PLoS ONE: Twist1 Fremmer Gastric Cancer Cell Proliferation gennem opregulering af FoxM1

Abstrakt

Twist-relateret protein 1 (Twist1), også kendt som klasse En grundlæggende helix-loop-helix protein 38 (bHLHa38) , er blevet impliceret i celle afstamning bestemmelse og differentiering. Tidligere undersøgelser viser, at Twist1 udtryk opreguleret i mavekræft med dårlige kliniske resultater. Desuden er Twist1 foreslået at være involveret i progression af human gastrisk cancer. Men dens biologiske funktioner stort set uudforsket. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at Twist 1 overekspression fører til en signifikant opregulering af FoxM1, som spiller en central rolle i cellecyklusprogression i gastriske cancerceller. I modsætning hertil knockdown Twist 1 reducerer FoxM1 ekspression, hvilket antyder, at FoxM1 kan være en direkte transkriptionel mål Twist 1. På molekylært niveau, vi yderligere afslører, at Twist 1 kunne binde til promotorregionen af ​​FoxM1, og efterfølgende rekruttere p300 at inducere FoxM1 mRNA-transkription. Derfor er vores resultater afdække en tidligere ukendt Twist 1 /FoxM1 regulatoriske vej, som kan hjælpe til at forstå mekanismerne i mavekræft spredning

Henvisning:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Fremmer Gastric Cancer Cell Proliferation gennem opregulering af FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: 3. september 2013; Udgivet: 24 okt 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial-mesenchymale-overgang (EMT) er en proces, hvorved epitelceller mister polaritet og celle-til-celle-adhæsion, og undergår dramatiske ombygning af cytoskelettet [1,2]. Samtidig med tab af epitel celleadhæsion og cytoskeletale komponenter, celler undergår EMT erhverve ekspression af mesenchymale komponenter og en vandrende fænotype [2,3].

Flere vigtige inducere af EMT er transkriptionsfaktorer, herunder Twist 1, sneglen, og Slug, der undertrykker E-cadherin udtryk [4,5]. Twist1 tilhører den grundlæggende helix-loop-helix transcription faktor familien [6]. Oprindeligt Twist1 blev foreslået at være afgørende for udviklingen af ​​mesodermalt afledte væv, herunder muskler og osteogene cellelinier [7,8]. Efterfølgende undersøgelser har vist, at Twist 1 fremmer EMT og spiller en væsentlig rolle i metastase i flere tumormodeller [9,10]. Ekspression af Twist 1 har også været impliceret i at fremme metastase og invasive patologiske undertyper i flere typer af carcinom [11]. Derfor Twist 1 er blevet foreslået at have oncogene egenskaber. For eksempel overekspression af Twist i rhabdomyosarcom inhiberer Myc-induceret apoptose og interfererer med p53 tumor suppression [12]. Opregulering af Twist er associeret med malign transformation i T-celle-lymfom [13]. Tvungen ekspression Twist udløser modstand af humane cancerceller til lægemidler, der hæmmer mikrotubulusdannelse [14].

Men virkningen og mekanismen Twist genet på spredning af gastrisk karcinom forbliver gådefuld. Nylige undersøgelser har vist, at Twist1 opreguleres i gastriske cancerassocierede fibroblaster med dårlige kliniske resultater [15]. Desuden, nedregulering af Twist 1-genet undertrykte proliferationen af ​​gastriske cancerceller ved negativt at regulere AP-1-aktivitet resulterer i cyclin D1-ekspression faldende [16]. I nærværende arbejde blev to gastrisk cancer cellelinjer ansat til at undersøge effekten og mekanismen Twist 1 genet på celleproliferation.

Materialer og metoder

Cell Culture

Fire epiteliale cellelinjer (NCI-N87, AGS, HGC-27 og MGC80-3) afledt af gastrisk karcinom blev opnået fra American Type Culture Collection (USA). Celler blev dyrket i DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Beijing). Kulturer blev opretholdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Små interfererende RNA, RNA ekstraktion og Real-time analyse

Celler blev podet på 6- brønd plader dernæst transficeret med 50 nM siRNA oligoer målrettet humant Twist 1 (Dharmacon, USA). SiRNA-molekylet er specifikt for grønt fluorescerende protein (GFP) blev anvendt som negativ kontrol. Totale RNA’er blev ekstraheret fra celler ved TRIzol-reagens, og reverse transskriptioner blev udført af Takara RNA PCR kit (Takara, Kina) ved at følge fabrikantens protokol. For at kvantificere udskrifter af rente- gener, real-time PCR blev udført ved hjælp af en SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) på Light Cycler 480 (Roche, Schweiz).

transiente transfektioner og luciferaseassays

Humant FOXM1 promotoren blev amplificeret fra human genomisk DNA-skabelon og indsat i pGL4.15 Basic Vector (Promega). Mutant Twist1 bindende motiv blev genereret ved anvendelse af et PCR-mutagenese kit (Toyobo) med en primer (mutationssteder understreget): 5′-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 ‘og en revers komplement primer. Alle transiente transfektioner blev udført ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), ifølge producentens instruktioner. For luciferasereporteren assays blev celler udsået i plader med 24 brønde og transficeret med de angivne plasmider. 48 timer efter transfektion blev luciferaseaktiviteter målt ved anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-immunfældning

Celler blev høstet, resuspenderet i lysepuffer indeholdende 50 mM Tris- HCI (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) og proteasehæmmere. Lysater blev inkuberet med 2,5 ug af p300 eller IgG natten over ved 4 ° C. Protein A-perler blev tilsat til yderligere 4 timer. Perler indeholdende immunkomplekser blev vasket med 1 ml iskold lysepuffer til fire gange. Præcipitater blev denatureret i Laemmli (gel loading) buffer ved 95 ° C i 10 min.

Western Blot

Celler blev høstet ved trypsinisering, lyseret i Laemmli-buffer, denatureret i 10 min ved 80 ° C, og løses på SDS /PAGE-geler. Efter immunblotting blev membranerne blokeret i PBS /0,1% Tween-20 med 7,5% fedtfri tørmælk, og primære antistoffer blev inkuberet i PBS /0,1% Tween-20 med 0,1% -5% fedtfri tørmælk. Antistoffer rettet mod Twist 1 blev FoxM1 indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-p300 og GAPDH antistoffer blev opnået fra Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, cyclin B1, cyclin D1, cyklin D2, cyclin E og E-cadherin antistoffer var fra Cellsignaling (USA).

chromatin Immunfældning (chip) assay

kromatin immunopræcipitation ( chip) assay kit blev brugt (Upstate, USA). Kort beskrevet blev celler fikseret med 1% formaldehyd og viderebehandles ved anvendelse Upstate chip assay kits. Opløseligt kromatin blev immunfældet med anti-Twist 1 og IgG-antistoffer. Efter oprensning blev DNA-prøver kvantificeret ved kvantitativ realtids-PCR under anvendelse af primere, der omfatter proximale region af humant FoxM1 promotor.

Statistisk Analyse

Alle data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistiske forskelle bestemtes ved en to-halet t-test. Statistisk signifikans er vist som * (P 0,05), ** (P 0,01) eller *** (P 0,001).

Resultater

Effekt af Twist1 på mavekræft celledeling

På det første, at udforske den funktionelle rolle af Twist 1 i celleproliferation, vi transducerede NCI-N87 eller AGS celler med adenovira indeholdende Twist 1 eller tom vektor (figur 1A og 1B). I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, ekspressionen af ​​E-cadherin, en biomarkør for EMT-processen [4,5], blev nedreguleret ved Twist 1 overekspression (Figur S1A-1B). Desuden Twist en overekspression resulterede i en betydelig stigning i celle antallet af alle testede celler (figur 1C og 1D). Konsekvent, bromdeoxyuridin (BrdU) analyse bekræftede også, at Twist en overekspression fremmet celledeling (figur 1E og 1F). Desuden Twist 1 overudtrykker celler havde en signifikant lavere procentdel af celler i G1 /G0 fase og forøget procentdelen af ​​celler i S-fasen, sammenlignet med tom vektor-transficerede celler (figur 1G-1 H).

( AB) repræsentant western blot analyse af Twist 1 ekspression i NCI-N87 (A) eller AGS (B) celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1.

(CD) væksten kurve af NCI -N87 (C) eller AGS (D) celler transficeret med tom vektor (EV) eller Twist 1.

(ES) den celleproliferative potentiale (BrdU) blev bestemt i NCI-N87 (E) eller AGS (F) celler transficeret med tom vektor (EV) eller Twist 1.

(GH) cellecyklussen fase af NCI-N87 (G) og AGS (H) celler transficeret med tom vektor (EV) eller Twist 1 blev analyseret ved flowcytometri. Celler blev mærket i 15 minutter med PI og straks analyseret ved flowcytometri. Histogrammer repræsenterer procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen (G0 /G1, S og G2 /M).

Dernæst NCI-N87 eller AGS celler blev transficeret med lille interfererende RNA (siRNA ) målretning Twist 1. siRNA oligo viste effektiv Twist 1 knockdown i disse to celler, sammenlignet med GFP siRNA-transducerede celler (figur 2A-2D). Som et resultat, nedregulering af Twist 1 ført til en markant nedgang i celleantal og proliferation i disse celler (Figur 2E-2H). Derudover silencing Twist 1 steg signifikant procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen og faldt procentdelen af ​​celler i S-fasen (figur 2I-2J). Især vi sammenlignet spredning aktivitet af NCI-N87 og AGS-celler med eller uden transfektion af tom vektor eller GFP siRNA. Vores resultater tyder på, at hverken tom vektor eller GFP siRNA påvirker celleproliferation-aktivitet (figur S2A). Desuden er væksten evne celler, der udtrykker højere Twist 1 niveauer (NIC-N87 og AGS celler) er relativt højere end andre (HGC-27 og MGC80-3 celler) (Figur S2C). Tilsammen vores resultater antyder, at Twist 1 kan være en vigtig positiv regulering af gastrisk cancer celleproliferation.

(AD) Kvantitativ realtids-PCR og western blot analyse af Twist 1 ekspression i NCI-N87 (AB) eller AGS (CD) celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

(ES) væksten kurve af NCI-N87 (E) eller AGS (F) celler celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

(GH) den celleproliferative potentiale (BrdU) blev bestemt i NCI-N87 (G) eller AGS (H) celler transficeret med siRNA oligoer målretning Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

(IJ) cellecyklussen fase af NCI-N87 (i) og AGS (J) celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller scramble siRNA (Ctrl) blev analyseret ved flowcytometri.

Twist1 påvirker ekspressionen af ​​celle-cyklus regulatorer

Som Twist en fremmet celleproliferation, vi undersøgte sine funktioner på ekspressionen af ​​de gener, der regulerer G1 /S overgang, herunder CDK hæmmere p21

Cip1, p27

Kip1, den CDK regulator cyclin B1, cyclin D1, cyclin D2 og cyclin E. Resultater fra real-time PCR og western blotting analyse i NCI-N87 celler antydede, at ekspressionen af ​​p21

Cip1, p27

Kip1 blev nedreguleret mens cyclin B1, cyclin D1, cyklin D2 og cyclin E niveauer blev opreguleret i Twist 1-transficerede celler, sammenlignet med tom vektor-transficerede celler (figur 3A-3B). Lignende resultater blev også observeret i AGS celle (figur 3C-3D), hvilket yderligere bekræfter, at Twist 1 kan påvirke udbredelsen af ​​gastriske cancerceller. Konsekvent, knockdown Twist en øget p21

Cip1 og p27

Kip1 udtryk mens reduceret cyclin B1, cyclin D1, Cyclin D2 og cyclin E-ekspression i NCI-N87 og AGS celler (figur 4A-4D).

(AD) Kvantitativ realtids-PCR og Western blot-analyse af p21, p27, cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 og cyclin E i NCI-N87 (AB) eller AGS (CD) celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1.

(AD) Kvantitativ realtids-PCR og Western blot-analyse af p21, p27, cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 og cyclin E i NCI-N87 (AB ) eller AGS (CD) celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

Twist en direkte rettet mod transskription faktor FoxM1 i gastriske kræftceller

Tidligere undersøgelser har vist, at flere transkriptionelle faktorer kan regulere en række gener der er relevante for cellecyklus, herunder p21

Cip1, p27

Kip1 og cyclin B1. Således har vi analyseret de potentielle transkriptionelle faktorer, der deltager i reguleringen af ​​celleproliferation. Ud af fem testede transkriptionelle faktorer, kun FoxM1 viste sig at være steget betydeligt i NCI-N87 celler overekspression Twist 1 (figur 5A-5B). Induktionen af ​​FoxM1 blev også observeret i AGS celler (figur 5C-5D). Desuden blev FoxM1 ekspression reduceres i disse celle-udtømt Twist 1 (figur 6A-6D), hvilket antyder, at FoxM1 kunne være et mål Twist 1.

(AB) Kvantitativ realtids-PCR (A) og western blot (B) analyse af FoxM1, FoxO1, Stat3, p53 og E2F1 ekspression i NCI-N87-celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1.

(CD) Kvantitativ realtids-PCR ( C) og western blot (D) analyse Twist 1 ekspression i NCI-N87 celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1.

(AB) Kvantitativ realtids-PCR (A ) og western blot (B) analyse af FoxM1 udtryk i NCI-N87 celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

(CD) Kvantitativ real-time PCR (C) og vestlige blot (D) analyse af FoxM1 udtryk i NCI-N87 celler transficeret med siRNA oligoer målrettet Twist 1 eller negativ kontrol siRNA (Ctrl).

Twist 1 opregulerer FoxM1 udtryk gennem rekruttering af p300

Dernæst fokuserede vi på den molekylære mekanisme Twist en regulering af FoxM1 transskription. Sekvensanalyse viste, at promotorregionen af ​​humant FoxM1 genet indeholdt en potentiel Twist 1 bindingsstedet (mellem -357 og -352 bp) (figur 7A). Luciferase rapport assay viste, at den transskriptionelle aktivitet af vildtype FoxM1 promotor dramatisk blev opreguleret ved Twist 1, hvorimod den transkriptionelle aktivitet blev afskaffet i promotoren bærer en mutation i Twist 1-bindingssteder (figur 7B). Desuden viste chip assays, at Twist en entydigt kunne binde til FoxM1 promotor (Figur 7C). At afgøre, om induktion af FoxM1 ved Twist 1 er nødvendig for dens proliferative effekt, vi udført eksperimenter med FoxM1 knockdown hjælp siRNA oligoer i NCI-N87-celler (Figur S3A-S3B). Som følge heraf siRNA reddede celler fra den proliferative effekt af Twist 1 overekspression (fig S3C). Konsekvent, blev funktioner Twist 1 på ekspressionsniveauerne af celle-cyklus regulatorer også vendt ved FoxM1 siRNA oligoer (Figur S3D), tyder på, at FoxM1 er nødvendig for roller Twist 1 i mavens kræftceller.

(A) Diagram over Twist 1-bindingssted i den menneskelige FoxM1 promotor (1 kb) og to FoxM1 luciferase journalister. WT-Luc: vildtypeluciferase reporter; Mut-Luc: luciferase reporter bærer punktmutationer af Twist 1 bindingssted. Mutationer blev understreget.

(B) Aktivering af FoxM1 luciferase reportere ved Twist 1 i NCI-N87-celler.

(C) Bindingen af ​​Twist 1 på promotorregionerne af human FoxM1 gen var analyseret ved chip assays og kvantificeres ved real-time PCR. Regionen indeholdende -2000 til -1800 bp blev anvendt som en negativ kontrol.

(D) Co-immunoudfældning af p300 og Twist 1 i NCI-N87 celler.

(E) Aktivering af FoxM1 luciferase journalister ved Twist 1 og p300 i NCI-N87 celler.

(F) repræsentative Western blot-analyse af p300-ekspression i NCI-N87 celler transficeret med siRNA targeting p300 eller negativ kontrol (Ctrl).

(GH) Kvantitativ realtids-PCR (G) og western blot (H) analyse af FoxM1 ekspression i NCI-N87 celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1. celler blev præ-transficeret med siRNA oligoer målrettet p300 eller negativ kontrol siRNA (CTRL) i 24 timer.

Som en transkriptionel faktor, kan Twist en rekruttere coaktivatorer i reguleringen af ​​target genekspression. Tidligere undersøgelser viste, at p300 kunne fungere som en co-aktivator for mange transkriptionsfaktorer. Vi undersøgte således, om p300 kunne være en co-aktivator til Twist en regulering af FoxM1 udtryk. Som vist i figur 7D, kunne Twist 1 interagerer med p300 efter co-immunpræcipitationseksperimenter. Den transkriptionelle aktivitet af FoxM1 promotoren blev yderligere opreguleres ved co-transfektion af p300 og Twist 1 (figur 7E). Desuden har vi yderligere afskaffet p300 ekspression under anvendelse siRNA oligoer i NCI-N87-celler (figur 7F). Som forventet blev Twist 1-induceret FoxM1 udtryk betydeligt sløvet af tavshed af p300 (figur 7G-7H). Ovenstående data viste, at Twist en opreguleret FoxM1 udtryk gennem en rekruttering af transkriptionelle coaktivator komplekser, herunder p300.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vores resultater indebærer Twist 1 som en kritisk regulator af gastrisk cancer progression. Dette antydes af flere linjer af beviser. Først Twist en overekspression fremmer mens dens mangel hæmmer celledeling, som vist ved BrdU og celle-cyklus analyse. For det andet, Twist 1 påvirker gener udtryk for celle-cyklus modulatorer, herunder CDK hæmmere p21Cip1, p27KIP1, den CDK regulator cyclin B1, cyclin D1, Cyclin D2 og cyclin E. tredje, Twist en direkte opregulerer FoxM1 udtryk på transkriptionsniveauet gennem rekruttering af P300. Derudover knockdown af endogen FoxM1 ekspression dæmper den proliferative effekt af Twist 1, hvilket antyder, at FoxM1 er afgørende for roller Twist 1 i gastriske cancerceller.

Hos voksne er Twist 1 hovedsageligt udtrykkes i precursorceller herunder osteoblastiske, myogene, odontoblastic og myelomonocytiske afstamninger, at opretholde deres udifferentierede tilstand [17]. Desuden Twist1 er også en vigtig regulator af mange andre biologiske processer, herunder mesenkymale udvikling og brun fedtstofskiftet. For eksempel er Twist1 menes at inhibere osteoblast differentiering ved negativt at regulere Runx2 [17]. Desuden er Twist-1 udtrykkes selektivt i fedtvæv, interagerer med PGC-1α, at undertrykke mitochondrial metabolisme og frakobling. Som et resultat, transgene mus overudtrykker Twist-1 i fedtvæv er tilbøjelige til højt fedtindhold-kost-induceret fedme, paa grund af dets heterozygote knockout-mus er fedme resistente [18]. Desuden blev Twist 1 nuklear ekspression også observeret i ikke-noncancerous epitel, hvilket antyder, at Twist 1 kan have en fysiologisk rolle i normale celler [19]. Efterfølgende undersøgelser viser, at Twist 1-ekspression er korreleret med potente invasivitet samt dårlig prognose i epithelcancer. I mavekræft, har en nylig rapport viste overekspression af Twist 1-genet er mere hyppigt i diffust-type karcinom væv med høj N-cadherin genekspression [20]. Der er dog ikke endelige resultater indikerede Twist fremmer udbredelsen af ​​mavekræft. Vores resultater viste Twist sandsynligvis fremmet gastrisk cancer celleproliferation ved anvendelse af BrdU-inkorporering assays. Desuden blev FoxM1 først identificeret som en ny transkriptionel mål Twist 1.

FoxM1 binder promotorområder med en præference for en konsensus [TAAACA] genkendelsessekvens, men med lavere affinitet end andre forkhead proteiner [21]. Dens udtryk er begrænset til prolifererende celler, og udelukket fra hvilende og terminalt differentierede celler. Den styrer ekspressionen af ​​gener, der er nødvendige for både G1 /S og G2 /M overgang og er afgørende for mitotisk ind- og progression, vedligeholdelsen af ​​kromosom stabilitet [22,23]. Amplifikationer af FoxM1 genet er blevet rapporteret i adskillige tumorer, såsom bugspytkirtelcarcinomer, brystcancer og hepatocellulært carcinom [24-27]. I mavekræft, FoxM1 ekspression er også opreguleres og dets inhibering fører til cellulær ældning, som er mindst delvist afhængig af p27 kip1 [28,29]. Ud over sin positive rolle på celleproliferation, er FoxM1 vist sig at spille roller i andre cancer-beslægtede processer, såsom invasion og metastase [30]. Dens ekspressionsniveauer korrelerer med dårlig prognose og metastase i forskellige tumorer, herunder gastrisk carcinoma [31], hvilket antyder muligheden for at anvende FoxM1 som en prognose og /eller diagnose markør. Tilsammen FoxM1 er et lovende og attraktivt mål for cancerterapi. Derfor er det vigtigt at forstå, hvordan FoxM1 reguleres for at designe bedre behandlingsmetoder.

FoxM1 ekspression reguleres stramt både på mRNA og protein niveauer. Dens overflod stiger ved optagelse af S-fasen, toppe i løbet af G2 og M, og nedbrydes under mitotisk exit. Tilsvarende er dens transkriptionsaktivitet tæt reguleret hele cellecyklussen ved multisite phosphorylering af forskellige kinaser, og dets modvirke phosphataser, og nåede sin maksimale aktivitet i G2-fasen af ​​cellens cyklus [32]. For nylig er det blevet rapporteret, at FoxM1 udtryk også kan moduleres af microRNA. FoxM1 er blevet identificeret som et direkte mål for miR-134, hvis niveau omvendt korreleret med den invasive potentiale nogle NSCLC celler [33]. Desuden er FoxM1 også undertrykkes af MIR-370 i gastriske cancerceller [29], hvilket antyder, at yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge om Twist 1 kunne samarbejde disse regulatoriske pathways.

Som konklusion viser vi her, at Twist 1 overekspression fører til en signifikant opregulering af FoxM1, som spiller en central rolle i cellecyklusprogression i gastriske cancerceller. I modsætning hertil knockdown Twist 1 reducerer FoxM1 ekspression, hvilket antyder, at FoxM1 kan være en direkte transkriptionel mål Twist 1. Vi afslører desuden, at Twist 1 kunne binde til promotorregionen af ​​FoxM1, og efterfølgende rekruttere p300 at inducere FoxM1 mRNA-transkription. Derfor er vores resultater afdække en tidligere ukendt Twist 1 /FoxM1 regulatoriske vej, som kan hjælpe til at forstå mekanismerne i mavekræft spredning.

Støtte Information

Figur S1.

(AB) mRNA og protein niveauer af E-cadherin i NCI-N87 (A) og AGS (B) celler transficeret med adenovirus, der udtrykker tom vektor (EV) eller Twist 1. Salg doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001

(TIF)

figur S2.

(A-B) den celleproliferative potentiale (BrdU) blev bestemt i NCI-N87 (A) eller AGS (B) celler uden eller med transfektion af tom vektor (EV) eller GFP siRNA. (C) Endogen Twist 1-ekspression blev bestemt ved western blot i fire gastriske cancerceller (NCI-N87, AGS, HGC-27 og MGC80-3). Væksten kurven for fire cellelinjer blev målt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002

(TIF)

Figur S3.

(A-B) mRNA (A) og protein (B) niveauer af FoxM1 i NCI-N87 celler transficeret med siRNA oligoer mod NCI-N87 eller negativ kontrol (Ctrl). (C) Celleproliferation blev målt ved BrdU-assays i NCI-N87-celler. Celler blev præ-transficeret med siRNA oligoer i 24 timer og derefter transficeret med tom vektor (EV) eller Twist 1 i yderligere 24 timer.

(D) mRNA-niveauer af p21, p27, cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 og cyclin E blev bestemt ved real-time PCR i NCI-N87 celler. Celler blev præ-transficeret med siRNA oligoer i 24 timer, og derefter transficeret med tom vektor (EV) eller Twist 1 i yderligere 24 timer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003

(TIF)