PLoS ONE: Hud Vaccination mod livmoderhalskræft Associated humant papillomvirus med en roman Micro-Projection Array i en musemodel

Der er behov for

Abstrakt

Baggrund

Bedre systemer levering til rutinemæssigt anvendte vacciner, for at forbedre vaccine optagelse. Mange vacciner indeholder alun eller alun baserede adjuvanser. Her undersøger vi en hidtil ukendt tør-overtrukket tætpakket mikro-projektion-array hudplaster (Nanopatch ™) som en alternativ leveringssystem til intramuskulær injektion til afgivelse af et alun adjuvans humant papillomvirus (HPV) vaccine (Gardasil®) almindeligt anvendt som en profylaktisk vaccine mod livmoderhalskræft.

Metodologi /vigtigste resultater

Micro-projektion arrays tør-belagt med vaccine materiale (Gardasil®) leveret til C57BL /6 mus øre hud frigivet vaccine inden for 5 minutter. For at vurdere vaccine immunogenicitet, doser svarende til HPV-16-komponenten i vaccinen mellem 0,43 ± 0,084 ng og 300 ± 120 ng (gennemsnit ± SD) blev indgivet til mus på dag 0 og dag 14. En dosis på 55 ± 6,0 ng leveret intrakutant af mikro-projektion-array var tilstrækkelig til at frembringe en maksimal virus neutraliserende serumantistofrespons på dag 28 efter vaccination. Neutraliserende antistoftiter blev opretholdt ud til 16 uger efter vaccination, og for sammenlignelige doser vaccine, blev noget højere titre observeret med intrakutan patch levering end med intramuskulær levering med nålen og sprøjten på dette tidspunkt.

Konklusioner /betydning

Brug af tørre mikro-projektion arrays (Nanopatch ™) har potentiale til at imødekomme behovet for en vaccine kølekæden for almindelige vacciner øjeblikket leveret af nål og sprøjte og for at mindske risikoen for nålestik skade og vaccine undgåelse grund af frygten for nålen især blandt børn

Henvisning:. Corbett HJ, Fernando GJP, Chen X, Frazer IH, Kendall MAF (2010) hud Vaccination mod livmoderhalskræft Associated humant papillomvirus med en roman Micro-Projection Array i en musemodel. PLoS ONE 5 (10): e13460. doi: 10,1371 /journal.pone.0013460

Redaktør: Sotirios Koutsopoulos, Massachusetts Institute of Technology, USA

Modtaget: Juli 21, 2010; Accepteret: August 16, 2010; Udgivet: 18 oktober 2010

Copyright: © 2010 Corbett et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Cancer Rådet af Queensland, University of Queensland, National Health og Medical Research Council (Australien) Tilskud ID # 569.726, ID # 456.150, Australian Research Council Grant ID # DP077464 og Queensland Smart State Scheme finansieret denne forskning. Professor Mark A. F. Kendall var modtageren af ​​en australsk Forskningsråd Future Fellowship. Professor Ian H. Frazer var modtageren af ​​en Queensland regerings Premiers Fellowship. The University of Queensland og professor Ian H. Frazer udlede royalty indtægter fra salg af HPV VLP-vacciner. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De fleste vacciner er i øjeblikket leveret af nål og sprøjte. Men som en enhed vaccine levering, kanyle og sprøjte har mange vigtige mangler. Disse omfatter potentiel overførsel af blodbårne sygdomme gennem stikskader [1] og genbrug af kanyler – ca. 30% af injektioner med henblik på vaccination i udviklingslande er usikker [2], og at stikskader forårsage mere end 500.000 dødsfald per år [3]. Needle-fobi og smerter forbundet med en intramuskulær injektion er også ulemper – det anslås, at nålen fobi er til stede i mindst 10% [4] af befolkningen, eller højere [5]. Musklen er også en yderst ineffektiv site for vaccination, da det ikke har en høj tæthed af antigen-præsenterende celler. I modsætning hertil er huden et attraktivt alternativ site for vaccination på grund af sin tætte net af potente antigenpræsenterende celler (APC’er), herunder Langerhans celler (LCS) [6], og mange sub-sæt dermale dendritiske celler (DDCS) [7] . Nærheden af ​​disse celler til hudoverfladen betyder det kunne være muligt at målrette dem på måder, der kan reducere smerte og potentiale for overførsel af blodbårne patogener. Mens kutan levering har et stort potentiale, det tætteste anvendte metode i øjeblikket i klinikken – intradermal injektion – er teknisk vanskeligt, hvilket nødvendiggør udvikling af avancerede metoder til målretning som revideret i [8], [9]

I denne undersøgelse a. roman hudplaster kaldet Nanopatch ™ anvendes til at målrette disse huden immunceller. Den Nanopatch ™ er en mikro-projektion array med unikt tætte projektion pakning ( 20.000 /cm

2) og korte fremspring (110 um i længden). Denne nål tæthed er designet sådan, at leverede vaccine har været co-lokaliseret med 50% skin immunceller – i både epidermis og dermis -. Efter kutan program uden at forlade sig på diffusion (se figur 1) [10]

A todimensionel opstilling af fremspring lokaliserer tørre overtrukne vacciner til lag af huden rig på immunceller. Når vaccine hydrater, det diffunderer gennem de levedygtige epidermis og dermis.

Tidligere studier med Nanopatch ™ immunisering har udnyttet ægalbumin og vaccine split influenza som antigener uden tilsætning af en adjuvans. Crichton et. al [11] viste høje antistoftitre efter en immunisering med under 2 ug via Nanopatch ™ ved hjælp af modellen antigen ovalbumin i C57BL /6 mus uden et løft ved hjælp 65 um lange Nanopatch fremskrivninger. Fernando et. al. [10] demonstreret induktion af beskyttende niveauer af funktionelle antistoffer mod influenza i mus med 110 um lange Nanopatch ™ fremspring (samme som anvendt i denne undersøgelse) ved anvendelse af en split-virus, vaccine uden adjuvans trivalent influenza (Fluvax 2008®); med en faktor 100 i leverede dosis-besparende, sammenlignet med kanyle og sprøjte. I disse tidligere undersøgelser, blev vacciner leveret uden adjuvans.

I den aktuelle undersøgelse, vi udvide til at udforske anvendeligheden af ​​Nanopatch ™ i at levere en alun adjuvans. Dette er vigtigt, fordi mange vacciner adjuveret -. Med Alum i den mest anvendte [12]

Faktisk indtil den nylige licensure af AS04, alun var den eneste adjuvans at blive godkendt af FDA [13] . AS04 er alun baseret, med tilføjelse af et lipid baseret toll-like receptor 4 agonist 3-O-desacyl-4′-monophosphoryllipid A (MPL) [14]. “Alum” er kemisk enten aluminium Oxyhydroxide eller aluminiumhydroxyphosphat. For nye teknologier til at udnytte øjeblikket licenseret vacciner, ideelt set bør man arbejde med alun-adjuvans vacciner. Hidtil har fast formulering arbejdet blevet udført med alun adjuvans til epidermal pulver immunisering (EPI) med hepatitis B [15], [16], [17], og difteri og tetanus toxoid [17]. Omfattende alun gel koagulation under tørring er mistænkt for at hæmme frigivelsen af ​​antigen sådan, at det er ikke godtgøres efter rehydrering [16], og tab af effektivitet er blevet rapporteret efter frysetørring eller nedfrysning [18], [19], [20]. For at minimere disse tab uden væsentligt at reducere mængden af ​​alun i den samlede faststof ( 1% [18])., Hurtig nedfrysning anvendes til at forhindre frysning koncentration af opløste stoffer i kombination med glasdannende excipienser

Dog i vores mikro-projektion belægning, en fastfrysning trin er ikke kun mere teknisk krævende, men har potentialet til at reducere den mekaniske integritet af det coatede lag. Belægningen skal være mekanisk stærk nok til at forblive fastgjort på p penetration, og forskellige termiske ekspansion egenskaber mellem de fremskrivninger og vaccinen kan forårsage revner eller delaminering af coatede lag, mens enheden er bragt til stuetemperatur.

Air tørring af alun formuleringer blev undersøgt i Maa et al [17], og viste sig at forårsage omfattende koagulation selv i nærvær af trehalose og /eller mannitol og /eller dextran. Som aktuelle coatingprotokoller er tættere på lufttørrende protokollerne beskrevet i [17] I modsætning til lyofilisering eller frysetørring forventes det, at vaccination med mikro-fremspring tør coatet med en alun formulering ville resultere i en dårlig immunrespons. I dette papir bruger vi opløselig polymer methylcellulose at reducere koagulering af gelen på dehydrering, og for at hjælpe med opløsning på rehydrering efter påføring.

Vores sygdom prøvesag for denne undersøgelse er humant papillomvirus (HPV), fordi – bortset fra den samfundsmæssige betydning af vaccinen – analyser til at måle virus neutralisering er veletablerede. Antigen struktur er vigtig for at rejse en virusneutraliserende antistofrespons [19], hvilket gør systemet følsomt over for forstyrrelser i antigen struktur, som kan være forårsaget af alun dehydrering under tør coating.

HPV-infektion er forårsagende i næsten alle tilfælde af livmoderhalskræft – med HPV-DNA til stede i 99,7% af cervikale carcinomer [20]. Vaccination blev muliggjort af moderne rekombinant protein ekspressionssystemer og opdagelsen af, at ekspression af L1-hovedcapsidproteinet alene tilstrækkelig til at medføre selvsamlende viruslignende partikler (VLP’er) [21], [22]. VLP er en tom viruspartikel -. Så det ikke indeholder det virale genom, som koder for de onkogene proteiner, som forårsager malignitet [23], [24], [25] i en naturlig infektion

Kommercielt tilgængelige vacciner Gardasil® [Merck] og Cervarix® [GlaxoSmithKline] demonstrerede fremragende profylaktisk tiltag i kliniske forsøg, forhindrer pre-maligniteter og efterfølgende kræftformer i næsten 100% i henhold-til-protokol analyser [26], [27], [28]. Begge vacciner indeholder en form for alun adjuvans. Immuniseringer er givet som tre doser i løbet af seks måneder. Disse vacciner er profylaktisk. HPV er den mest almindelige seksuelt overførte infektioner [29], og kumulativ infektion incidens over 2 år efter første samleje er ca. 30%, med brug af kondom ikke viser signifikant beskyttende virkning [30]. Vaccination skal ske før første samleje at være fuldt beskyttende. Mange nationer har nu nationale vaccinationsprogrammer rettet mod 11 og 12-årige piger. Dette har ikke været uden problemer. Masse besvimelse og hovedpine menes at være forårsaget af en nål fobi og massehysteri [31], og vaccination uden nåle kan forbedre vaccine optagelse og accept.

langtidseffekt af HPV-vacciner er vigtig. Mens forekomsten varierer med alderen, er forekomsten selv hos kvinder i alderen 40 og 49 anslås til 25,2% [32], så potentialet for infektion fortsætter over et helt liv. Varigheden af ​​beskyttelse er en væsentlig faktor i omkostningseffektiviteten af ​​HPV-vacciner [33], og eventuelle anden generations-vacciner skal demonstrere langvarig beskyttelse.

Intra-dermal injektion af Canine Mundtlige papillomavirus (COPV) L1-glutathion- S-transferase fusionsproteiner pentamerer – svarende til HPV pentamerer – har vist sig at være beskyttende i beagles ved 400 ng /hund [33]. Suzich, J.A., et al. [34] viste, at samles COPV-VLP resulterede i fuldstændig beskyttelse ved et dosisniveau 50 ng, og delvis beskyttelse på 0,125 ng hjælp af intra-dermal i beagler.

HPV VLP samles fra 72 pentamerer af L1-proteinet [35], [36]. Adskillelse af VLP’erne kan reversibelt udføres

in vitro

ved højt pH, lav saltkoncentration, og med tilføjelsen af ​​reduktionsmidler (fx pH 8,2, 0.166M NaCI med 2 mM DTT). Dialyse mod en pH 6,8 puffer med en saltkoncentration på 0,5-1 M resulterer i samlingen af ​​partiklerne [37]. Lenz, P., et al. [38] viser, at HPV16L1-VLP alene, men ikke deres konstituerende L1-pentamererne inducerer modning af dendritiske celler

in vitro

. Thones et. al. [39] anslår, at immunisering med L1-pentamerer også kræver 20-40 gange mere protein administreres til opnåelse lignende antistofrespons. Denatureret L1-protein ikke giver et virusneutraliserende antistofrespons [19], og mens tørre formuleringer kan betyde længere holdbarhed ved højere temperatur, kan en dårlig formulering forårsage betydelig nedbrydning af proteinprodukter. Egnede flydende formuleringer for HPV-VLP stabilitet er blevet defineret for både Gardasil [40] og Cervarix [41]. Som formuleringen har en indvirkning på samlingen af ​​VLP’erne (og potentielt strukturen af ​​kapsomerer selv) og VLP’er er mere immunogene end de capsomerer, formulering er vigtig for styrken af ​​en tør coatet vaccine. Begge vacciner en komponent af alun-adjuvans – Gardasil indeholder aluminiumhydroxyphosphat. Så vidt vi ved, har undersøgelser ved hjælp af faste formuleringer ikke blevet offentliggjort for HPV, eller HPV adsorberet til alun.

Nanopatch ™ design anvendt i denne undersøgelse anvender en 58 × 58 vifte af mikro-fremspring 110 um høje, og 30 um i bunddiameter, med en afstand på 70 um mellem projektion centre (se figur 2). Vaccine er tør belagt på mikro-fremskrivninger, som beskrevet i [42], og Nanopatches ™ anvendes på 2 ms

-1. Denne konfiguration giver materiale ind i epidermale og dermale lag af muse øre huden med en indtrængningsdybde på 42 um (SD = 9,9, N = 365), som bestemt ved billeddannelse af fluorescerende sporstof i cryo-snit musen ører som beskrevet i [11] , men med lignende fremskrivninger til dem anvendt i [10]

Sekundære elektron billeder viser overfladen morfologi mens tilbagespredte elektron billeder viser komposition -. med lave atomare masse elementer giver lavt signal – dvs. belagt område er mørkt i forhold til den ikke-coatede Nanopatch ™. Micro-fremskrivninger behandles i b) 800 ng, c) 80 ng, d) 8 ng og e) 0,8 ng af HPV-16 protein pr plaster. Mens nogle brodannelse forekommer i 800 ng gruppen (panel b – hvid pil)., Er belægning ses på den tilspidsede del af projektioner i alle dosisgrupper

I dette papir, vi demonstrerer tør belægning og frigivelse af en alun adjuvans HPV-VLP vaccine med Nanopatch ™. Vi demonstrerer derefter en efterfølgende immunrespons, som er langtidsholdbare, og neutraliserer virus til niveauer sammenlignelige med intramuskulær injektion med nål og sprøjte.

Resultater

Projektion morfologi tør belagt Nanopatches ™ er velegnet for nålepenetration

coatede plastre blev undersøgt ved scanningselektronmikroskopi (SEM) ved anvendelse af sekundær elektron og tilbagespredte tilstande (figur 2) for at undersøge fordelingen af ​​det overtrukne vaccine langs fremspring. Sekundær elektron tilstand viste overfladeform af de coatede nåle, mens tilbagespredt elektron-mode blev anvendt til kvalitativt bekræfte tykkelsen af ​​belægningen på grund af forskelle i den atomare masse af guld Nanopatch ™ overflade og overtrækket. Forsøg på at tørre pels alun adjuvans uden excipiens resulterede i minimal vaccine belægning på nålespidser, og krystallisation af alun adjuvans (Figur S1). Derfor har vi tilføjet methyl-cellulose til at stabilisere vaccinen og forbedre coating morfologi (figur 2). En betydelig del af overtrækket blev lokaliseret til den tilspidsede del af fremspringene. Dette kan ses i de sekundære elektron billeder ved forskellen i morfologi før og efter belægning, og i de tilbagespredte elektronbilleder af de mørke signal på projektion tips. I 800 ng gruppen, blev nogle bro mellem fremskrivninger observeret i visse områder af Nanopatches ™ (angivet med pilen i figur 2b) formentlig på grund af den højere koncentration af vacciner end i andre grupper.

Vaccine er frigivet fra projektion tips, og bulk levering effektivitet er i overensstemmelse med forventningerne baseret på belægning morfologi og penetration af data

Tifold seriefortyndinger af Gardasil® blev forberedt og 14C mærket ovalbumin tilføjet som et sporstof til hver prøve, belagt på Nanopatches ™ og påført på den ventrale øreflip af C57BL /6-mus (N = 5 pr dosisgruppe) som angivet i Materialer og Metoder. En massebalance hjælp af radiomærkede tracer blev udført mellem det samlede coatede mængde, og det, som blev leveret i øret huden, efterlades på Nanopatch ™, eller deponeres på overfladen af ​​huden. Effektivitet af udgivelse var: 19% (SD = 7,5), 34% (SD = 4,7), 36% (SD = 10), og 27% (SD = 5,2) for 800 ng, 80 ng, 8 ng og 0,8 ng af belagt HPV-16 henholdsvis (se figur 3).

frigivelse blev bestemt ved massebalance, og varierede mellem overtrukne beløb med et gennemsnit på 19%, 34%, 36% og 27% for formuleringerne anvendt for 800 ng, 80 ng, 8 ng og 0,8 ng af belagt HPV-16 pr Nanopatch ™.

levering procentdele blev derefter anvendt til at beregne effektive doser ved at multiplicere levering effektivitet ved den overtrukne mængde. Levering beløb blev anslået til 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6), og 0,43 ng (SD = 0,084) af HPV-16L1.

Nanopatches ™ post-ansøgning blev også visualiseret med SEM for at afgøre, om nogen belægning løsning var stadig på fremskrivninger. molekylære lav masse materiale blev fundet på bunden i nogle tilfælde, men sjældent på projektion tips (Figur S3)

Nanopatch ™ vaccination fremkalder langvarig virusneutraliserende immunrespons, der kan sammenlignes med intramuskulær

Nanopatch ™ doser blev fordelt over hvert øre (dvs. et plaster pr øre), og administreret på dag 0 og igen på dag 14. Sera blev indsamlet på dag 28 og dag 112 efter vaccination for at undersøge den umiddelbare reaktion, og på længere sigt vedvarende antistoffer indlæg vaccination. Sera blev analyseret for evne til at neutralisere HPV-virus med pseudovirion-baserede neutraliseringsassay (PBNA) (figur 4). blev anvendt en ikke-underlegenhed analyse (materialer og metoder) ligner tidligere human papillomavirus immunisering sammenligning undersøgelser [43].

Nanopatch ™ doser var 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6) og 0,43 ng (SD = 0,084). Intramuskulære doser var 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng og 1 ng. På dag 28, har Nanopatch ™ 300 ng og 55 ng dosisgrupper nået sammenlignelige virusneutraliserende titre til alle intramuskulære injektion grupper (p 0,05). Ved dag 112, har alle Nanopatch ™ doser nået sammenlignelige neutraliserende titre mod alle intramuskulær injektion grupper (p 0,05). Gentagelser er forskudt i x-aksen til støtte i visualisering. Immuniserede plottet i en dosis på 0,05 ng grund logge skala.

På dag 28 efter immunisering, titre i 300 ± 120 ng og 55 ± 6,0 ng dosis Nanopatch ™ grupper var ikke ringere end til alle intramuskulære doser (p 0,001) med geometrisk middeltiter (GMT) af 30500 og 26000 (figur 4). I hver af de 5,7 ± 1,6 ng og 0,43 ± 0,084 ng dosisniveau Nanopatch ™ grupper to mus ikke serokonverterer.

neutraliserende antistoffer blev titreret på dag 112 efter immunisering (figur 4) for at etablere langsigtede virkningsfuldhed. På dag 112 efter immunisering, viste alle Nanopatch ™ grupper 100% serokonversion. På dag 112, alle Nanopatch ™ doser var ikke ringere end for alle intramuskulære doser (p 0,05).

Når man sammenligner reaktionen på dag 112 og dag 28 inden for hver gruppe (figur 4), dagen 112 titer opfyldte ikke ikke-mindreværdskomplekser kriterier mod dag 28 titer i både 100 ng og 1 ng intramuskulære grupper (forholdet mellem titre: 100 ng 90% CI (0,40, 1,2), og 1 ng 90% CI (0.39,1.2) ). I modsætning hertil inden gruppe Nanopatch ™ titer sammenligninger viste titre på dag 112 var non-inferior i alle tilfælde, og overlegen på dosisniveau 0,43 ± 0,084 ng, med dagen 112 titer være 1.2-5.8 gange højere end dag 28 titer ( p 0,05) på samme dosis

diskussion

Dette papir demonstrerer effektiv belægning og frigivelse af en alun vaccine Gardasil® fra en ny mikro-projektion vifte patch (Nanopatch ™) designet til. levere vaccine direkte til omkring 50% af de rigelige hud antigenpræsenterende celler [10], til effektiv induktion af en virusneutraliserende antistofrespons.

Frigivelse varierede mellem dosisgrupper effektivitet. Det forventes, at dette er primært afhængig af belægning morfologi. Dette understøttes af vores teoretiske levering forventninger (figur S2). Vores forudsagte udgivelser (Figur S2) sammenlignet med målte frigivelse var mest præcise inden de laveste dosisgrupper. Vi over-forudsagde frigivelsen i de højeste dosisgrupper. Denne forskel er sandsynligvis skyldes bygge bro mellem fremspring og overdreven belægning på bunden af ​​Nanopatches ™ (figur 2b), hvilket fører til spild af coating-opløsning. Siden belægning på basen og bygge bro projektioner blev ikke tegnede sig for i beregningerne, når disse beløb er væsentlige, vil det resultere i en overvurdering af leverede beløb som de teoretiske beregninger kun var baseret på belægning løsning på fremskrivninger. Denne brodannelse vil sandsynligvis kunne afhjælpes ved tilsætning af et overfladeaktivt middel i senere formuleringer. Disse data samt de indlæg ansøgning billederne viser, at frigivelsen fra fremskrivningerne er færdig, og dermed med fremskridt inden for coating teknologi til isolering belægning udelukkende til dele af fremskrivningerne som trænger huden, komplet release 100% effektivitet er muligt med disse formuleringer.

Hurtig frigivelse forventes at hjælpe med at sikre konsekvent vaccinedosis er leveret, da det er lettere at sikre overholdelse af immunisering protokollen. En observationsperiode på 15-20 minutter efter en standard intramuskulær immunisering anbefales generelt som mest anafylaktisk shock vil forekomme inden for denne periode [44]. Frigivelse af den tørre coatede vaccine fra Nanopatch ™ forekom inden for fem minutter -. Derved let opfylder observationsperiode retningslinjer

For at vise, at virus neutraliserende antistoffer blevet rejst, serum blev screenet af pseudovirion-Based neutraliseringsanalyse (PBNA) – betragtes som den “gyldne standard” i WHO retningslinjer for HPV-vacciner [45], [46]. Dette assay måler effektiviteten af ​​antistoffer eller andre forbindelser til at blokere optagelse af HPV-virus ind 293TT celler [47]. Dette er væsentligt, da beskyttelsen menes at være et resultat af antistof-medieret virus neutralisering [48], [49]. Fremgangsmåden fjerner også forspændingen af ​​anvendelse af det samme materiale til både immunisering og immunologisk assay, som forekommer, når ELISA anvendes. Assay signal kun genereres af intakte pseudovirioner, der efterligner den native virus, således enhver immunreaktion dannet mod kontaminanter eller denatureret protein vil ikke påvirke resultaterne af neutraliseringen assay. Nanopatch ™ immunisering med 0,43 ± 0,084 ng af HPV-16 resulterede i virusneutraliserende respons på dag 112 efter vaccination. Dette indebærer, at det tørre coatede L1-protein fastholder nogle native virus-lignende struktur. Vi spekulere, der kan have været en grad af adskillelse af VLP’er i pentamerer. Denne påstand er baseret på vores lignende undersøgelser ved hjælp af virale vektorer (upublicerede data). På grund af den øgede immunogenicitet VLP i sammenligning med pentamerer, hvis afmontering i pentamerer øjeblikket opstår under tør-coating, en stor stigning i aktivitet sandsynligvis gennem reformulering yderligere bevare VLP struktur.

Mens tidlige resultater viste kun 50% serokonversion i 5,7 ± 1,6 ng og 0,43 ± 0,084 ng Nanopatch ™ grupper fordele bliver klarere ved terminalen bløder, når alle mus har sero-konverteret. Ved de lavere doser begyndte intramuskulær at vakle, med titere af to mus slippe under detektionsgrænsen. Det er muligt, at Nanopatch ™ immunisering med alun indeholder vacciner, har kinetik langsommere frigivelse sammenlignet med intramuskulær administration – på grund af den forskellige administration stedet og en større depot virkning fra dehydreret alun. Mens ekstremt lave doser af HPV-VLP vises immunogene intramuskulært i mus, doser for mennesker i de godkendte vacciner er i 20-40 ug interval pr subtype. kinetik med langsom frigivelse kan gunstigt ændre immunologiske resultater og bidrage til at nå optimal aktivering af APC’er uden behov fysisk med flere doser. Yderligere arbejde er forpligtet til at undersøge dette.

Tidligere undersøgelser af intradermal immunisering med COPV [33], [34] udnyttet en ELISA-assay, så en direkte sammenligning med vores resultater er ikke mulig. Suzich et al [34] undersøgte intradermal levering af samlet COPV-VLP og opnåede delvis beskyttelse ved sub-nanogram dosisniveau. Til sammenligning, en senere undersøgelse af Yuan, et. al. [33] med intradermal indgivelse af COPV-L1-GST-fusionsprotein (ikke samle sig til VLP’er) viste ingen detekterbar reaktion ved ELISA under en 400 ng dosis. Dette arbejde fokuserer på montage inkompetente pentamererne som et billigt alternativ til VLP. I begge tilfælde blev delvis beskyttelse bemærket mod belastning, selv når antistoffer ikke blev detekteret. Nanopatch ™ immunisering med vaccine split virion influenza giver overlegen dosisreduktion mod intramuskulær [10] i forhold til, hvad der er blevet påvist i intradermal administration [50]. Hvis demontering af HPV-VLP der sker i vores Nanopatch ™ tør coating, det tætteste effektive dosis sammenligning er med arbejdet i Yuan et al. Dette tyder på, at Nanopatch ™ immunisering kan give øget immunogenicitet i en direkte sammenligning med intradermal administration (og dermed formentlig intramuskulær administration) i L1-pentamerer. Men med den eksisterende godkendte vacciner er VLP baseret, vil omformulering for at bevare VLP integritet være i fokus i det fremtidige arbejde

Vores analyser release måle andelen af ​​belægning, som frigives ind i huden -. De måler ikke hvad andelen af ​​antigen effektivt frigjort fra alun, eller dens konformation ved frigivelse. Hvis alun gelen koaguleres, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [17], antigen kan ikke undslippe den sammenklappede alun matrix – og dermed reducere den effektive dosis. Denne effekt kan faktisk ophæve eventuelle adjuvans fordele alun ellers giver, selv om yderligere undersøgelse er nødvendig for at bestemme, i hvilket omfang den alun matrix hæmmer frigivelsen, og dens indvirkning. Fremtidige arbejde vil undersøge proteinstruktur og koagulation af alun samt excipienser for at reducere den. Som HPV-L1-VLP’er er meget immunogene selv uden adjuvans, vil formuleringer uden alun også undersøges. Vi spekulere, at med forbedrede formuleringer, kan Nanopatch ™ immunisering i sidste ende betyde lavere doser af alun adjuvans VLP kan anvendes til at fremkalde en varig immunrespons i mennesker.

Det fremtidige arbejde vil fokusere på at forbedre dosis sparing i Nanopatch ™ immunisering, og efterforske termostabilitet. Til dette formål, tørre belagt VLP integritet, udforske ikke-adjuverede VLP’er og forbedre formuleringer vil blive undersøgt.

Materialer og metoder

Etik Statement

blev udført Alle eksperimenter dyr i henhold til den University of Queensland dyreetiske regler.

Nanopatch ™ Fabrication

Nanopatches ™ blev fabrikeret af Deep Reactive Ion ætsning ifølge patent [51] i Rutherford Appleton Laboratory, Oxford, UK. Nanopatches ™ blev sputter coatet med guld i en tykkelse på 100 nm. Ensartet morfologi blev bekræftet ved scanning Electron Microscopy (SEM) på en Philips XL30. Prøver blev vippet ved 45 ° for at bekræfte passende projektionsprofil.

Nanopatch ™ Coating

Gardasil® (Merck, USA) blev centrifugeret ved 5000 g i 15 minutter for at pelletere alun med det adsorberede virus lignende partikler. Supernatanten blev fjernet og pelleten resuspenderet i methylcellulose til en slutkoncentration på 10 ug /pi methylcellulose og 100 ng /pi HPV-16-VLP. Ti-gange serielle fortyndinger blev fremstillet i 10 ug /uL methylcellulose at formulere forskellige doser. Methocel® 60 HG – Methyl-cellulose (cat # 646.555) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australien)

Nanopatches ™ med 110 um lange nåle blev coatet ved pipettering 8 pi coatingopløsning på. overfladen og tør coating via nitrogen jet som tidligere beskrevet [42]. Passende belægning morfologi blev bekræftet ved SEM.

Nanopatch ™ Vaccination

Fire grupper (N = 5) af kvindelige C57BL /6 mus ved 6 wks gamle blev bedøvet med Ketamil® og Xylasil®. Mus blev derefter patched én gang i hvert øre på den ventrale side anvendelse af en fjeder anordning at anvende plasteret på 2,0 ms

-1 – en hastighed vist sig at give maksimal nålepenetration uden at beskadige væv (data ikke vist). Doser angivet i dette dokument henviser til det samlede HPV-16-dosis for hver immunisering fordelt over to Nanopatches ™, og mus blev immuniseret på dag 0 og boostet på dag blev afholdt 14. Patches in situ i 5 minutter. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Health og Medical Research Council (Australien). Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg fra University of Queensland (Permit Antal AIBN /020/10 (NF)). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

intramuskulære injektioner

Gardasil® doser blev koncentreret ved centrifugering ved 5000 g i 15 minutter. Overskydende supernatant blev fjernet og pellet blev resuspenderet i den passende mængde af supernatanten til opnåelse af en HPV-16-VLP koncentration på 0,2 ug /uL. Fire 10-fold seriefortyndinger blev fremstillet i overskydende supernatant.

Fem grupper (N = 5) af C57BL /6-mus efter 6 wks gamle blev immuniseret intramuskulært på dag 0 og boostet på dag 14 med 25 pi fremsat ca. 2 mm i hvert caudale muskel i bagbenet med hver gruppe, der fik 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng, eller 1 ng af HPV-16 pr mus per immunisering.

applikation

Aktuel kontrol: En gruppe (N = 5) af C57BL /6-mus efter 6 wks gamle blev bedøvet med ketamil og xylasil. Mus blev tilbageholdt med ventrale øre overflade flad, og 125 pi Gardasil® (indeholdende 10 ug af HPV-16) blev påført topisk i fem minutter

Fluvax immuniseret kontrol:. En gruppe (N = 5) af C57BL /6 mus ved 6 wks gamle blev bedøvet med Ketamil® og Xylasil®, og immuniseret intramuskulært med 6 ug Fluvax 2008® (CSL Ltd, Melbourne, Australien) i et volumen på 30 pi.

immuniserede kontrolgruppe : En gruppe (N = 5) af C57BL /6-mus efter 6 ugers blev bedøvet med Ketamil® og Xylasil® og aflivet umiddelbart efter ophør af reflekser ved hjertepunktur

Sera samling

Blood. prøver blev opnået på dag 28 og 112 efter vaccination ved retro-orbital blødninger, og serum separeres. Sera blev opbevaret ved -20 ° C indtil analyse.

Scanning Electron Microscopy (SEM)

Prøver blev undersøgt i sekundær elektron og tilbagespredt elektron tilstande i et Philips XL30.