PLoS ONE: Sulindac Forbedrer Drab på Cancer celler udsat for Oxidative Stress

Abstrakt

Baggrund

Sulindac er en FDA-godkendt non-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel (NSAID), der påvirker prostaglandin ved at hæmme cyclooxygenaser (COX) 1 og 2. sulindac har også været af interesse for mere end ti år som kemopræventivt for adenomatøse colorektale polypper og tyktarmskræft.

vigtigste resultater

Forbehandling af menneskelige kolon og lungecancerceller med sulindac forbedrer aflivning af et oxidationsmiddel såsom tert-butylhydroperoxid (TBHP) eller hydrogenperoxid. Denne effekt indebærer ikke cyclooxygenase (COX) hæmning. Men under de anvendte betingelser, er der en betydelig stigning i reaktive oxygenarter (ROS) inden cancercellerne og et tab af mitochondriemembranpotential, hvilket antyder, at celledød skyldes apoptose, hvilket blev bekræftet ved Tunel assay. I modsætning hertil var dette forstærkede drab ikke observeret med normale lunge- eller colon celler.

Signifikans

Disse resultater indikerer, at normale celler og cancerceller håndtere oxidativt stress på forskellige måder og sulindac kan forbedre denne forskel. Kombinationen af ​​sulindac og en oxiderende agent kunne have terapeutisk værdi

Henvisning:. Marchetti M, Resnick L, Gamliel E, Kesaraju S, Weissbach H, Binninger D (2009) Sulindac Forbedrer Drab på Cancer celler udsat for Oxidativt stress. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10,1371 /journal.pone.0005804

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: 10. februar, 2009; Accepteret: 11 maj 2009; Udgivet: 5 juni 2009

Copyright: © 2009 Marchetti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en center of Excellence i biomedicinsk og Marine Biotechnology tilskud fra staten Florida (tilskud 1140-190-43 tildelt DB og HW). Yderligere støtte fra National Institutes of Health (1 R15 CA 122001-01A1 tildelt HW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sulindac var en af ​​de tidlige ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), som påvirker prostaglandin ved at hæmme cyclooxygenaser (COX) 1 og 2 [1]. For mere end et årti har sulindac også været af interesse som et kemoforebyggende behandling for adenomatøse colorektale polypper og tyktarmskræft [2] – [5], især hos patienter med familiær adenomatøs polypose [6]. Sulindac er også blevet rapporteret som et kemoforebyggende middel til mus urinblære kræft [7]. Den anti-tumorigen aktivitet sulindac mod tyktarmskræft kan involvere både COX-hæmning [2], og aktiviteter, der er uafhængige af COX-hæmning [8] – [11]. Det er blevet rapporteret, at sulindac inducerer apoptose af tyktarmskræft celler, [11], [12], som synes at involvere ændringer i genekspression [12] – [18].

Sulindac er et pro-drug, som skal konverteres til den aktive COX-inhibitor, sulindac sulfid [19]. Vi har tidligere vist, at omdannelsen af ​​sulindac til sulindac sulfid kan katalyseres af MSRA, et medlem af methioninsulfoxid reduktase (MSR) familie af enzymer [20]. MSR system er blevet undersøgt i detaljer i de seneste år, efter at det blev vist, at MSRA kan spille en rolle i aldring og aldersrelaterede sygdomme [21] – [23]. Det indlysende funktion af MSR-systemet er at reducere methioninsulfoxid (Met (O)) i proteiner tilbage til methionin (Met) (gennemgået i [23]), selv om den også fungerer som en del af et ROS scavenger-system, hvor MSR tillader det Opfyldt rester i protein til at fungere som katalytiske antioxidanter [24]. Støtte til scavenger rolle MSRA er kommet fra nylige forsøg med både PC-12 neuronale celler, i hvilke MSRA blev overudtrykt [25], og humane linse celler, i hvilke MSRA ekspression blev nedreguleret [26]. Således er der stor grund til at formode, at MSR-systemet spiller en vigtig rolle i at beskytte celler mod oxidative skader.

Da sulindac er et substrat for MSRA [20], det syntes rimeligt, at drab på kræftceller ved sulindac kan indebære oxidativt stress. Derudover ønskede vi at bestemme, om normale celler og cancerceller reagerede på en lignende måde (r) efter sulindac behandling og oxidativ stress. I en indledende undersøgelse viste vi, at behandling af en pladecellekræft cellelinje med sulindac og et oxidationsmiddel førte til næsten en stigning i intracellulære ROS-niveauer og betydelig celledød 500%. I modsætning hertil normale humane epidermale keratinocytter ikke viser en stigning i ROS niveauer eller celledød. Disse resultater førte til en begrænset klinisk forsøg, der viste lovende potentiale for at bruge topisk anvendelse af sulindac og hydrogenperoxid til behandling af aktiniske keratoser [27].

I de foreliggende undersøgelser, vi udvidet disse tidligere resultater ved hjælp af kræft cellelinjer afledt fra lunge- og colon væv. Vi giver yderligere beviser, at den øgede drab observeret med sulindac og oxidativt stress involverer mitokondriel dysfunktion fører til celledød via apoptose. Disse nye data styrker potentialet til specifikt at forbedre den terapeutiske anvendelse af sulindac og dets derivater til kræftbehandling ved at anvende dem i forbindelse med en forbindelse, der producerer reaktive oxygenarter (ROS).

Resultater Salg

sulindac øger drab af tumorceller ved oxidativ stress, men involverer ikke enten COX inhibering eller MSR-systemet

human lunge og colon cancer cellelinjer blev præinkuberet i nærvær eller fravær af sulindac i 48 timer. Overskydende sulindac blev fjernet ved vask forud for 2 timers inkubation med TBHP som beskrevet i Materialer og Metoder. Sulindac blev anvendt ved 500 pM slutkoncentration da indledende eksperimenter under anvendelse sulindac ved denne koncentration udviste ingen signifikant virkning på cellelevedygtigheden for nogen af ​​cancercellelinjer.

Hver cancercellelinie havde et markant fald i cellelevedygtighed i tilstedeværelse af TBHP efter forbehandling med 500 pM sulindac (figur 1A og 1B). Levedygtighed lungecancerceller forbehandlet med sulindac blev reduceret med mere end 80% efter inkubation i 2 timer med 240 uM TBHP sammenlignet med kontrolceller, der ikke var forbehandlet med sulindac (figur 1A). Lignende reaktioner på TBHP blev observeret med sulindac behandlet colon cancerceller (figur 1b), selv om en højere koncentration af TBHP var nødvendig for signifikant drab af de coloncancerceller. Sulindac forbedret også drab på begge cancercellelinier når TBHP blev erstattet med hydrogenperoxid, ved koncentrationer mellem 1,0 mM og 6,0 mM (figur 2).

lungecancerceller (A) eller coloncancer-celler (B) blev inkuberet i nærvær (▪) eller fravær (□) på 500 pM sulindac i 48 timer. Celler blev derefter vasket for at fjerne det frie sulindac før inkubering i 2 timer med den angivne koncentration af TBHP og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af MTS-assayet beskrevet i Materialer Metoder. Cellelevedygtighed udtrykt som% af kontrol (celler ikke forbehandlet med sulindac eller udsat for TBHP). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt i% af middelværdien af ​​fire gentagne prøver fra et repræsentativt eksperiment. Betydningen af ​​forskellene mellem celler behandlet med og uden sulindac, men udsat for samme koncentration af TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001

Lunge cancerceller (A) eller kolon kræftceller (B) blev inkuberet i nærvær (▪) eller fravær (□) på 500 pM sulindac for 48 timer.. Celler blev derefter vasket for at fjerne det frie sulindac før inkubering i 2 timer med den angivne koncentration af hydrogenperoxid. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af MTS-assayet beskrevet i Materialer Metoder. Cellelevedygtighed udtrykt som% af kontrol (celler ikke forbehandlet med sulindac eller udsat for hydrogenperoxid). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt i% af middelværdien af ​​fire gentagne prøver fra et repræsentativt eksperiment. Betydningen af ​​forskellene mellem celler behandlet med og uden sulindac, men udsat for samme koncentration af hydrogenperoxid: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001

Flere linjer af beviser tyder på, at den forøgede drab af kræftceller ved sulindac og oxidativ stress ikke involverer COX-hæmning. To andre NSAID’er, acetylsalicylsyre (aspirin) og ibuprofen, ved 500 uM til kroppen for at forøge følsomheden af ​​cancerceller over for oxidativ stress (figur 3A og 3B henholdsvis). Som bemærket ovenfor, sulindac er et pro-drug, som skal konverteres til den aktive COX-inhibitor, sulindac sulfid [19], primært gennem aktiviteten af ​​MSRA [20]. For at bestemme om den forøgede drab af sulindac-behandlede cancerceller ved TBHP involverede reduktion af sulindac til sulindac sulfid, den aktive inhibitor af cyclooxygenaser, blev de ovenfor beskrevne eksperimenter gentaget under anvendelse sulindac sulfon, som ikke er et substrat for MSRA (upublicerede data) eller en COX-inhibitor [28]. På grund af øget toksicitet af sulindac sulfon en lavere koncentration (250 uM) blev anvendt til disse eksperimenter. Forbehandling af lungecancerceller med 250 pM sulindac sulfon (figur 3C), efterfulgt af udsættelse for TBHP gav sammenlignelige resultater til dem, der ses under anvendelse af 500 pM sulindac (sammenlign figur 1A og 3C). Lignende resultater ved anvendelse sulindac sulfon blev også opnået med tyktarmskræft cellelinjer (data ikke vist). Således kollektive data viser, at den øgede følsomhed sulindac behandlet kræftceller til at oxidativt stress, under de anvendte betingelser, ikke indebærer hverken MSR-systemet eller COX-hæmning.

Lung cancerceller blev inkuberet i nærvær ( ▪) eller fravær (□) af enten 500 uM acetylsalicylsyre (A), 500 uM ibuprofen (B) eller 250 uM sulindac sulfon (C) i 48 timer. Celler blev derefter vasket for at fjerne det frie NSAID eller sulindac sulfon før inkubering i 2 timer med den angivne koncentration af TBHP. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af MTS-assayet beskrevet i Materialer Metoder. Cellelevedygtighed udtrykt som% af kontrol (celler ikke er udsat for et NSAID, sulindac sulfon eller TBHP). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt i% af middelværdien af ​​fire gentagne prøver fra et repræsentativt eksperiment. Betydningen af ​​forskellene mellem celler behandlet med og uden sulindac sulfon, men udsat for samme koncentration af TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001

Sulindac ikke øge drab på normale celler udsat for oxidativt stress

Det var vigtigt at afgøre, om den forøgede dræbende effekt af sulindac og sulindac sulfon på kræftceller i nærvær af TBHP (figur 1) også forekom med normal, ikke-immortaliserede celler. Figur 4 viser virkningen af ​​forbehandling normale lungeceller med sulindac eller sulindac sulfon på celleviabilitet efter oxidativt stress ved hjælp TBHP. Inkubation af normale lungeceller med 500 pM sulindac for 48 timer før eksponering for tBHP ikke blot ikke forbedre drab, men sulindac forudsat beskyttelse mod oxidativ stress forårsaget af TBHP (figur 4A). blev også observeret en beskyttende virkning mod oxidativt stress på normale lungeceller når celler blev forbehandlet med sulindac sulfon (figur 4B).

Normale lungeceller blev inkuberet i 48 timer i (A) tilstedeværelsen (▪) eller fravær (□) på 500 pM sulindac eller (B) nærvær (▪) eller fravær (□) på 250 pM sulindac. Se materialer og metoder og legenden til figur 1 for yderligere oplysninger. Betydningen af ​​forskellene mellem celler behandlet med og uden sulindac eller sulindac sulfon, men udsat for samme koncentration af TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001

Lignende forsøg blev udført ved hjælp af de normale kolon celler. Der var ingen effekt på cellelevedygtighed i overværelse af TBHP når de normale colon celler blev forbehandlet med enten 500 uM sulindac eller 250 pM sulindac sulfon (data ikke vist). Således viste hverken normal lunge eller normale kolon celler forbedret drab ved TBHP efter behandling med sulindac eller sulindac sulfon, som blev observeret med de to cancer cellelinjer.

Sulindac forbehandling af lungekræft celler fører til forhøjede niveauer af ROS og tab af mitokondrie membran potentielle

Lung cancerceller blev brugt til at få mere information om den mekanisme af den forbedrede dræbende effekt af sulindac i overværelse af TBHP. For at undersøge om den forøgede drab af cancercellerne observeret med sulindac og oxidativt stress kan indebære mitokondriel dysfunktion, blev ændringer i niveauet af intracellulær ROS bestemt. Til disse eksperimenter blev lungecancerceller behandlet med sulindac i 48 timer, udsat for TBHP og derefter det intracellulære ROS niveau blev visualiseret under anvendelse af et fluorescerende farvestof som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er vist i figur 5. I forhold til ubehandlede lungecancerceller (figur 5A), celler behandlet med sulindac alene (figur 5B) eller TBHP alene (figur 5C) viste en beskeden stigning (53-58%) i ROS-niveauer baseret på udseende af grøn fluorescens. Imidlertid lungecancerceller, der blev forbehandlet med 500 pM sulindac efterfulgt af en 2 timers inkubation med 80 pM TBHP (figur 5D) havde en stigning i intracellulær grøn fluorescens 400% i forhold til ubehandlede celler (sammenlign figur 5A og 5D). Disse data viser klart, at forbehandling af lungekræft celler med sulindac fører til en stor stigning i intracellulær ROS efter udsættelse for oxidativ stress, støtte resultater på huden kræftceller rapporteret for nylig [27].

Panelerne viser intracellulær ROS fluorescens. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med kun sulindac; (C) celler behandlet med kun TBHP; (D) celler behandlet med både sulindac og TBHP. Inkubationsbetingelserne er beskrevet i figur 1. Cellerne blev forberedt til fluorescensmikroskopi og den grønne fluorescenssignal blev kvantificeret som beskrevet i Materialer og Metoder. Niveauer af fluorescens er gennemsnittet af to uafhængige forsøg og blev korrigeret for procentdelen af ​​levedygtige celler. SEM var mindre end 10% for hver prøve. Stigningen i fluorescens sammenlignet med kontrolceller i panel A: B, 53%; C, 57%; D, 401%.

For yderligere at undersøge mekanismen for at dræbe cancerceller udsat for oxidativt stress efter forbehandling med sulindac, undersøgte vi, om der er et ledsagende tab af mitokondriel membranpotentiale, som vides at initiere apoptotisk celledød. Virkninger på mitochondriemembranpotential blev vurderet ved anvendelse ændringer i fluorescensen af ​​JC-1 farvestof som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er vist i figur 6. De øverste paneler viser rødt fluorescerende billeder og de nedre paneler grønne fluorescerende billeder. Tab af mitochondriemembranpotential ville resultere i nedsat rød fluorescens og en tilsvarende stigning i grøn fluorescens. I forhold til ubehandlede celler (figur 6A) eller celler behandlet med kun sulindac (figur 6B) eller TBHP alene (figur 6C), sulindac forbehandling af lungekræft celler efterfulgt af oxidativ stress (figur 6D) resulterede i afbrydelse af mitochondriemembranpotential som vist ved næsten en 20-dobling i grøn fluorescens (se legende i figur 6 for yderligere detaljer). Sammenfattende forbehandling af lungecancerceller med sulindac efterfulgt af behandling med TBHP fører til en markant stigning i intracellulær ROS og et betydeligt tab af mitochondriemembranpotential. Disse resultater viste, at celledød foregik via apoptose, hvilket blev bekræftet af Tunel analyse (Supplerende figur S1)

Øvre paneler viser rød fluorescens billeder, mens lavere paneler viser grøn fluorescens billeder. Tab af mitochondriemembranpotential blev påvist ved et fald på rød fluorescens med en samtidig forøgelse af grøn fluorescens. Det eksperimentelle design er beskrevet i legenderne i figur 1. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med kun sulindac; (C) celler behandlet med kun TBHP; (D) celler behandlet med både sulindac og TBHP. Cellerne blev fremstillet til fluorescensmikroskopi og fluorescenssignalet blev kvantificeret som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er et gennemsnit af tre uafhængige forsøg. SEM var mindre end 10% for hver prøve. Kvantitativ analyse af grøn fluorescens udtrykkes på følgende måde i arbitrære enheder: panel A -1,39; panel B -1,23; panel C -1,29; panel D -25,3.

Diskussion

Sulindac og dets metabolitter, såsom sulindac sulfid og sulindac sulfon, har vist sig at have anti-cancer aktivitet [29]. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse af huden cancerceller [27], har vi vist, at kan forøges drab på lunge- og colontumorcellelinier markant, hvis sulindac kombineres med en oxidant, såsom TBHP eller hydrogenperoxid. Vi har også vist, at sulindac forbehandling kan øge drab af hudkræft celler forårsaget af arsentrioxid (data ikke vist), som dræber cancerceller ved at generere intracellulær ROS, som rapporteret andetsteds for lungecancerceller [30]. Det synes rimeligt, at sulindac kan øge effektiviteten af ​​enhver anticancer narkotika hvor virkningsmekanismen involverer oxidative skader. Den vellykkede gennemførelse af en multipel terapi narkotika er for nylig blevet rapporteret for et klinisk forsøg, der involverer næsten 300 patienter med risiko for gentagelse af kolorektale adenomer, der blev behandlet med en kombination af sulindac og difluormethylornithin, en inhibitor af polyaminsyntese [31].

det forekommer sandsynligt, at mekanismen for selektivt drab af cancerceller set i disse undersøgelser involverer mitokondriel dysfunktion, muligvis som følge af øget ROS produktion. Mens behandling af cancerceller med sulindac eller TBHP individuelt fører til en beskeden stigning i niveauet af ROS (figur 5B og [27], [32]), der er en dramatisk stigning i de intracellulære niveauer af ROS i celler forbehandlet med sulindac og derefter udsat for TBHP (figur 5D). Derudover er der en betydelig forstyrrelse af mitokondrisk membranpotentiale under de samme eksperimentelle betingelser (figur 6), hvilket antyder, at sulindac forårsager apoptose i cancerceller udsat for oxidativt stress. Anticancer effekt af sulindac alene er blevet rapporteret at involvere apoptotisk død [33]. Resultaterne med sulindac sulfon og andre NSAID’er indikerer, at virkningen af ​​sulindac i vores system ikke involverer COX inhibering eller MSR-systemet.

De foreliggende resultater viser en grundlæggende forskel i den måde normale celler og cancerceller svare oxidativ stress. Sulindac og dets metabolitter kan forstærke denne forskel, hvilket fører til forøget drab af cancerceller, men ikke normale celler, ved oxidativ stress. Det er velkendt, at kræft og normale celler adskiller sig i deres oxidative metabolisme, og at kræftceller har en højere glykolyse end normale celler, et fænomen først beskrevet af Warburg [34]. Der er også overbevisende tegn på, at cancerceller er typisk under større oxidativ stress sammenlignet med normale celler [35]. En forskel mellem normale celler og cancerceller til oxidativ stress, der er blevet rapporteret, er cytotoksiciteten forårsaget af glucose deprivation. Undersøgelser foretaget af Spitz og kolleger [36] har klart vist, at denne effekt er medieret af mitokondrie ROS produktion.

De beskrevne resultater giver yderligere bevis på, at en kombination af sulindac og en oxiderende agent kan have klinisk terapeutisk værdi ved behandling af en forskellige cancere. I en tidligere forundersøgelse rapporterede vi, at resultaterne af en begrænset proof of concept human klinisk forsøg under anvendelse af sulindac (1-5%) og hydrogenperoxid (25%) geler anvendes dagligt i tre uger på aktiniske keratoser (AK) involverer de øvre ekstremiteter [27]. Efter afslutning udviste alle ti behandlede AKs en reduktion i størrelse som vist ved klinisk fotografering med fem udviser fuldstændig forsvinden af ​​præcancerøse celler efter hudbiopsi. Disse foreløbige resultater garanterer mere omfattende kliniske forsøg

Materialer og metoder

Materialer

Sulindac, acetylsalicylsyre (aspirin), (S) -. (+) – Ibuprofen, og tert-butyl-hydroperoxid (TBHP) blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). Sulindac sulfon blev syntetiseret ved Tilpasset Synthesis Inc. (Boca Raton, FL). Alle vævskultur medier, herunder føtalt bovint serum og andre kosttilskud blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

Cell Culture

En coloncancercellelinie (RKO), en lungecancer-cellelinie (A549), og fibroblast cellelinier afledt fra normal human colon tissue (CCD-18Co) og normal human lunge (MRC-5) blev opnået fra ATCC (Rockville, MD). Alle cellelinier blev opretholdt i den anbefalede dyrkningsmedium. Den normale cellelinier blev ikke immortaliserede og tidlig passage-celler blev anvendt til eksperimenterne rapporteret her. Cellelinjer blev bestemt til at være fri for mycoplasma under anvendelse af VenorGeM® Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich), som er en meget følsom PCR-baseret assay.

Cell Levedygtighed Assay

Medmindre andet er angivet blev cellerne forbehandlet med sulindac, sulindac sulfon eller en anden NSAID i 48 timer før eksponering for TBHP i 2 timer. Cellesuspensioner (~100,000 celler) indeholdende den angivne supplement blev udpladet i mikrotiterplader med 96 brønde under anvendelse af 100 pi af den angivne cellesuspension. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Dyrkningsmediet blev derefter fjernet, og cellerne vasket en gang med frisk dyrkningsmedium med serum. Efter fjernelse af vaskeopløsningen, blev frisk dyrkningsmedium med serum, der indeholdt den angivne slutkoncentration af TBHP eller hydrogenperoxid tilsat til cellerne, og cellerne blev inkuberet i yderligere 2 timer. Lignende resultater blev opnået, når sulindac var inkluderet under 2 hr behandling med oxidationsmidlet

Cellelevedygtighed blev bestemt ved CellTiter 96 Aqueous One Cell Proliferation Assay. (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Assayet udnytter en hidtil ukendt tetrazoliumforbindelse at metabolisk aktive celler konvertere til et vandopløseligt formazan ved indvirkning af cellulære dehydrogenaser, som måles ved absorbans ved 490 nm ved anvendelse af en kolorimetrisk mikrotiterpladelæser (SpectraMax Plus

384; Molecular Devices) . Baggrund absorbans blev trukket fra hver prøve. Det er blevet rapporteret, at nogle anticancer stoffer kan forårsage ændringer i absorbans i MTS-baserede assays til cellelevedygtighed i fravær af celler [37]. Kontrol eksperimenter ved hjælp sulindac alene, TBHP alene eller kombinationer af sulindac og TBHP over koncentrationsområde anvendes i de rapporterede forsøg viste ingen effekt af hverken forbindelsen alene eller i kombination på absorbans.

Intracellulær ROS Assay

Intracellulær ROS-niveauer blev bestemt ved hjælp af de reaktive oxygenarter (ROS) detektionsreagenser fra Molecular Probes (Eugene, OR) som beskrevet andetsteds [38]. Forhøjede niveauer af ROS resultere i øget grøn fluorescens, som blev visualiseret ved fluorescens mikroskopi.

JC-1 assay til måling af mitokondrielle membranpotentiale

Tab af mitochondriemembranpotential blev bestemt ved hjælp af JC-1 farvestof fra Molecular Probes (Eugene, OR). Tab af mitokondrie membranpotentialet fører til øget grøn fluorescens i cytosolen og et tilsvarende fald i mitokondrie rød fluorescens. Således blev ændringerne i mitochondriemembranpotential bestemmes efter rød til grøn farvning skift under anvendelse af et FITC-filter (Zeiss inverteret mikroskop-Axiovert 40 CFL). .

TUNEL Assay til at påvise apoptose

apoptotiske celler blev påvist kvantificering af fluorescenssignaler anvendte både standard densitometriske metoder og en Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) baseret billedanalyse [39] ved hjælp af Deadend (Promega) kolorimetrisk TUNEL assay, der ender etiketter fragmenteret DNA. Celler blev fikseret med 4% formaldehyd før de permeabiliseret med 0,2% Triton-X-100. Celler blev derefter vasket med PBS før inkubation med rekombinant terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) og biotinylerede nucleotider i 1 time ved 37 ° C, der indeholder de biotinylerede nucleotider ved 3′-enderne af fragmenteret DNA. Celler blev vasket med PBS og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-streptavidin (HRP-Streptavidin) ved stuetemperatur i 30 min. HRP-streptavidin mærkede celler blev påvist ved hydrogenperoxid og diaminobenzidin (DAB). Apoptotiske celler visualiseres ved mørkebrun nuklear farvning.

Statistisk analyse

Resultater af cellelevedygtighed eksperimenter er udtrykt som middelværdien af ​​fire gentagelser af et repræsentativt eksperiment. Fejlsøjlerne angiver standardfejlen på middelværdien (SEM). Midler blev sammenlignet ved anvendelse af standard t-tests og p-værdierne er angivet i figurteksterne. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Kvantificering af fluorescens signaler, der anvendes både standard densitometriske metoder og en Photoshop (Adobe Systems, San Jose, Californien) baseret billedanalyse [39].

Støtte oplysninger

figur S1.

Celledød grund apoptose. En TUNEL-assay blev anvendt til at detektere apoptose af lungecancerceller. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med kun 500 pM sulindac; (C) celler behandlet med kun 180 uM TBHP; (D) celler behandlet med både 500 uM sulindac og 180 uM TBHP. Forøgede niveauer af apoptose er angivet med forøget dannelse af brunfarvning. Den eksperimentelle design er beskrevet i legender af figur 1 i manuskriptet. Yderligere oplysninger om TUNEL-analysen findes i de materialer og metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0005804.s001

(0,22 MB TIF)

Tak

Vi vil gerne anerkende Dr. Daphna Sagher for hendes hjælp og nyttige diskussioner. Vi vil også gerne takke Kelsey Binninger for hendes hjælp med illustrationen.