PLoS ONE: fibroblast-Afledte Exosomer Bidrage til kemoresistens gennem Priming Cancer Stamceller i kolorektal Cancer

Abstrakt

Kemoterapi modstand observeret hos patienter med kolorektal cancer (CRC) kan være relateret til tilstedeværelsen af ​​cancer stamceller ( CSCS), men den underliggende mekanisme (r) fortsat uklare. Carcinoma-associerede fibroblaster (CAFS) er tæt involveret i tumor tilbagefald, og målrette dem øger kemo-følsomhed. Vi undersøgte, om fibroblaster kunne øge CSCS således mediere kemoterapi modstand. CSCS blev isoleret fra enten patient-afledte xenotransplantater eller CRC cellelinjer baseret på ekspressionen af ​​CD133. Først blev CSCS fundet at være naturligt resistente overfor celledød induceret af kemoterapi. Desuden fibroblast-afledte konditionerede medium (CM) fremmes procentdel, clonogenicity og tumorvækst af CSCS (dvs. CD133 + og TOP-GFP +) ved behandling med 5-fluorouracil (5-FU) eller oxaliplatin (OXA). Yderligere undersøgelser udstillet at exosomer, isoleret fra CM, på samme måde tog de ovennævnte effekter. Hæmning af exosome sekretion faldt procentdelen, clonogenicity og tumorvækst i CSCS. Alt i alt, vores resultater tyder på, at der ud målrette CSCS, nye terapeutiske strategier blokerer CAF sekretion selv før kemoterapi skal udvikles til at opnå bedre kliniske fordele i avancerede CRC’er

Henvisning:. Hu Y, Yan C, Mu L, Huang K, Li X, Tao D, et al. (2015) fibroblast-Afledte Exosomer Bidrage til kemoresistens gennem Priming Cancer Stamceller i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10,1371 /journal.pone.0125625

Academic Redaktør: Christopher Heeschen, spansk National Cancer Center (CNIO), SPANIEN

Modtaget: Januar 4, 2015; Accepteret: 24 marts 2015; Udgivet: Maj 4, 2015

Copyright: © 2015 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81.172.065, 81.272.660), Program for New Century Fremragende Talenter i University (nr NCET-12- 0208), Videnskabelig Forskning Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars, Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet (nr JYBHG201002), grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (Hust, No.01-18-540005), Tongji Hospital midler til Returnerede Overseas Forskere og udestående unge forskere (2012yq004) (alle til JCQ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, og dens dødelighed har været støt stigende i de seneste årtier [1]. Kemoterapi har ikke dramatisk forbedret kliniske resultater af patienter med recidiverende eller metastaserende CRC. En bedre forståelse af mekanismerne bag modstand i CRC er bydende nødvendigt for udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske metoder, der kan gavne CRC patienter.

CRC er heterogen, manifesterer brogede cellulære morfologier og histopatologiske præsentationer. Eksperimentel evidens for eksistensen af ​​kræft stamceller (CSCS) i CRC blev for nylig vist ved hjælp af primære humane CRC tumorprøver [2, 3]. CSCS er en hypotese at være naturligt resistente over for kemoterapi. Tilbagevendende CRCs upon kemoterapibehandling ofte beriget med cellerne, der udtrykker CSC markører såsom ABCB5 [2, 4]. Ikke desto mindre er de underliggende mekanismer stadig defineres.

Carcinoma-associerede fibroblaster (CAFS) er tæt involveret i tumor vedligeholdelse og progression. CAF er også rapporteret at spille en væsentlig rolle i regulering tumor følsomhed over for en række forskellige kemoterapier, og målrette dem dramatisk formindsker kemoresistens [5, 6]. Her vil vi først bekræfte, at kemoterapi fortrinsvis er rettet mod ikke-CSCS grundet celle autonom modstand CSCS og yderligere afsløre, at CAF prime CSCS og øge resistens ved kemoterapi gennem CAF-afledte exosomer.

Materiale og metoder

Etik Statement

Colorectal adenocarcinom vævsprøver blev opnået fra patienter, der undergik kirurgiske procedurer inden for Tongji Hospital i Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner, og alle protokoller blev godkendt af Etisk Komité Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi (IRB ID: 20.141.106) og blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-deklarationen .

antistof og reagenser

mus monoklonale anti-humant CD133 og muse-anti-humane EpCAM antistoffer blev købt fra Miltenyi Biotec (Headquarters, Tyskland). Anti-α-SMA-antistof blev opnået fra Dako (Danmark). Anti-FAP blev købt fra Abcam (Cambridge, UK) og anti-vimentin blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Wnt3a og anti-beta actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Alexa Fluor 488-konjugeret ged anti-mus IgG blev opnået fra Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). GW4869, 5-fluorouracil (5-FU) og oxaliplatin (OXA) blev købt hos Sigma (St. Louis, USA). Matrigel blev opnået fra B.D. (Franklin Lakes, NJ).

cellelinier og cellekultur

human coloncancer-celler (SW620) og humane fibroblastceller afledt fra normale colonvæv (18Co) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas VA). Kræft-associerede fibroblaster (CAFS) blev isoleret fra tyktarmskræft prøver. SW620-celler, 18Co celler og CAF afledt af primære tumorer blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, Californien, USA) suppleret med 10% FBS (Life Technologies, NY, USA) i en 37 ° C befugtet inkubator med en atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft.

Fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra tumorer

Primære kolorektale tumorer eller xenograft tumorer blev hakket helt til størrelsen af ​​1 mm

3 og derefter suspenderet i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Californien, USA) indeholdende 1,5 mg /ml collagenase ⅳ (Invitrogen, Californien, USA), 20 ug /ml hyaluronidase (Sigma, St. Louis, USA), 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies, NY , USA) og 1,25 mg /ml amphotericin B (Sigma, St. Louis, USA) ved 37 ° C i 1 time. Efter fordøjelse blev vævet vasket med PBS og filtreret gennem en 40 um mesh (BD Falcon, CA, USA). For at eliminere røde blodlegemer blev cellerne inkuberet i røde blodlegemer lyseringsbuffer (eBioscience, Californien, USA) på is i 10 minutter og vasket to gange med PBS. Cellerne blev derefter resuspenderet i PBS til eksperimenter.

Isolering af CAF og etablering af CRC xenotransplantattumorer (XhCRC)

For at isolere CAF, enkelte celler opnået fra en kvindelig patient med Duke B kolorektal adenocarcinom blev dyrket i DMEM med 10% FBS. Efter inkuberet i 3 timer blev ikke-adhærente celler vasket bort med PBS, hvorefter adhærente celler, der hovedsageligt bestod af makrofager, epitelceller og fibroblaster. Efter dyrket i flere dage, makrofagerne og epitelceller døde ud, forlader celler, der var fibroblastlignende og konsekvent α-SMA, vimentin og FAP positiv. Primære fibroblastkulturer blev brugt til forsøg op til passage 10. At etablere CRC xenograft tumor model blev enkelt primære kolorektale cancerceller afledt af en kvindelig patient med Duke C colorectal adenocarcinom implanteret i bilaterale ryggen af ​​kvindelig NOD /SCID-mus.

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og oprensning af CD133

+/- CRC celler

FACS blev udført ifølge producentens instruktioner under anvendelse af en FACS Aria II Cell Sorter (BD, Biosciences, CA , USA). For at separere CD133

+ og CD133

– /lo celler i SW620 celler, celler blev mærket med PE /APC-konjugeret muse-anti-humane CD133-antistoffer. Generelt kun den øverste (CD133

+) og bund (CD133

– /lo) 10-20% celler blev renset ud. For at separere CD133

+ og CD133

– /lo celler i xenotransplantater blev XhCRC tumorer dissocieret til enkelte celler som beskrevet ovenfor og derefter farvet med APC-konjugeret muse-anti-humant CD133 og PE-konjugeret muse-anti-humant EpCAM antistoffer, og EpCAM

+ CD133

+ og EpCAM

+ CD133

– /lo CRC celler blev renset ud

Cell død analyse

Cell død. CSCS og ikke-CSCS blev vurderet ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Kort beskrevet blev celler udsået i komplet medium ved 3.000 celler /brønd i 96-brønds plader. Efter 12 timer efter podning blev cellerne behandlet med enten 5-FU (1 uM) eller OXA (1 uM). Og 72 timer senere blev 10 pi CCK-8-opløsning tilsat til hver brønd. Derefter blev pladerne inkuberet ved 37 ° C i 1 time, cellelevedygtigheden blev bestemt ved scanning med mircoplate læser ved 450 nm.

Konditioneret medium forberedelse

fibroblaster blev udpladet og dyrket i DMEM /F12-medium med 10% FBS i 24 timer og derefter vasket tre gange med PBS og til slut dyrket i 3 ml serumfrit DMEM /F12-medium i 2 timer. Konditioneret medium blev opsamlet og filtreret gennem et 0,22 um filter (Merck Millipore, Massachusetts, USA) for at fjerne cellerester.

Isolering og karakterisering af exosomer frigives af fibroblaster

Exosomer blev isoleret fra dyrket fibroblaster ved hjælp Total exosome Isolation Kit (Invitrogen, Californien, USA). Kort fortalt blev 0,5 ml af den samlede exosome isolation reagens tilsat til hver 1 ml filtrerede konditionerede medier og blandes godt ved at vende. Efter inkuberet natten over ved 4 ° C blev blandingen centrifugeret ved 12.000 x g i 70min ved 4 ° C, og alle Supernatanten blev fjernet ved aspiration [7]. Exosom pellets blev resuspenderet med en bekvem volumen af ​​DMEM /F12-medium. En anden exosome isolation fremgangsmåden udføres ved seriel centrifugering som tidligere beskrevet [8]. Cellulær supernatant blev først centrifugeret ved 2.000 x g i 30 minutter, 10.000 x g i 40 min for at depletere døde celler og cellerester. Og derefter, exosomer og exosom-udtømte opløselige fraktioner blev separeret ved ultracentrifugering ved 100.000 x g 4 ° C i 70 min.

Morfologien og partikelstørrelsen af ​​exosomer blev karakteriseret via en transmission elektron mikroskopi (FEI Tecnai 20, Philips), der opererer på 160kV. Exosom proteiner blev ekstraheret fra exosomer anvendelse af SDS lysis buffer (250 nM Tris-HCI, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiner blev påført på 10% SDS-polyacrylamidgeler, elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner. Muse anti-humane CD81-antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, klon: 1.3.3.22, 1: 100) blev anvendt til immunoblotting. Protein bands blev visualiseret ved hjælp af Super Signal West Femto Maksimal følsomhed Substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Hæmning af exosome release

For yderligere at validere effekten af ​​exosomer, exosome frigive blev blokeret af dyrkning med 10 pM GW4869, en specifik inhibitor for neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2) [9]. Efter inkubation i 24 timer blev mediet, som indeholdt GW4869 kasseret, og celler blev vasket ved PBS i 3 gange. Så frisk DMEM /F12-medium blev tilsat, og konditioneret medium blev høstet som beskrevet ovenfor.

Sphere-formation assay

Grundlæggende procedurer for kugle-dannelse assay er tidligere beskrevet [10]. Cellerne blev resuspenderet i standard sfære-dannende medium [DMEM /F12 (Invitrogen, Californien, USA) suppleret med 1 × B27 serumsubstitut (Invitrogen, Californien, USA), 20 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor og 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor faktor (Sigma, St. Louis, USA). CRC-celler blev udpladet ved 300 ~ 500 celler /brønd i 24-brønds fastgørelsesplader ultralave (Corning, Massachusetts, USA) med eller uden indgivelse af 5-FU (1 uM) eller OXA (1 uM). For serielle kugle-formation analyser blev de første generation sfærer høstet, opdelt med 0,025% trypsin /EDTA, filtreret gennem 40-um mesh og re-belagte som ovenfor. Denne fremgangsmåde blev gentaget i op til 3 generationer. Ved behandling med kemoterapi eller /og CM /exosomer, kemoterapeutiske midler eller /og CM (200 pi) /exosomer (lig med 200 pi CM) blev tilsat hver 2 dage. Efter 5 ~ 14 dage, sfærer med diametre ≥ 50 um blev scoret og vist som clonogenicity (%) i tallene.

Animal undersøgelse

Animal protokoller blev godkendt af University udvalg for brug og pleje af Dyr (UCUCA) ved Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. I alle forsøg blev levedygtigheden af ​​celler bekræftes ved trypan blå-udelukkelse test, og celler blev resuspenderet i 100 pi PBS /Matrigel blanding (1: 1 volumen), efterfulgt af injektion i det subkutane væv af den venstre og højre tilbage område under anvendelse af en 27-gauge nål. SW620-celler blev subkutant implanteret i 4 uger gamle BALB /c-nu-mus, og XhCRC celler blev implanteret i 4 uger gamle NOD /SCID-mus. Fire til fem mus blev inokuleret pr gruppe. CM (200μ) eller exosomer (svarende til 200 pi CM) blev derefter injiceret subkutant hver 2 dage. Samtidig blev alle musene intraperitoneale injiceret med et kemoterapeutisk middel, 5-Fu (100 mg /kg legemsvægt) eller OXA (10 mg /kg legemsvægt) én gang om ugen. Tumorer blev monitoreret, og tumorvolumener blev undersøgt hver tredje dag. Efter aflivet blev tumorer fjernet fra mus og vejet for at evaluere tumorudvikling. Til begrænsende fortynding assays, 100.000, 10.000, 1.000 og 100 renset CD133

+ og CD133

– /lo CRC celler blev implanteret inimmunodeficient mus. Tumor-initierende frekvens og statistisk signifikans blev vurderet med Extreme begrænset fortynding Analysis (ELDA) “limdil ‘funktion (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).

immunfluorescensmikroskopi

immunfluorescensmikroskopi er tidligere beskrevet [11] .CAFs eller XhCRC celler blev dyrket på 0,17 mm dækglas eller glas-bund petriskåle i monolag natten. Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved stuetemperatur og efterfulgt af blokering i 5% (vægt /vol) bovint serumalbumin (BSA) i PBS-buffer i 1 time. Primære antistoffer blev fortyndet i 1:50 i 5% BSA. Efter inkuberet natten over ved 4 ° C blev cellerne derefter skyllet tre gange med PBS og efterfulgt af inkubation med Alexa Fluor 488-konjugerede sekundære antistoffer (fortyndet 1:50 i 5% BSA) i 2 timer ved stuetemperatur. Endelig DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, Sigma) blev anvendt til at visualisere cellekerner i 10 min ved stuetemperatur. Objektglas blev undersøgt under et konfokalt mikroskop (FV1000, Olympus).

Dil-mærkede exosomer overføre

Oprensede exosomer afledt fra 18Co-celler blev mærket med lipofile fluoescentcarbocyanine farvestoffer Dil ifølge fabrikantens protokol (Santa Cruz Biotecnology, CA, USA) .18Co-exosomer blev suspenderet i 100 ul PBS og inkuberet med 1 pi Dil i 15 minutter ved 37 ° C, vasket to gange for at fjerne overskydende farvestof, og inkuberet med SW620-celler ved 37 ° C natten over.

Lentivirale reporter analyser

TCF /LEF reporter kørsel ekspressionen af ​​GFP (TOP-GFP) lentivirus blev købt fra SBO Medical Biotechnology Company, Shanghai, Kina. SW620 celler blev inficeret med TOP-GFP lentivirus ved MOI = 25 til 72 timer. For kugle dannelse assays, TOP-GFP

+ og TOP-GFP

– fraktioner blev sorteret ved hjælp af FACS og forgyldt med ultralav vedhæftede plader som beskrevet ovenfor. Til evalueret virkningerne af CM /exosomer på Wnt aktivitet af CD133

+ fraktioner, 50.000 CD133

+ SW620-celler blev inficeret med TOP-GFP lentivirus og udpladet i plader med 6 brønde, efterfulgt af CM /exosomer behandling eller plus kemoterapi. Efter 3 dages inkubation blev ekspression af TOP-GFP analyseret ved flowcytometri.

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Generelt uparret to-halet Students

t

-test eller to-vejs ANOVA-test blev udført på IBM SPSS Statistics 18 til at sammenligne forskellene mellem hjælp af forskellige behandlingsgrupper. En

P

-værdi 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

CD133 identificerer CSCS i en CRC-cellelinje og xenograft afledt primær kolorektal cancer tumor

CSCS er en sjælden befolkning inden for colorectal cancer, som udviser selvfornyende og tumorigen kapacitet [12]. Brugen af ​​CD133, en overflade maker, at berige CSCS er vigtigt at adskille tumorigene og ikke-tumorigene celler [2]. Vi først etablerede xenotransplantattumorer (XhCRC) stammer fra en kvindelig patient med Duke C colorectal adenocarcinom i kvindelig NOD /SCID-mus. Når xenotransplantattumorer voksede op, blev tumorer forarbejdet til en enkelt celle suspensioner, og vi derefter sorteres to cellepopulationer (dvs. EpCAM

+ CD133

+ og EpCAM

+ CD133

– /lo) baseret på ekspression af epitel markør (dvs. EpCAM) og den formodede CSC markør (dvs. CD133) (fig 1A) .Den renheden af ​​EpCAM

+ CD133

+ og EpCAM

+ CD133

– /lo celler var både 96% (fig 1B). For at bekræfte at EpCAM

+ CD133

+ celler berige CSCS, gennemførte vi begrænsende fortynding assays. Som forventet, EpCAM

+ CD133

+ celler viste højere tumor-produktionskapacitet (

P

0,001) (figur 1C). Tilsvarende renset CD133

+ SW620 celler, et udbredt CRC cellelinie, også iværksat mere (

P

0,001) (figur 1C). I overensstemmelse med LDA’er, demonstrerede serielle sfære-formation analyser, renset EpCAM

+ CD133

+ celler var i stand til at blive passeret i mindst tre generationer og viste en øget kugle-formerings kapacitet, mens EpCAM

+ CD133

– /lo celler dannet meget mindre kugler i en

o generation (

P

0,001) og EpCAM

+ CD133

– /lo celle-initieret kugler afbrudt af 2

o generation (fig 1D og 1E). Desuden renset CD133

+ SW620 celler, blev også udstillet en gradvis øget kugle-formerings kapacitet sammenlignet med CD133

– /lo SW620cells (

P

0,001) (Fig 1F og 1G ). Disse data viste, at CD133

+ CRC celler besad langsigtet clonogenicity i både xenotransplantattumorer og SW620 celler, hvilket antyder, at CD133

+ CRC-celler, i vores eksperimentelle system, kan berige for formodede CSCS. For nemheds skyld, herfra og fremefter, henviser vi til EpCAM

+ CD133

+ eller CD133

+ og EpCAM

+ CD133

– /lo eller CD133

– /lo celler som CSCS og ikke-CSCS henholdsvis

(A) Skematisk af CD133

+ og CD133

-. /lo tumorceller sortering fra dissocieret kolorektal xenograft tumor ved FACS. (B) Et repræsentativt eksempel på post-sortering analyse af den sorterede CD133

+ og CD133

-. /Lo XhCRC celler (C) Tumor-initierende hyppigheden af ​​CD133

+ og CD133

– /lo CRC celler i immundefekte mus (GD) Serial sfære dannelse assays for renset CD133

+ og CD133

– /loCRC celler (dvs. XhCRC og SW620). Spheres blev optalt (D, F) og repræsentative billeder er vist (E, G) .Scale barer, 100 um ***

P

0,001.

CSCS udviser celle-autonome kemoresistens

Som CSCS er blevet rapporteret til at være relativt resistent over for kemoterapi [13-16], vi afhørt reaktion CSCS og ikke-CSCS til konventionelle kemoterapeutiske midler (5-FU eller oxa) ved CCK-8 aktivitetsassays. Ja, i både XhCRC og SW620 celler, kemoterapi-induceret celledød blev signifikant reduceret i CSCS i forhold til ikke-CSCS (Fig 2A,

P

0,01 i 5-Fu gruppe,

P

0,001 i OXA gruppe, 2B,

P

0,001), hvilket indikerer, at CSCS kan være naturligt resistente over for kemoterapeutiske midler. At bestemme den endelige cellulære fænotype ansvarlig for denne forskel, behandlede vi Bulk XhCRC og SW620-celler med 5-FU eller OXA i 3 dage, og derefter detekteret procentdelen af ​​celler, der udtrykker CD133 ved flowcytometri. Som forventet, CD133

+ -celler steg 0,5-1 gange efter kemoterapeutisk behandling (Fig 1D og 1E), og endvidere de resterende CRC-celler (dvs. indeholdende mere CD133

+ -celler) viste også en øget sphere- danner kapacitet (fig 2E,

P

0,01, 2F,

P

0,001), hvilket tyder på, at kemoterapi, ja, beriger CSCS i tyktarmskræft gennem CSC-celle-autonome kemoresistens.

(A, B) Celledød analyse af CSCS og ikke-CSCS fra XhCRC eller SW620-celler blev vurderet ved CCK-8-aktivitet assay ved kemoterapeutisk behandling (5-FU eller OXA). **

P

0,01, ***

P

0,001. (C, D) Berigelse af CSCS i løs celler fra XhCRC (C) og SW620-celler (D) blev vurderet ved FACS-analyse baseret på CD133 udtryk ved kemoterapi. (E, F) Sphere-dannende evne af bulk-celler (XhCRC eller SW620 celler) forbehandlet af kemoterapeutiske midler eller DMSO (Ctrl). **

P

0,01, ***

P

0,001.

fibroblast-afledte konditioneret medium primet SW620 CSCS og dermed bidraget til resistens

Nylige undersøgelser har vist, at tumor mikromiljø medierer resistens [17], og carcinoma-associerede fibroblaster (CAF), som en vigtig del af mikromiljø, er dybt involveret i kemoterapeutisk modstand [18, 19]. Faktisk efter kemoterapi behandling, CAF kunne aktiveres og vedligeholdes CSCS pulje dermed bidrage til resistens [20]. Imidlertid har en nylig undersøgelse vist, at CAF, selv uden aktivering af kemoterapeutiske stoffer, fremme tumor stemness i kolorektal cancer [21], hvilket betyder, at CAF kan prime CRC celler til at øge tumor stemness før kemoterapi, og som kan således bidrage til terapeutisk modstand.

for at afgøre, om fibroblaster prime CSCS dermed bidrage til resistens, vi høstet konditioneret medium fra dyrkede 18Co (18Co-CM) uden administration af kemoterapeutiske midler. Vi derefter udført sfære dannelse assays med 18Co-CM i SW620 CSCS efter indgivelse af 5-FU eller OXA. Forventeligt, 18Co-CM behandlede SW620 CSCS genereret flere og større kugler end SW620 CSCS i kontrol medium (

P

0,001) (figur 3A). For yderligere at bekræfte virkningerne af 18Co-CM in vivo, vi implanteret 50.000 CSCS subkutant i bilaterale ryggen på BALB /c-nu-mus (n = 5), som blev injiceret intraperitonealt med kemoterapeutiske midler hver uge og også modtaget injektion af 18Co- CM eller kontrolmedium hver 2. dag. I konkordans med

in vitro

resultater, 18Co-CM behandlede mus manifesteret højere tumorincidensen, hurtigere tumorvækst og større tumorer, hvilket illustrerer, at 18Co-CM er i stand til at beskytte xenotransplantattumorer fra kemoterapi (Fig 3B og 3C). disse resultater antyder, at fibroblast-afledte konditionerede medium uden kemoterapi behandling kan prime CSCS og således fremme kemoresistens i CRC.

(A) Sphere-dannende evne SW620 CSCS behandlet med 18Co-afledt CM under kemoterapi (5-FU eller OXA). Repræsentative mikroskopiske billeder vises. Scale barer, 100 um. (B, C) 18Co-afledt konditioneret medium påvirket tumorvækst af SW620 CSCS i Balb /c-nu-mus behandlet med OXA. Tumorvækstkurver er vist i C, Vist i D er tumorvægte og billeder i slutningen af ​​eksperimenter. Data er præsenteret som middelværdi ± SD; *

P

0,1; **

P

0,05; ***

P

0,001.

CAF-afledt konditioneret medium primet XhCRC CSCS og fremmes kemoresistens

For at undersøge, om CAF prime CSCS isoleret fra patient-afledt xenograft (XhCRC) og dermed bidrage til resistens. Vi først separeret og dyrkede primære carcinoma-associerede fibroblaster (CAF) fra en kvindelig patient med Duke B colorektal adenocarcinom, og immunfarvning bekræftede, at disse celler var positive for fibroblast markører såsom vimentin [22], α-SMA [23] og FAP [ ,,,0],24] og negativ for epitelcelle markør EpCAM [25] (fig 4A). Vi derefter høstet konditioneret medium fra dyrkede CAF (CAF-CM) og udførte kugle-formation assays med CAF-CM eller kontrollere medium i XhCRC CSCS. I overensstemmelse med fund i SW620 CSCS, CAF-CM også fremmet kugle-produktionskapacitet af XhCRC CSCS og beskyttet dem mod kemoterapi (5-Fu eller OXA) (Fig 4C,

P

0,001 i 5-Fu gruppe ,

P

0,01 i OXA gruppe). Som tidligere rapporteret, kunne kemoterapi ikke kun inducerer cancercelle apoptose men også ændre tumormikromiljøet i faste tumorer [20, 26]. At evaluere, om kemoterapi gør nogle forskelle i tumor-inducerende virkninger af CAF behandlede vi CAF med 5-FU /OXA eller DMSO i 12 timer, og efter skylning kemoterapeutiske midler, blev konditioneret medium høstet som beskrevet i

Materialer og metoder

. viste imidlertid, vores data, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem kemoterapi-behandlede CAF og DMSO-behandlede CAF, alle CAF-CMS kan øge kugle-dannende evne XhCRC CSCS (Fig 4D,

P

0,001 DMSO -CM /5-Fu vs. kontrol,

P

0,01 OXA-CM vs. kontrol), hvilket indebærer, at cafeer allerede prime CSCS gennem parakrin måde før kemoterapi. For yderligere at udforske virkningerne af CAF-CM på tumorvækst i XhCRC CSCS, vi subkutant injiceret 50.000 XhCRC CSCS bilaterale ryggen af ​​kvindelig NOD /SCID-mus (n = 4), som samtidig modtog OXA og CAF-CM. I overensstemmelse med

in vitro

fund, CAF-CM-behandlet XhCRC CSCS genereret hurtigere voksende og større tumorer sammenlignet med kontrol medium (Fig 4E og 4F). Ligeledes ved behandling med 5-FU, CAF-CM-behandlet XhCRC CSCS igangsat flere tumorer sammenlignet med kontrol medium (Fig 4G).

(A) CAF afledt af patientprøve blev valideret af positiv immunfarvning for CAF markører (α-SMA, vimentin og FAP) og negative immunfarvning for en epitelial markør (EpCAM). Scale barer, 30 um. (B) XhCRC CSCS blev valideret af positiv immunfarvning for epitelial markør (EpCAM) og CSC markør (CD133), Scale barer, 10 um. (C) Sphere-dannende evne XhCRC CSCS i CAF-afledte konditionerede medier (fx 5-FU, OXA, DMSO-behandlede CAF). (D) Sphere-dannende evne XhCRC CSCS behandlet med CAF-afledt CM under kemoterapi (5-FU eller OXA). Repræsentative mikroskopiske billeder vises. Scale barer, 50 um. (E, F) CAF-afledte CM påvirkes på tumorvækst af XhCRC CSCS i NOD /SCID-mus behandlet med OXA. Tumorvækstkurver er vist i E, Vist i F er tumorvægte og billeder i slutningen af ​​eksperimenter. Data er præsenteret som middelværdi ± SD; *

P

0,1; **

P

0,05. (G) CAF-afledte CM påvirkes på tumorvækst i XhCRC CSCS transplanteret i kvindelig NOD /SCID-mus ved behandling med 5-FU.

Kollektivt, disse resultater viser tydeligt, at CAF prime CSCS og dermed fremme kemoresistens i colorektal cancer via secernerende opløselig faktor (er).

Fibroblaster afledt exosomer prime CSCS at være mere kemoresistens

Nylig dokumentation tyder på, at exosomer, opløselige faktorer der udskilles af en række celler , er blevet impliceret i metastase og medikamentresistens [8, 27, 28]. Vi antager, at exosomer også kan bidrage til medikamentresistens i vores eksperimentelle system. Derfor vi først renset exosomer fra 18Co-CM og CAF-CM som beskrevet i

Materialer og metoder

, og derefter bekræftet deres strukturel art under fase-kontrast-elektronmikroskopi (Fig 5A) og ved immunblotting af exosome markørprotein CD81 (fig 5B). For at undersøge om fibroblast-udskilte exosomer kan overføre til CRC celler, vi mærkede exosomer med Dil, en lipofil fluorescentcarbocyanine farvestof. Vi observerede, Dil-mærkede exosomer afledt fra 18Co celler blev taget op af SW620-celler efter 12 timer samtidig inkubation (Fig 5C). Vi derefter behandlet CSCS med oprensede exosomer i stedet for CM, og fandt, at både SW620 og XhCRC CSCS behandlet med exosomer genereret flere kugler (

P

0,01) (Fig 5D og 5E), hvilket antyder at exosomer, som er afledt fra fibroblaster, kan prime CSCS at blive mere kemoresistens. For yderligere at bekræfte, at fibroblast-udskilte exosomer snarere end andre opløselige faktorer tage de ovennævnte effekter, vedtog vi standarden forskellen ultracentrifugering, i stedet for alt exosome Isolation Kit, for at isolere exosomer. Svarende til kit-renset exosomer, CM, pellet-behandlede SW620 CSCS dannet flere kugler sammenlignet med kontrol pellets (

P

0,001 i 5-Fu gruppe,

P

0,01 i OXA gruppe), og exosomet-udtømte supernatant fra 18Co-CM tog ikke denne effekt (

NS kontrol pellet vs supernatant

) (fig 5F). For yderligere at bekræfte, om fibroblast-afledte exosomer mægle i resistens, vi behandlede fibroblaster (18Co og caféer) med GW4869, en specifik neutral sphingomyelinase (nSMase) -hæmmer, som blokerer exosomer frigive, og derefter opnået CM (dvs. exosom-forarmet CM) . I overensstemmelse med de tidligere resultater, exosom-udtømte CM bemærkelsesværdigt faldt kemoresistens af CSCS (Fig 5G,

P

0,001, 5H, i 5-Fu gruppe,

P

0,001 i OXA gruppe). Desuden

in vivo

forsøg viste også, at XhCRC CSCS, mens behandling med CAF-afledte exosomer, genereret hurtigere voksende (Fig 5I og 5K) og større tumorer (

P

0,05 ) (fig 5J og 5L) under kemoterapi (5-FU eller OXA). Disse data viste klart, at fibroblaster-afledte exosomer primet CSCS at være mere resistens.

(A) Transmission elektronmikroskopisk billede af exosomer stammer fra 18Co celler og CAF. Scale barer, 100nm. (B) Western blotting af CD81 i exosomer. (C) repræsentant mikroskopi af SW620 celler udsat for DiI-mærkede exosomer i 12 timer. (D, E) Sphere-dannende evne SW620 eller XhCRC CSCS behandlet med 18Co /CAF-afledte exosomer under kemoterapi (5-FU eller OXA). (F) Sphere-dannende evne SW620 CSCS behandlet med ultracentrifugering-oprenset 18Co-afledte exosomer under kemoterapi (5-FU eller OXA). (G, H) fibroblaster blev behandlet med 10 mM GW4869 (opløses i DMSO) i 24 timer. CMS afledt GW4869 /DMSO-forbehandlede fibroblaster blev tilføjet til CSCS. (I-L) CAF-afledte exosomer ramt på tumorvækst af XhCRC CSCS i NOD /SCID mus behandlet med 5-FU eller OXA. Tumorvækstkurver er vist i I (5-FU) og K (OXA), og tumorvægte og billeder i slutningen af ​​eksperimenter er vist i L (5-FU) og J (OXA). Data er præsenteret som middelværdi ± SD; *

P

0,1; **

P

0.05.

Exosomer prime CSCS gennem Wnt signalvej

Det er tidligere blevet vist, at Wnt signalering aktivitet er en funktionel markør for cancer stamceller og er af afgørende betydning at opretholde stemness i tyktarmen cancere. På en måde svarende til normale intestinale stamceller, Wnt aktivitet er ikke blot en celle-intrinsisk funktion, der kan anvendes til at definere coloncancer stamcelle (CSC) befolkning, men det er også reguleret af den ydre mikromiljø [29-32] . Wnt aktivitet er associerede med T-celle faktor /lymfoide forstærker faktor (TCF /LEF) familie af transkriptionsfaktorer, som aktiverer specifikke Wnt målgener [33, 34].

For at afhøre om exosomer prime CSCS via Wnt signalering