PLoS ONE: Specifikke Ø-tubulin isotyperne Kan Funktionelt øge eller mindske Epothilon B Følsomhed i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Epothiloner er en ny klasse af mikrotubuli stabilisatorer med lovende præklinisk og klinisk aktivitet. Deres cellulære mål er β-tubulin og faktorer, der påvirker iboende følsomhed over for epothiloner er ikke godt forstået. I denne undersøgelse blev den funktionelle betydning af specifikke p-tubulin isotyper i iboende følsomhed over for epothilon B undersøgt ved anvendelse siRNA gen knockdown mod βII-, βIII- eller βIVb-tubulins i to uafhængige ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer, NCI-H460 og Calu-6. Lægemiddelbehandlede klonogene assays viste, at følsomheden over for epothilon B ikke blev ændret efter knockdown af βII-tubulin i begge NSCLC cellelinier. I modsætning hertil knockdown af βIII-tubulin steg betydeligt følsomhed over for epothilon B. Interessant βIVb-tubulin knockdowns var signifikant mindre følsomme over for epothilon B, sammenlignet med mock- og styre siRNA celler. Cellecyklusanalyse af βIII-tubulin knockdown-celler viste en højere procentdel af celledød med epothilon B koncentrationer så lave som 0,5 nM. I modsætning hertil βIVb-tubulin knockdown-celler viste et fald i epothilon B-induceret G

2-M cellecyklus akkumulering sammenlignet med kontrol siRNA celler. Vigtigere, βIII-tubulin knockdowns udviste en signifikant dosis-afhængig stigning i procentdelen af ​​apoptotiske celler efter behandling med epothilon B, som påvist under anvendelse af caspase 3/7 aktivitet og Annexin-V-farvning. Højere koncentrationer af epothilon B blev kræves for at inducere apoptose i βIVb-tubulin knockdowns sammenlignet med kontrolgruppen siRNA, fremhæver en potentiel mekanisme bag nedsat følsomhed ved dette middel. Denne undersøgelse viser, at specifikke p-tubulin isotyper kan påvirke følsomheden over for epothilon B og kan påvirke differentieret følsomhed over for denne lovende nye middel

Henvisning:. Gan PP, McCarroll JA, Byrne FL, Garner J, Kavallaris M (2011 ) Særlige p-tubulin isotyperne Kan Funktionelt øge eller mindske Epothilon B Følsomhed i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 6 (6): e21717. doi: 10,1371 /journal.pone.0021717

Redaktør: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, USA

Modtaget: 13. oktober 2010; Accepteret: 9. juni 2011; Udgivet: 29 juni 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Børns Cancer Institut Australien for Medical Research, som er tilknyttet University of New South Wales og Sydney Børnehospital og tilskud fra New South Wales Cancer Council (MK). Endeavour International Postgraduate Research Scholarship (PPG), University of New South Wales Fakultet Fellowship (JAM), University of New South Wales Fakultet Early Career Research Award (JAM), Balnaves Award (JAM), Anthony Rothe Postgraduate Award (JLB ), og ved en NHMRC Senior Fellowship (MK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. MK, PPG og marmelade, Patent Application 20100159030 METODER til detektering og modulere følsomhed tumorceller over for antimitotiske agenter og til at modulere TUMORGENICITY 2010/06/24. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

De taxaner (herunder paclitaxel og docetaxel) er etableret medicin almindeligt anvendt i behandlingen af ​​flere typer af faste tumorer, herunder ovarie-, bryst-, lunge- og hoved- og halscancer, enten enkeltvis eller i kombination med andre kemoterapeutiske midler. Den kliniske succes taxaner har givet afsæt for at søge efter andre nye stoffer med lignende, men med forbedret effektivitet. Epothiloner er en hidtil ukendt klasse af ikke-taxan mikrotubulusstabiliserende midler, som har vist lovende anticanceraktivitet. Blandt dem, epothilon B-analog, Ixabepilon (BMS-247.550, aza-EpoB) blev godkendt i 2007 af Food and Drug Administration til behandling af metastatisk eller lokalt fremskreden brystkræft resistent over for antracykliner, taxaner og capecitabin, enten enkeltvis eller kombination med disse midler [1]. Den naturligt forekommende epothilon B (patupilone, EPO906), har også vist lovende aktivitet i forskellige prækliniske modeller, der er resistente over for taxan kemoterapi og er i øjeblikket under kliniske fase II /III-forsøg [2], [3], [4], [5]. Trods lidt strukturel lighed mellem epothiloner og taxaner begge agenter deler den samme eller en overlappende bindingssted på β-tubulin [6], [7]. Svarende til taxaner, epothiloner inducerer mikrotubulus bundling [6], undertrykke mikrotubulusdynamik; hvilket fører til inhibering af celleproliferation og mitotisk blok [8]. Selvom epothiloner og taxaner stabiliserer mikrotubuli mod depolymerisering, de udviser tydelige forskelle i aktivitet og effekt (revideret i [9], [10]).

Både epothiloner og taxaner kan stabilisere mikrotubuli mod depolymerisering, men de udviser tydelige forskelle i aktivitet og effekt (revideret i [9], [10]). Årsagerne til forskellene i aktivitet er dårligt forstået. Til dato, har undersøgelser fokuseret på erhvervet resistens over for epothiloner hjælp narkotika udvalgte befolkningsgrupper, der udviser flere resistensmekanismer herunder ændringer i tubulin isotype udtryk og mutationer i β-tubulin [11], [12], [13], [14]. Vi har tidligere beskrevet epothilon B analoge resistente leukæmiceller, der udviser multiple mikrotubulus ændringer, herunder øget ekspression af βIII-tubulin, forøget ekspression af MAP4, og mutationer i βI-tubulin [13]. Mens der er beskrevet erhvervet resistens over for epothiloner, har forskning i iboende faktorer, der medierer følsomhed over for epothiloner og relateret til den cellulære mål af lægemidlet, tubulin, været knappe. Da disse stoffer videre til klinikken er det vigtigt at forstå, hvordan denne klasse af forbindelse interagerer med forskellige tubulin isotyper og hvordan iboende niveauer af disse proteiner Effektiviteten påvirkes.

Brug RNAi teknologi, vi har tidligere vist, at βIII-tubulin medierer følsomhed over for paclitaxel og

Vinca

alkaloider i NSCLC celler [15]. Silencing ekspressionen af ​​βII- og βIVb-tubulin isotyper, på den anden side, forbedre følsomheden af ​​disse celler til

Vinca

alkaloider men ikke paclitaxel [16]. Korrelative bevis for, at opregulering af βIII-tubulin ikke medierer resistens over for epothilon B er også blevet beskrevet [12]. Imidlertid overekspression af βIII-tubulin i HeLa-celler gør cellerne mindre følsomme for epothilon B [17]. Det vides ikke, om differentieret ekspression af β-tubulin isotyper indflydelse reaktion på epothiloner. Forståelse denne interaktion er stærkt ønsket til udvikling af prædiktive markører for at give mere skræddersyet terapi for NSCLC patienter og andre patienter i behandling med epothiloner.

For at undersøge den funktionelle betydning af disse p-tubulin isotyper som reaktion på epothilon B i NSCLC, vi ansat RNAi teknologi til specifikt knockdown ekspression af disse isotyper i to uafhængige NSCLC cellelinjer og karakterisere virkningerne på cellemorfologi, følsomhed over for epothilon B og narkotika-induceret apoptose.

Materialer og metoder

Celledyrkning, siRNA transfektion og cytotoksisk lægemiddel

H460 og Calu-6-celler blev opnået fra ATCC (Manasse, VA, USA) og opretholdt som tidligere beskrevet [15]. Cellelinier er rutinemæssigt screenet og fri for mycoplasma. Alle transfektionsforsøg blev udført som tidligere [15] rapporterede. Styrken og specificiteten af ​​de siRNA’er rettet mod hver β-tubulin isotype tidligere er blevet valideret [15], [16]. Epothilon B (Calbiochem, Merck Biosciences) blev fremstillet ved en stamkoncentration på 100 uM i DMSO.

Immunfluorescensfarvning

Kort fortalt siRNA-transficerede Calu-6 celler, der vokser i glas kammerskiver blev behandlet med epothilon B ved de angivne koncentrationer i 1 time. Immunofluorescens-farvning af siRNA-transficerede celler blev derefter udført som tidligere beskrevet [15], [16].

lægemiddelbehandlede klonogene assays

lægemiddelbehandlede klonogene assays blev udført som tidligere beskrevet [15 ], [16]. Resultaterne blev udtrykt som en overlevende fraktion og hæmmende dosis (ID

50) blev ekstrapoleret fra dosis-respons-kurve ved hjælp af GraphPad Prism-program [15], [16].

Cell cyklus analyse

til analyse af DNA-indhold ved propidiumiodidfarvning, H460 og Calu-6-celler blev podet i plader med 6 brønde indeholdende 6 × 10

4 celler per brønd og transficeret med siRNA. Efter 72 timer transfektion blev cellerne eksponeret for epothilon B ved de angivne koncentrationer i 24 timer. På dagen for analysen blev både adhærente og flydende celler høstet, vasket med PBS og fikseret med 80% ethanol i mindst 24 timer ved 4 ° C. De fikserede celler blev derefter farvet med en opløsning indeholdende 50 pg /ml propidiumiodid, og 2 ug /ml DNase-fri RNase i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. DNA-indhold blev målt ved en FACSCalibur flowcytometer (BD). CellQuest program blev anvendt til at kvantificere fordelingen af ​​celler i hver celle cyklus fase: sub-G

1 (døde eller fragmenteret), G

1, S og G

2-M [15], [ ,,,0],16].

apoptoseassays

Cellulær apoptose blev bestemt ved måling af caspase 3/7 aktivitet ved anvendelse af caspase-Glo 3/7 assay som tidligere beskrevet med mindre ændringer [18], [19 ]. Kort beskrevet blev celler transficeret med siRNA i 24 timer og genudpladet i 96-brønds plader (5 × 10

3 celler /brønd) og fik lov til at klæbe i yderligere 24 timer. Celler blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af epothilon i 24 timer. Efter behandling blev cellerne inkuberet med Caspase-Glo 3/7 reagens i 2 timer ved stuetemperatur, og luminescensen blev målt med et luminometer (PerkinElmer Victor 3). Derudover apoptose blev også bestemt ved Annexin V-FITC-farvning kit (Becton Dickinson) som tidligere beskrevet [15], [19].

Statistisk analyse

Data udtrykkes som middelværdien ± SEM og analyseret ved hjælp af ANOVA eller studerendes

t

test efterfulgt af parametrisk Dunnett eller Mann-Whitney tests ved hjælp af GraphPad Prism-programmet. AP værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Differential følsomhed over for epothilon B efter βII-, βIII- eller βIVb-tubulin knockdown

Specificiteten af ​​hvert af β-tubulin siRNA blev bekræftet på proteinniveau (figur S1). I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser, βII-, βIII-, og βIVb-tubulin siRNA potent inhiberede protein ekspression af hvert af disse mål uden at påvirke ekspressionen af ​​andre større p-tubulin isotyper i NSCLC cellelinier (figur S1) [15] , [16]. For at undersøge virkningerne af disse p-tubulin isotyper som respons på epothilon B i NSCLC-celler og at kvantificere eventuelle ændringer i lægemiddelfølsomhed blev lægemiddelbehandlede klonogene assays udført. Knockdown af βII-tubulin ekspression i både H460 og Calu-6-celler påvirkede ikke følsomhed for epothilon B (fig. 1A). I modsætning hertil knockdown af βIII-tubulin betydeligt sensibiliseret begge NSCLC cellelinier til epothilon B (fig. 1B). For nylig beskrev vi udviklingen og karakteriseringen af ​​H460 celler valgt til stabil ekspression af shRNA mod βIII-tubulin, og den øgede følsomhed af disse celler til paclitaxel, cisplatin og dets analoge carboplatin [19]. Vigtigere er det, øget følsomhed over for epothilon B ved hjælp af forbigående knockdown af βIII-tubulin blev også bekræftet ved hjælp af de stabile H460 βIII-tubulin shRNA Knockdown celler (Figur S2), yderligere at styrke vores resultater med dette isotype. Interessant knockdown af βIVb-tubulin betydeligt reduceret følsomhed over for epothilon B i begge cellelinier, sammenlignet med mock- og styre siRNA-transficerede celler (fig. 1C), hvilket antyder, at tumorer udtrykker høje niveauer af denne isotype kan være mere følsomme over for epothilon B end tumorer med lave niveauer af denne isotype.

klonogene assays blev udført på mock (lukkede firkanter, ubrudt linje), kontrollerer siRNA (åbne firkanter, ubrudt linie) og specifikke p-tubulin isotype siRNA-transficerede celler (lukket diamanter, brudt linje) i to NSCLC cellelinjer, H460 (venstre panel) og Calu-6 (højre panel). Graferne viser den klonogene overlevelse (A) βII-tubulin; (B) βIII-tubulin og (C) βIVb-tubulin Knockdown celler udsat for epothilon udtrykt som overlevende fraktion. Barer, middelværdi ± SEM af mindst fire individuelle assays. Statistik blev beregnet ved at sammenligne den overlevende fraktion af de Knockdown celler med mock-transficerede celler ved hver koncentration narkotika. *

P

0,05, **

P

. 0,01

Vi undersøgte også forskellige virkninger af epothilon B på mikrotubuli og cellemorfologi i βII -, βIII- og βIVb-tubulin knockdown-celler. Som vist i figur S3, viste alle ubehandlede siRNA-transficerede celler uden tydelige ændringer i mikrotubuli strukturer i konkordans med vores tidligere undersøgelser [15], [16]. Imidlertid epothilon B (5 nM) havde en markant virkning på celler med βIII-tubulin forarmet mikrotubuli. bundter mikrotubuli var mere fremtrædende i βIII-tubulin Knockdown celler. I modsætning hertil forblev mikrotubuli netværk stort set organiseret og intakt i kontrol siRNA, βII- og βIVb-tubulin Knockdown celler behandlet i samme koncentration. Ved 20 nM epothilon B, både kontrol- og βII-tubulin Knockdown cellerne begynder at udvise mikrotubuli bundter sammenlignet med de βIVb-tubulin knockdowns. Disse resultater supplerer klonogene data tyder på, at cellerne reagerede forskelligt på epothilon B efter specifik knockdown enkelte β-tubulin isotype.

Knockdown af βIII-tubulin reducerer epothiion B induceret cellecyklusstop og forbedrer celledød

Cellecyklusanalyse blev udført næste at bestemme, om knockdown af hver p-tubulin isotype påvirkninger cellecyklus profiler i nærvær af epothilon B i 24 timer. Ved behandling med koncentrationer så lave som 0,5 nM epothilon B viste βIII-tubulin knockdown-celler en markant stigning i sub-G

1-indhold, der indikerer celledød (fig. 2). En større forskel blev observeret med 20 nM epothilon B, med kontrollen siRNA- og βII-tubulin siRNA-behandlede celler udviste en markant G

2-M blok hvorimod βIII-tubulin knockdown-celler viste en stigning i sub-G

1 populationen (fig. 2). βIII-tubulin knockdown celler havde færre celler akkumulere ved G2-M sammenlignet med kontroller, tyder på, at celledød kan være forekommende uafhængig af mitosestandsning. Det er klart, at knockdown af βIII-tubulin kraftigt øger følsomheden til epothilon B via øget celledød fordi sub-G

1 befolkning blev forøget ved alle testede koncentrationer. I βIVb-tubulin Knockdown celler på den anden side blev en lavere G

2-M-indhold observeret i sammenligning med kontrolplanterne siRNA-behandlede celler ved 20 nM epothilon B (fig. 2). Den sub-G

1 indhold adskilte sig ikke mellem βIVb-tubulin knockdown og kontrol siRNA-behandlede celler ved 20 nM. I modsætning hertil knockdown af βIVb-tubulin, viste en lavere antal celler blokeret ved G

2-M, hvilket bekræfter nedgangen i følsomhed af disse celler til epothilon B.

Lægemiddelkoncentrationer blev angivet på toppen af figuren. Celler blev høstet efter 24 timer lægemiddelbehandling og efterfølgende analyseret for deres DNA-indhold ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. Repræsentative tal fra fire uafhængige forsøg er vist. *

P

0,05, **

P

. 0,01

For at bestemme om epothilon B-induceret G

2-M cyklus celle forsinkelse foregik på tidligere tidspunkter, blev cellecyklus-analyse under anvendelse H460 og Calu-6-celler udført ved 4, 8 og 12 timer i nærvær eller fravær af epothilon B (20 nM). I nærvær af lægemidlet, blev G

2-M cellecyklusstandsning observeret så tidligt som 4 timer for H460-celler (tabel S1) og 8 h for Calu-6-celler (Tabel S2) i både βIII-tubulin knockdown og kontrol-siRNA transficerede celler. Ved 8 og 12 h procentdelen af ​​H460 celler blokeret ved G

2-M var lavere end kontrol (tabel S1), selv om en lignende tendens ikke blev observeret i Calu-6 celler (tabel S2).

følsomhed over for epothilon B korrelerer med niveauet af apoptose induktion

for at løse, om øget eller nedsat følsomhed for epothilon B specifikke for hver β-tubulin isotype var relateret til apoptose induktion målte vi caspase 3/7 aktivitet i disse celler efter 24 timer lægemiddelbehandling. Caspase 3/7 aktivitet i βIII-tubulin Knockdown celler blev forøget mindst 2 gange i forhold i kontrolgruppen siRNA-transficerede celler ved alle testede koncentrationer (fig. 3). Den øgede caspaseaktivitet i βIII-tubulin Knockdown celler korrelerede med den øgede celledød observeret i disse celler efter lægemiddelbehandling. I modsætning hertil caspase 3/7 aktivitet forblev på baggrundsniveauer i βII- og βIVb-tubulin Knockdown celler, svarende til kontrol siRNA celler på ≤1 nM epothiion B. Vigtigere, var der et signifikant fald i caspase aktivitet i βIVb knockdown celler på ≥2 nM, hvilket antyder de βIVb-tubulin knockdowns var mindre følsomme over for epothilon-induceret apoptose.

siRNA-transficerede H460 celler blev høstet efter 24 timers inkubation i nærvær eller fravær af epothilon B og efterfølgende analyseret for apoptose induktion af caspase aktivitet assay. Åbne søjler: kontrol siRNA-transficerede celler; lysegrå faste søjler: βII-tubulin knockdown-celler; massive sorte bjælker: βIII-tubulin Knockdown celler; mørkegrå faste søjler: βIVb-tubulin knockdown celler. Data repræsenterer middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05; **

P

. 0,01

For yderligere at definere den rolle af p-tubulin isotyper i epothilon B-induceret apoptose, Annexin V-FITC farvning blev også udført efter 48 h behandling med epothilon B. Som vist i fig. 4A, behandling af βIII-tubulin knockdown H460 celler induceret apoptose fra en koncentration så lav som 320 pM epothilon B. Procentdelen af ​​apoptotiske celler var signifikant højere i βIII-tubulin siRNA-behandlede celler end i kontrol, βII- eller βIVb- tubulin siRNA-behandlede celler ved alle testede koncentrationer (fig. 4A). I modsætning hertil blev en højere koncentration af epothilon B er nødvendig for at inducere apoptose i βIVb-tubulin Knockdown celler sammenlignet med enten kontrol eller βII-tubulin siRNA-transficerede celler (fig. 4B). Tilsammen kan disse data viser, at øget apoptose induktion være en af ​​de mekanismer, der ligger til grund for overfølsomhed over for epothilon B efter βIII-tubulin knockdown. Knockdown af βIVb-tubulin, på den anden side, nedsat følsomhed ved epothilon B-induceret apoptose induktion i NSCLC

åbne søjler: kontrol siRNA-transficerede celler;. lysegrå faste søjler: βII-tubulin knockdown-celler; massive sorte bjælker: βIII-tubulin Knockdown celler; mørkegrå faste søjler: βIVb-tubulin knockdown celler. Bemærk epothilon B var i stand til at inducere apoptose i βIII-tubulin knockodown celler ved koncentrationer så lave som 12:32 (A), hvorimod højere koncentrationer af epothilon B inducerer signifikant lavere apoptose i βIVb-tubulin knockdown-celler (B). Data repræsenterer middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Diskussion

epothiloner repræsenterer en ny klasse af mikrotubuli stabiliserende midler, der potentielt kunne give en anden tilgang til at overvinde paclitaxel modstand. Epothiloner har vist lovende klinisk aktivitet i et fase II forsøg i NSCLC patienter [20], og er for nylig blevet godkendt til brug i metastatisk brystkræft. Det vides ikke, hvordan denne klasse af forbindelse interagerer med forskellige tubulin isotyper og hvordan disse indflydelse epothilon B følsomhed. Her i, viser vi, at specifikke p-tubulin isotyper forskelligt påvirke NSCLC celle følsomhed over for epothiloner (tabel 1).

Selvom ændret ekspression af p-tubulin isotyper har været forbundet indgående med taxan modstand, begrænsede oplysninger er tilgængelig på den rolle, p-tubulin isotyper i følsomhed til epothiloner. I denne undersøgelse havde βII-tubulin ikke påvirke følsomheden over for epothilon B i en af ​​de to uafhængige NSCLC cell undersøgte, H460 og Calu-6 celler linjer. Interessant, er følsomhed over for mikrotubulusstabiliserende paclitaxel ikke ud til at være påvirket af overekspression eller undertrykkelse af βII-tubulin udtryk [16], [21]. Dette resultat står i kontrast til vores tidligere undersøgelse af,

vinca

alkaloider, hvor undertrykkelse af βII-tubulin forbedrer følsomhed over for disse stoffer [16].

Prækliniske og kliniske undersøgelser har tidligere vist, at resistens til TBA’er er ofte forbundet med βIII-tubulin opregulering (gennemgået i [10], [22]). Der har været spekulationer og korrelationsmaalinger beviser for, at de cytotoksiske virkninger af epothiloner er uafhængige af βIII-tubulin udtryk på grund af deres aktivitet i βIII-tubulin overekspression celler

in vitro

i humane xenograftmodeller [9], [12] . Men endegyldige bevis ikke er blevet påvist, at epothilon aktivitet er virkelig uafhængig af βIII-tubulin udtryk. Ved hjælp af RNAi-teknologi, viser vi, at knockdown af βIII-tubulin fører til en betydelig stigning i følsomhed over for epothilon B. I aftale, blev stabil overekspression af βIII-tubulin i HeLa-celler sig at give resistens til en række TBA’er herunder epothilon B [17 ]. En rapport beskrev epothilon-resistente æggestokkene kræft cellelinjer med nedsat βIII-tubulin udtryk [12]. Lægemiddelresistens er multifaktorielle og forskellige cellelinje modeller kunne redegøre for forskelle. Vigtigere var andre ændringer i beta-tubulin isotyper og βI-tubulin punktmutationer også observeret i epothilonen B-resistente cellelinier [12], hvilket tyder på, at disse faktorer kan have bidraget til den resistente fænotype. Vi har tidligere beskrevet epothilon B analoge resistente leukæmiceller, der udviste multiple mikrotubulus ændringer, herunder øget ekspression af βIII-tubulin ekspression og βI-tubulin mutationer [13]. Til dato, bidragene fra erhvervet epothilon B resistensmekanismer er ikke blevet godt korreleret med iboende følsomhed over for epothiloner. Det skal understreges, at de to uafhængige NSCLC celler anvendt i den aktuelle undersøgelse er hverken blevet underkastet forudgående lægemiddelselektion eller udtrykke P-glycoprotein (data ikke vist) og giver derfor mulighed for at vurdere følsomheden til epothilon B, som hvert af de β tubulin isotyper undersøgt.

det er interessant, mens vælte βIII-tubulin hypersensitizes cellerne til epothilon B, knockdown af βIVb-tubulin faldt følsomheden af ​​NSCLC celler til epothilon B. nylig, Cabral og medarbejdere har rapporterede, at celler, der overudtrykker βIVb-tubulin udviste en lille, men signifikant stigning i følsomhed over for epothilon a [23]. Sammen med vores undersøgelse, kan βIVb-tubulin udtryk være en gunstig terapeutisk indikator for epothilon B-behandlingen. Vi har tidligere vist, at knockdown af βII- og βIVb-tubulins i NSCLC celler, der anvendes i denne undersøgelse påvirkede ikke signifikant paclitaxel følsomhed, men øge følsomheden over for vincaalkaloider [16]. Derfor, på trods af paclitaxel og deling epothilon B overlappende bindingssteder på β-tubulin, βIVb-tubulin ekspressionsniveauerne fremkalde forskellige virkninger på følsomhed over for paclitaxel og epothilon B. Der er voksende beviser for, at bindingen af ​​epothiloner og paclitaxel til tubulin kan ikke være identiske [13], [24]. Åbenbart, nogle punktmutationer i β-tubulin subunit tillægger paclitaxel men ikke epothilon modstand i cellekulturmodeller [7], [25], hvilket antyder, at epothiloner og taxaner kan have forskellige interaktioner med p-tubulin isotyper. En rationalisering for forskelle i følsomhed induceret af β-tubulin isotype ekspression kan være relateret til aminosyreforskelle mellem isotyper. Beta-tubulin isotyper βI, βII, βIVa og βIVb, deler mindst 95% identitet og har et begrænset antal ikke-konservative aminosyresubstitutioner (fig S4) [26]. I modsætning hertil βIII-tubulin afviger som den deler kun 92% identitet med ovennævnte β-tubulin isotyper. Inden for paclitaxel /epothilon bindende lomme, i βII og βIVb isotyper, Ser275 er blevet impliceret som en mediator af paclitaxel diffusion gennem nanopores [27] og kan hydrogenbinding med Gln279 og Lys216, stabilisere M-sløjfe (fig. 5). Til gengæld kan denne styrke hydrogenbindinger, der observeres mellem Arg276 til lactonen carbonyl og Thr274 til ketonen oxygen på C5 epothilon A (og formentlig epothilon B). I βIII-tubulin, er der en Ser275Ala mutation, der kunne destabilisere M-loop og derved svække Arg226 og Thr274 hydrogenbindinger med liganden, der bidrager til dens nedsat følsomhed. Men dette ikke forklare forskellen følsomhed observeret mellem βIII-tubulin og βIVb, som aminosyre-sekvenserne identificeret som værende vigtige i paclitaxel /epothiion bindende lomme, eller BNP bindingssted afviger ikke mellem disse to isotyper [24]. Den aktuelle undersøgelse kan ikke udelukke, at den differentierede ekspression af specifikke beta-tubulin isotyper påvirker binding af epothiloner til mikrotubuli væg, eller ved stabilisering af kontakter mellem dimerer i formning protofilamenter. en nylig undersøgelse med epothilon A viste imidlertid, det binder lige godt til både βI- og βIII-tubulin [28]. En lignende undersøgelse undersøger bindingen af ​​epothilon B og specifikke p-tubulin isotyper ville være vigtigt at bestemme, hvordan disse isotyper påvirke interaktionen af ​​dette stof med tubulin.

epothilon B er vist som sticks (lysegrå carbonatomer). Bindingslommen rester af 1TVK er vist som pinde (mørkegrå carbonatomer). Ikke-polære hydrogenatomer er udeladt for overskuelighedens skyld. Hydrogenbindinger vises som stiplede grønne linjer. Ser275 kan danne 3 hydrogenbindinger med Gln292 og Lys216. Billeder genereret i DS Modellering 3.0 (Accelrys®).

Antitumoraktivitet af epothiloner medieres af undertrykkelse af mikrotubulusdynamik, mitosestandsning på G

2-M cellecyklus fase efterfulgt af apoptose. For at løse de potentielle mekanismer bag den differentielle respons på epothilon B efter knockdown af en specifik β-tubulin isotype undersøgte vi tilbøjelighed af cellerne til at gennemgå lægemiddelinduceret cellecyklusstop og apoptose. Efter inkubering med epothilon B viste βIII-tubulin knockdown en stigning i sub-G

1 populationer (celledød), mens et fald i G

2-M blok, når sammenlignet med kontrol siRNA-transficerede celler. Knockdown af βIII-tubulin kan reducere omfanget af mitotiske blok induceret ved inkubation med enten paclitaxel eller vincristin [15], samtidig øge niveauet af celledød. Virkningen på epothilon B følsomheden kan ikke blot forklares ved en ændring i mikrotubulusdynamik, som vi for nylig vist, at mikrotubulusdynamik ikke ændrer i H460-celler efter βIII-tubulin knockdown [29]. Tilsammen viser disse undersøgelser, at knockdown af βIII-tubulin kan forstærke TBA-induceret apoptotisk celledød via en separat vej, der er uafhængig af mitosestandsning. En anden undersøgelse har vist, at anti-tumor-virkninger af paclitaxel, korrelerede med paclitaxel-induceret apoptose men ikke med mitosestandsning [30]. Epothiloner kan have en lignende virkningsmekanisme. Interessant βIVb-tubulin knockdown-celler havde en nedgang i antallet af celler blokeret ved G

2-M (epothilon B 20 nM) sammenlignet med kontroldyr og βII-tubulin Knockdown celler, dog på et niveau højere end den βIII- tubulin knockdown celler. Men i modsætning βIII-tubulin Knockdown celler, βIVb-tubulin Knockdown celler undergår, lægemiddel-induceret celledød på et tilsvarende niveau som kontrol og βII-tubulin Knockdown celler. Endvidere både caspase 3/7 aktivitet og Annexin V-farvning viste, at βIII-tubulin Knockdown celler havde en signifikant stigning i epothilon B-induceret apoptose induktion ved alle testede koncentrationer. I modsætning hertil knockdown af βIVb-tubulin beskyttede celler mod epothilon B som afspejlet i nedsat induktion af apoptose. Derfor kan apoptoseinduktion fungere som et af mekanismerne bag forøges eller formindskes følsomhed observeret med disse specifikke p-tubulin isotyper som respons på epothilon B.

molekylær forbindelse mellem β-tubulin og epothilon B-induceret apoptose mangler at blive etableret. Det er blevet vist for nylig, at epothilon B apoptose i humane neuroblastomceller ved at forøge generering af reaktive oxygenarter fra mitokondrier og efterfølgende relocalization af proapoptotiske protein Bim i mitokondrierne rummet [31]. Fremtidige undersøgelser vil bestemme hvorvidt ROS-generering og mitochondrier eller ekspression af forskellige pro- og anti-apoptotiske proteiner er ansvarlige for evnen hos βIII-tubulin eller βIVb-tubulin til differentielt påvirker epothilon B-induceret apoptotiske signaler, og om disse signaler forekommer uafhængigt af mitosestandsning .

betydningen af ​​forskellen β-tubulin isotyper i følsomhed over for epothilon B kræver yderligere validering i kliniske omgivelser at vurdere dens anvendelighed til at forudsige effektiviteten af ​​epothilon B. det vil også være af stor interesse at bestemme, om ekspression af βIVb-tubulin vil korrelere med klinisk respons i kræft behandlet med epothilon, som på grundlag af resultaterne i denne undersøgelse, tumorer med høj βIVb-tubulin niveauer forventes at være mere følsomme over for dette stof.

samlet disse resultater viser, at β-tubulin-isotype sammensætning af en celle påvirker følsomheden over for epothilon B. kliniske studier er berettiget til at vurdere den terapeutiske værdi af differentiel ekspression af p-tubulin isotyper i NSCLC og deres rolle i klinisk respons på epothiloner.

Støtte Information

Figur S1.

siRNA målrettet βII, βIII eller βIVb-tubulin tavshed specifikt deres udtryk i H460 og Calu-6 NSCLC celler. Repræsentative western blots viser siRNA targeting βII (A), βIII (B), eller βIVb-tubulin (C) inhiberer dets proteinekspression i H460 og Calu-6 NSCLC celler sammenlignet med celler behandlet med kontrol siRNA eller Mock (kun lipofectamin 2000) . Ingen væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​andre β-tubulin isotyperne blev observeret. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) ekspression blev anvendt som en loading kontrol. Repræsentative geler.