (Ala) rester, hvilket resulterer i eliminering af de tilsvarende serin /threonin phosphoryleringssites (S380A, T382A, T383A, og S385A), øget membran associering PTEN med en åben konformation [14]. Nogle signaleringsveje kan modulere PTEN ekspression, hvilket resulterer i nedsat PTEN phosphataseaktivitet [15,16]; imidlertid, om TGFp kan modulere både β-catenin translokation og PTEN phosphataseaktivitet via phosphorylering af PTEN C-terminus stadig vanskeligt at definere. Endvidere er den nøjagtige rolle af phosphorylering af PTEN C-terminus i TGFp-induceret EMT og afvigende cellemotilitet har ikke helt blevet evalueret. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om TGFp kan modulere phosphorylering af PTEN C-terminus i lungecancerceller og om fire-Ala substitution på PTEN C-terminalen (PTEN4A) kunne inhibere TGFp-induceret EMT og relaterede aberrerende celle motilitet. Derudover undersøgte vi den underliggende mekanisme, det vil sige, hvorvidt PTEN4A kan modulere cadherin forbindelsesepitoper komplekser og signalveje. Vi evaluerede også virkningen af ​​den kompenserende induktion af PTEN4A på tumorvækst

in vivo

.

Materialer og metoder

Etisk Statement

Alle dyreforsøg er blevet gennemgået og godkendt af universitetet Udvalget om brug og pasning af dyr på Nagoya University Graduate School of Medicine.

De blev også udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Alle mus blev opstaldet individuelt i en steril barriere facilitet med fade-in /fade-out 12 timer lys: 12 timer mørke. Når mus blev aflivet efter forsøgene blev musene aflivet med anæstetisk overdosis, efterfulgt af øjeblikkelig cervikal dislokation, for at minimere lidelser.

Materialer

Monoclonal muse-anti-PTEN antistof (klon 6H2.1) var fra Cascade Bioscience (Winchester. Storbritannien). Oprenset kanin-anti-phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /Thr383) antistof, kanin-anti-pan Akt antistof, kanin-anti-phospho-Akt (Thr308) antistof, kanin-anti-phospho-Akt (Ser473) antistof, kanin-anti-FAK-antistof , kanin-anti-phospho-FAK (Tyr397) antistof, mus-anti-Smad2 antistof og kanin-anti-phospho-Smad2 (Ser465 /467) antistof var fra Cell Signaling Technology (Boston, MA). Oprenset anti-fibronectin-antistof var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Oprenset muse-anti-E-cadherin-antistof og anti-β-catenin antistof var fra BD Biosciences (San Diego, CA). Streptavidin (SAv) -Alexa 594 (SAv-594) -konjugeret anti-muse-antistof var fra Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Monoklonalt muse-anti-vimentin antistof var fra Millipore (Cambridge, England). Affinity-isoleret kanin-anti-actin-antistof og SB 431.542, en potent inhibitor af TGFp type I receptoren kinaser, var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kan få signal var fra Toyobo Co. (Tokyo, Japan). Doxycyclin var fra Clontech (Mountain View, CA). PhosSTOP og WST-1 var fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland). Hoechst33342 var fra Dojindo (Kumamoto, Japan). 1,2,4,5-Benzenetetramine tetrahydrochlorid (FAK inhibitor 14) var fra Tocris Bioscience (Bristol, Storbritannien).

plasmider og gen transfektion

Menneskelig PTEN (NM_000314) cDNA blev subklonet i pEGFP-C1 vektor (Clontech, Mountain View, CA). GFP eller en fusion-gen af ​​GFP-PTEN blev placeret i pTRE-Tight vektor (Clontech, Mountain View, CA), hhv. Den QuikChange mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA) blev anvendt til etablering af fire-Ala substitution (S380A, T382A, T383A, og S385A) på PTEN C-terminale hale (PTEN4A). Endelig GFP i pTRE-Tight vektor (GFP), GFP-PTEN i pTRE-Tight vektor (GFPPTENWt), og GFP-PTEN4A i pTRE-Tight Vector (GFPPTEN4A) blev etableret i denne undersøgelse. Efter etableringen af ​​H358 celler, human lungecancer-cellelinje, der bærer pTet-On Advanced (H358ON), GFP, GFP-PTENWt eller GFP-PTEN4A blev cotransficeret med Linear Hygromycin Marker (Clontech, Mountain View, CA) ved anvendelse Nucleofector ™ II (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Efter selektion med hygromycin, enkelte kloner blev isoleret. Menneskelig PTEN blev også placeret i pcDNA4 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). H1299 celler, den anden menneskelig lungekræft cellelinje, blev elektroporeret med pcDNA4 kun (4HC), pcDNA4 med PTENWt (PTENWt) eller pcDNA4 med PTEN4A (PTEN4A) ved hjælp Nucleofector ™ II. Efter selektion med zeocin blev enkelte kloner isoleret.

Celler

De humane lunge cellelinjer, H358 og H1299, blev opretholdt i RPMI suppleret med 2 mmol /L L-glutamin, 100 U /ml penicillin , 100 ug /ml streptomycin, 0.25μg /ml fungizon og 10% FCS [17]. For at evaluere effekten af ​​TGFp på disse celler, blev cellerne behandlet med TGFp ved 2 ng /ml og analyseret for mRNA niveauer og proteinniveauer i de angivne tidspunkter og som beskrevet nedenfor. For at evaluere effekten af ​​PTEN transduktion på TGFp stimulering blev H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A inkuberet med Dox ved 1 ug /ml i 24 timer før TGFp behandling som beskrevet ovenfor. For at undersøge de direkte virkninger af TGFp stimulering på modulering af p-PTEN /PTEN-forhold, blev celler inkuberet med vehikel eller SB 431.542 i 1 time før TGFp behandling. At undersøge, hvilken rolle FAK phosphorylering på TGFp-induceret EMT blev cellerne inkuberet med vehikel eller FAK-inhibitor 14 til 24 timer før TGFp behandling.

cellemigrationsassay

A 8-um porestørrelse Boyden kammer blev anvendt til in vitro migration assay [18]. Efter at være blevet behandlet med Dox i 24 timer blev cellerne (3×10

4 celler) i RPMI-medium indeholdende 0,5% serum og TGFp ved 2 ng /ml udpladet i det øverste kammer og 15% kalvefosterserum (FCS) i RPMI blev tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant.

PCR-analyse for ekspression af målrettede gener

Real-time PCR blev udført ved anvendelse af et TaqMan ABI 7300 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Sneglen (NM_005985), twist (twist1: NM_000474), og glyceraldehyder-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA’er blev påvist ved anvendelse af en blanding af oligonukleotidprimere og prober fra Nippon EGT, Inc (Toyama, Japan). mRNA niveauer blev normaliseret til GAPDH mRNA signal [19].

Western blot analyse

For hel-celle ekstrakter blev celler høstet i iskold lysisbuffer og klares ved centrifugering [20,21]. Prøverne blev derefter udsat for SDSPAGE og analyseret ved immunblotting. For at detektere phosphorylering niveauer af de målrettede proteiner, blev Phosphostop tilsat til lysisbuffer og kan få signal blev også tilsat til fortynding, opløsning primært antistof og sekundært antistof. β-actin blev evalueret som en loading kontrol.

WST-1 assay

celleproliferation reagens WST-1 blev anvendt til den kvantitative bestemmelse af celleproliferation [18]. Absorbansen af ​​prøverne blev målt ved 450 nm ved anvendelse af en spectrofluorophotometer (Wallac 1420 ARVO-SX; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). Medmindre andet er angivet, blev medium alene målt som en baggrundskontrol.

Immunofluorescens og konfokal laser scanning mikroskopi

Immunochtochemistry blev udført som tidligere beskrevet [22]. For at evaluere effekten af ​​PTEN4A transduktion på TGFp-induceret translokation af β-catenin, blev H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A inkuberet med anti-β-catenin antistof efterfulgt af SAv-594 konjugeret anti mus antistof. Nuklear farvning blev udført ved Hoechst 33342. For at bestemme niveauerne af β-catenin distribution, konfokal laser scanning mikroskopi (LSM 5 PASCAL; Carl Zeiss Co, Ltd, Jena, Tyskland) blev anvendt. Fluorescensintensiteterne af β-catenin og nucleus blev vurderet ved anvendelse af billedbehandlingssoftware (LSM Software ZEN 2008; Carl Zeiss Co, Ltd, Jena, Tyskland). For at udføre visuel observation af fluorescensen, blev fluorescerende intensiteter over en tilfældig tværsnit af cellerne afbildet [23,24]. For at bestemme niveauerne af PTEN subcellulær fordeling, blev konfokal laser scanning mikroskopi også udnyttes. Niveauerne af GFP-fluorescens i både cytoplasmaet og kernen intensitet blev også kvantificeret ved hjælp af imaging software. Et minimum på 5 tilfældigt udvalgte high-power felter blev undersøgt per prøve at måle fluorescensintensiteten i kernen og cytoplasmaet [25].

Mus xenograftmodel

3×10

6 H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFPPTENWt eller GFPPTEN4A, blev inokuleret subkutant (sc) i flanken af ​​6 uger gammel kvinde nøgen mus, og derefter holdes på vand med Dox ved endelig koncentration 2 mg /ml og autoklaveres foder ad libitum. Væksten blev fulgt over tid ved at tage tykkelsesmålinger på de angivne tidspunkter som beskrevet tidligere [26,27]. Hvert eksperiment anvendt 5 nøgne mus for GFPPTENWT, 7 nøgne mus for GFP, og 7 nøgne mus for GFPPTEN4A. Der blev udført tre uafhængige forsøg.

Statistisk analyse

Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney-test til sammenligning mellem to grupper, og af ikke-parametriske ækvivalenter af variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger. En værdi på p. 0.05was anses for at indikere statistisk signifikans

Resultater

TGFp modulerer phosphorylering niveauer af PTEN C-terminus i PTEN ekspression i H358 celler, efterfulgt af EMT og aberrerende cellemotilitet

for at evaluere TGFp-induceret EMT i lungekræft celler [28,29], western blotting analyse for fibronectin [4,30] og E-cadherin [4,29] blev udført. Western blotting-analyse viste, at TGF behandling inducerede en ca. 12-fold stigning i fibronektin udtryk i H358 naive celler i forhold til køretøjet, mens E-cadherinekspression i celler behandlet med TGFβdecreased med mere end 20% sammenlignet med patienter behandlet med køretøjet således, TGFp stimulering gav mere end en 15 gange højere fibronectin /E-cadherin-forhold i H358 naive celler sammenlignet med bærer (figur 1A). For at evaluere associationen mellem TGFp-induceret EMT og migration evne blev en migration assay udføres. H358 naive celler behandlet med TGFβat 2 ng /ml udviste en omtrent 20 gange større evne til at migrere mod en kemoattraktant, sammenlignet med patienter behandlet med vehikel (figur 1B). Nylige undersøgelser tyder på, at translokation af β-catenin i cytoplasmaet direkte inducerer

de novo

ekspression af mesenchymale gener i epitelceller [4,31]. Derfor lokalisering af β-catenin blev også vurderet i TGFp-behandlede lungecancerceller ved immunofluorescens. Immunofluorescens billeder opnået ved konfokal mikroskopi foreslået, at β-catenin blev lokaliseret på cellemembranen i H358 naive celler behandlet uden TGFp (figur 1C og 1D), hvorimod der blev observeret β-catenin translokation til cytoplasmaet i TGFp-behandlede H358 naive celler, ledsaget af co-lokalisering af β-catenin med Hoechst33342 (figur 1C og 1D). At evaluere TGF-induceret signalveje, blev western blotting udført. TGFp inducerede en stigning i Smad2 phosphorylering begynder ved 5 minutter og nåede et maksimum 1 time, hvorefter phosphoryleret Smad2 ekspression blev opretholdt på et stabilt niveau i op til 6 timer (figur 1E). For at evaluere effekten af ​​TGFp stimulering på Smad-uafhængige veje, blev aktivering af Akt og FAK også analyseret ved Western blotting. TGF behandling induceret stigende fosforylering af Akt på Thr308 og Ser473 (Akt308 og Akt473) begynder ved 20 minutter og nåede et maksimalt niveau på 1 til 3 timer (figur 1F); derimod var stigende phosphorylering af FAK på Tyr397 observeret ved 6 timer og nåede et maksimalt niveau med 12 til 24 timer (Figur 1G). Endvidere har vi vurderet virkningen af ​​TGFp på begge PTEN ekspressionsniveauer og phosphorylering af PTEN (p-PTEN) på sin C-terminus i lungecancerceller. Resultaterne viste, at TGFp behandling smule, men væsentligt øget phosphorylering af PTEN på dets C-terminus og faldt også total PTEN niveauer i H358 naive celler, hvilket således giver en to gange stigning i p-PTEN /PTEN forholdet 24 timer efter TGFp behandling ( Figur 1H). At vurdere, om TGFp direkte kan modulere p-PTEN /PTEN-forhold, blev H358-celler behandlet med SB 431.542, en potent inhibitor af TGFp type I receptor kinaser [32]. Behandling med SB 431.542 held inhiberede TGFp-inducerede stigning i p-PTEN /PTEN-forhold (figur 1 i), en opdagelse støttes af data, der viser, at behandling med 10 pM SB 431.542 inhiberede Smad2 aktivering (data ikke vist). Således kan en TGFp-inducerede stigning i p-PTEN /PTEN-forhold inddrages i TGFp-inducerede erhvervelse af maligne fænotyper i lungecancerceller.

(A) H358-celler behandlet med vehikel eller TGFp blev høstet til analyse af fibronectin og E-cadherin. Den relative ekspression af fibronectin til E-cadherin (F /E ratio) er vist i forhold til produktionen i celler behandlet med vehikel. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 (B) En migration assay blev udført for H358 cellelinien behandlet med vehikel eller TGFp. De viste data repræsenterer de middelværdier ± SD. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 Fluorescensintensiteterne af β-catenin (rød) i de behandlede celler blev vurderet ved anvendelse af konfokal laser scanning mikroskopi og billedbehandlingssoftware. Nuklear farvning blev udført ved Hoechst33342 (blå). Det venstre billede i (C) viser celler uden TGFp stimulation. Den rigtige billede i (C) viser celler stimuleret med TGFp. De celler inkuberet med isotype-matchet kontrol-IgG, er vist i det indsatte i (C). Den øvre panel i (D) plotter fluorescensintensiteten af ​​β-catenin (rød) og kerne (blå) i et tværsnit af celler uden TGFp stimulation. Den nedre panel i (D) plotter fluorescensintensiteten af ​​β-catenin (rød) og kerne (blå) i et tværsnit af cellerne stimuleret med TGFp. Disse tal er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (E, F, og G) Celleekstrakter blev høstet ved de angivne perioder efter behandling med TGF til analyse af indholdet af total og phosphoryleret Smad2 (E), Akt473 (F), Akt308 (F), og FAK (G). Resultater er vist for H358 naive celler ved 0 minutter (bane 1), 5 minutter (bane 2), 20 minutter (bane 3), 1 time (bane 4), 3 timer (bane 5), 6 timer (bane 6), 24 timer (bane 7) og 48 timer (bane 8) efter behandling med TGFp (til venstre i E, F og G). Forholdet mellem phosphoryleret protein til totalt protein præsenteres som intensiteten niveau i forhold til den for H358 naive celler ved 0 minutter (bane 1) efter behandling med TGFp (til højre i E, F og G). De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 (H) Celler behandlet med vehikel eller TGFp i 0 minutter eller 24 timer blev høstet til analyse af phosphoryleret PTEN (pPTEN) og total PTEN. Den relative ekspression af pPTEN til total PTEN (pPTEN /PTEN-forhold) er vist i sammenligning med den i cellerne behandlet med vehikel for 0 minutter. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”. (I) H358 naive celler blev inkuberet med vehikel eller SB 431.542 ved 10 pM i en time før TGFp behandling. pPTEN /PTEN-forhold er vist i forhold til produktionen i celler behandlet med vehikel. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”.

Mutation af phosphoryleringssites i PTEN C-terminalen undertrykker TGF-induceret EMT og-afvigelse celle motilitet i H358 celler

For at bekræfte de biologiske effekter af TGFp -induceret phosphorylering af PTEN C-terminus i lungecancerceller, undersøgte vi, om mutation af phosphoryleringssteder i PTEN kan påvirke både TGFp-induceret EMT og migrationen evne lungecancerceller ved anvendelse af en Dox-afhængig genekspression system, fordi flere PTENWt rekonstituering modeller har antydet, at PTENWt transduktion kunne fremkalde en langsom vækst forholdet i gliom celler [15]. Først at kontrollere, at fire-Ala substitution inhiberer phosphorylering af PTEN C-terminus i

de novo

PTEN-protein induceret af Dox blev western blotting udført på H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP -PTEN4A i fravær eller tilstedeværelse af Dox. Selvom

de novo

GFP-PTEN udtryk blev observeret i H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP-PTENWt eller GFP-PTEN4A da Dox blev tilføjet, phosphoryleret GFP-PTEN blev opdaget kun i H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP- PTENWt (figur 2A). Fordi de seneste undersøgelser tyder på, at phosphoryleret PTEN kan være genstand for ubiquitinering, hvilket resulterer i translokation ind i kernen [21], vi evaluerede lokalisering af GFP-fluorescens i H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A. GFP alene blev diffust udtrykt i både cytoplasmaet og kernen (til venstre i figur 2B og 2C), hvorimod GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A hovedsagelig var placeret i cytoplasmaet med svag nuklear ekspression (midterste og højre i figur 2B henholdsvis og 2C). Der var ingen forskel i kernen /cytoplasma ratio på GFP-fluorescens mellem GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A (Figur 2C). For at vurdere, hvorvidt TGFp-induceret EMT kan moduleres af

de novo

GFP-PTEN udtryk, blev western blotting analyse af fibronektin og E-cadherin udført. Der var ingen reduktion i fibronektin /E-cadherin forholdet i celler, der udtrykker GFP alene og en delvis reduktion (31,8%) i de udtrykker GFP-PTENWt; dog

de novo

GFP-PTEN4A protein induceret af Dox forårsagede et signifikant fald på omkring 75% i fibronektin /E-cadherin ratio (figur 2D). At evaluere, om GFP-PTEN4A kan påvirke TGFp-induceret cellemotilitet blev en migration assay udføres. I H358ON celler, blev TGF-inducerede stigning i migrering til en kemoattraktant ikke hæmmet af enten GFP eller GFP-PTENWt protein induceret af Dox, mens

de novo

GFP-PTEN4A protein undertrykt celle migration induceret af TGF stimulering ( Figur 2E). Disse resultater indikerer, at inhibering phosphorylering af PTEN C-terminus kan repressere TGFp-induceret EMT og blokere aberrerende celle motilitet i lungecancerceller, ud over virkningen af ​​PTEN transduktion selv observeret i celler, der udtrykker PTENWt.

(A) H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt eller GFP-PTEN4A blev inkuberet med køretøjet eller Dox til 24 timer før TGF behandling. Cellerne blev derefter behandlet med vehikel eller TGFp i yderligere 24 timer i fravær eller nærvær af Dox. Cellerne blev høstet til analyse af pPTEN (øverste panel), total PTEN (midterste panel) og β-actin (nedre panel) ved western blotting. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. (B) Ved anvendelse af konfokal laser scanning mikroskopi, lokaliseringen af ​​GFP-fluorescens i celler, der udtrykker H358ON Dox-behandlede GFP (venstre panel), GFP-PTENWt (midterste panel) og GFP-PTEN4A (højre panel) blev evalueret. (C) Niveauerne af GFP-fluorescens i både cytoplasmaet og kernen intensitet blev også kvantificeret ved Imaging software. Fluorescensintensiteten blev udtrykt som kernen /cytoplasma-forhold for hver prøve. De viste data repræsenterer de midler ± SEM fra tre uafhængige forsøg. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”. (D) H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A blev behandlet med vehikel eller TGFp til 48 timer i fravær eller nærvær af Dox, og derefter høstet til analyse af fibronectin, E-cadherin, og β actin ved western blotting. F /E ratio er vist i forhold til produktionen i celler behandlet med bærer i fravær af Dox. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”. (E) en migration assay blev udført for H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A i fravær eller nærvær af Dox og /eller TGFp stimulering. De viste data repræsenterer de middelværdier ± SD. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”.

Mutation af phosphoryleringssites i PTEN C-terminus inhiberer TGFp-induceret Smad-uafhængige veje, men ikke SMAD-afhængige vej i H358 celler

for at belyse de underliggende molekylære mekanismer, blev virkningen af ​​GFP-PTEN4A på TGFp-inducerede signalveje evalueret. Hverken

de novo

GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A ekspression induceret af Dox undertrykt stigningen i Smad2 phosphorylering i TGFp-behandlede H358ON celler (figur 3A). Stigningen i Akt fosforylering i TGF-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A tilbage til det basale niveau eller lavere, når Dox blev tilføjet, mens der i TGF-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP ikke forandring når Dox blev tilsat (figur 3B). Det skal bemærkes, at GFP-PTEN4A støt undertrykt phosphorylerede Akt niveauer sammenlignet med GFP-PTENWt (GFP-PTEN4A, 88% fald i Akt473 og 79% fald i Akt308; GFP-PTENWt, 74% fald i Akt473 og 68% fald i Akt308) (figur 3B). Niveauet af phosphoryleret FAK i TGFp-behandlede H358ON celler, der udtrykker enten GFP eller GFP-PTENWt blev ikke ændret ved Dox blev tilsat, hvorimod der i TGFp-behandlede H358ON celler, der udtrykker GFP-PTEN4A lykkes at returnere til det basale niveau, når Dox blev tilsat (figur 3C).

Celleekstrakter fra H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP, GFP-PTENWt eller GFP-PTEN4A i fravær eller tilstedeværelse af Dox blev høstet til analyse af indholdet af total og phosphoryleret for Smad2 (A), Akt473 (B), Akt308 (B), og FAK (C) på de angivne perioder efter behandling med køretøj eller TGFp (1 time for Smad2, en time for Akt473, en time for Akt308, og 24 timer for FAK, henholdsvis). En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist (øverst i A, B og C). Forholdet mellem phosphoryleret protein til totalt protein præsenteres som intensiteten niveau i forhold til det i H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP behandlet med bærer i fravær af Dox (nederst i A, B og C). De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”.

En FAK inhibitor målrettet Tyr397 blokerer TGF-induceret afvigende celle motilitet, men ikke TGF-induceret EMT i H358 celler

Fordi PTEN4A undertrykt niveauerne af phosphoryleret FAK på Tyr397 induceret af TGF, vi afgøres, om hæmning af TGF-induceret FAK aktivering kan redde EMT og blokere afvigende celle motilit. Først blev cellerne behandlet med FAK inhibitor 14, målretning af Tyr397-stedet i FAK [33], som med succes inhiberes TGFp-induceret FAK phosphorylering ved Tyr397 på en dosisafhængig måde (figur 4A). Hæmning af TGFp-induceret FAK aktivitet ved FAK inhibitor 14 gav undertrykt TGFp-induceret celle motilitet (figur 4C), men det påvirkede ikke købet af EMT fænotyper forblev vedvarende (figur 4B). Endvidere bekræftede vi, at TGFp-induceret β-catenin translokation i cytoplasmaet og kernen blev ikke blokeret ved behandling med FAK inhibitor 14 (figur 4D-4G).

For at undersøge, hvilken rolle FAK fosforylering på Tyr397 på TGF-induceret EMT blev Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP inkuberes med køretøj eller FAK inhibitor 14 til 24 timer før TGF behandling. (A) Celleekstrakter blev høstet 24 timer efter behandling med TGFp til analyse af indholdet af total og phosphoryleret FAK. Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP blev behandlet med vehikel (bane 1) eller TGFp (bane 2, 3, 4 og 5). Cellerne blev også inkuberet med vehikel (bane 1 og 2), eller FAK inhibitor 14 ved 0,1 nM (bane 3), 1 nM (bane 4) og 5 nM (bane 5) (øverst i A). Forholdet mellem phosphoryleret protein til totalt protein præsenteres som intensiteten niveau i forhold til det i Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP behandlet med vehikel (nederst i A). En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 (B) Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP blev behandlet med vehikel eller TGFp til 48 timer i fravær eller nærvær af FAK inhibitor 14 ved 5nM, og derefter høstet til analyse af fibronectin, E-cadherin og β-actin ved western blotting. F /E ratio er vist i forhold til produktionen i celler behandlet med vehikel (nederst i B). En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg er vist. De viste data repræsenterer middel ± SE. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. angiver “ikke signifikant”. (C) En migration assay blev udført for Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP behandlet med vehikel eller TGFp til 48 timer i fravær eller nærvær af FAK inhibitor 14 ved 5 nM. De viste data repræsenterer de middelværdier ± SD. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater. *: P 0,05 For at evaluere effekten af ​​FAK inhibitor 14 om lokalisering af β-catenin i Dox-behandlede H358ON celler, der udtrykker Dox-afhængig GFP behandlet med vehikel eller TGFp, blev intensiteterne af fluorescens af β-catenin i cellerne evalueret. Cellerne blev behandlet med vehikel (D og E) eller FAK-inhibitor på 5 nM (F og G). Det venstre billede i (D og F) viser celler uden TGFp stimulation. Den rigtige billede i (D og F) viser celler stimuleret med TGFp. De celler inkuberet med isotype-matchet kontrol-IgG, er vist i det indsatte i (D).