PLoS ONE: Design og Test af Novel Taxaner til at undersøge meget komplekse mekanismer, som Taxaner Bind til mikrotubuli og Årsag Cytotoksicitet for cancerceller

Abstrakte

Vores tidligere arbejde, der er en mellemliggende bindingssted for taxaner i mikrotubuli nanopore. Målet med denne undersøgelse var at teste derivater af paclitaxel udformet til at binde til dette mellemprodukt websted differentielt afhængigt af isotypen af ​​β-tubulin. Da p-tubulin isotyperne har væv-afhængig udtryk-specifikt βIII isotypen er meget rigelige i aggressive tumorer og langt mindre udbredt i normale væv-dette forventes at føre til tubulin målrettede lægemidler, der er mere effektive og har færre bivirkninger. Syv derivater af paclitaxel er designet og fire af disse var medgørlige til syntese i tilstrækkelig renhed og udbytte til yderligere testning i brystkræft model cellelinjer. Ingen af ​​de undersøgte derivater var overlegne i forhold til for tiden anvendte taxaner imidlertid computersimuleringer forudsat indsigt i aktiviteten af ​​derivaterne. Vores resultater tyder på, at hverken binding til den mellemliggende bindingssted eller den endelige bindingssted er tilstrækkelig til at forklare aktiviteterne i de afledte taxaner undersøgt. Disse resultater understreger behovet for at iterativt forbedre udformningen af ​​taxaner baseret på deres aktivitet i modelsystemer. Viden på evnen af ​​de konstruerede lægemidler til at binde til mål og skabe aktivitet på en forudsigelig måde er et skridt i retning af at tilpasse behandlinger

Henvisning:. St. George M, Ayoub AT, Banerjee A, Churchill CDM, Winter P, Klobukowski M, et al. (2015) Design og afprøvning af nye Taxaner til at undersøge meget komplekse mekanismer, som Taxaner Bind til mikrotubuli og Årsag Cytotoksicitet til kræftceller. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10,1371 /journal.pone.0129168

Academic Redaktør: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, TAIWAN

Modtaget: Februar 4, 2015; Accepteret: 5 maj 2015; Udgivet: Juni 8, 2015

Copyright: © 2015 St. George et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansieret af den canadiske Breast Cancer Foundation tilskud til JAT, antal: RES0010014. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de taxaner, herunder paclitaxel og docetaxel, målrette tubulin, at subunit protein af mikrotubuli, og binder til en velkarakteriseret site på β-tubulin [1]. Mekanismerne i binding og handling, men er meget komplekse. I modsætning til andre anti-tubulin lægemidler, de taxaner specifikt retter sig mod den intakte mikrotubuli og deres bindingssted er i mikrotubuli lumen [2]. Tidligere arbejde af Freedman et al. [2] kortlagt nanoporerne langs mikrotubulus overfladen gennem hvilke taxaner skal passere for at nå bindingsstedet. Et specifikt sted i nanopore blev identificeret som en mellemliggende taxan bindingssted. Et andet problem er, at der er flere isotyper af β-tubulin, og at disse afviger både i deres affinitet for taxaner og deres subcellulære roller og placeringer [3]. Paclitaxel at udøve sin største virkning på βII isotypen [4], som også er den vigtigste β-tubulin isotype i neuroner [3], hvilket muligvis forklarer den neuropati associeret med taxaner. The βIII isotypen, som er meget rigelige i aggressive tumorer og meget mindre almindelig i normale væv, synes at være et godt alternativ target [5,6]. Vores mål var at rationelt design og test roman taxanderivater, der ville binde til mellemproduktet bindingssted med differentiel affinitet afhængigt af β-tubulin isotype udtrykkes i celler.

Taxaner er blandt de mest aktive antitumormidler til behandling af forskellige former for kræft, især bryst-, ovarie- og lungekræft [7,8]. Resistens over for taxaner er et problem for vellykket kemoterapi og kan potentielt opstå fra mindst tre forskellige mekanismer. Det første er der den klassiske mekanisme som følge af virkningen af ​​P-glycoprotein (P-gp, kodet af

MDR1

gen), som i det væsentlige pumper narkotika ud af kræftcellerne [9]. Strukturelt forskellige taxaner kunne i princippet have forskellig modtagelighed til virkningen af ​​P-gp. Sekund, β-tubulin, målet for taxaner, eksisterer som talrige isotyper afviger i aminosyresekvens og kodes af forskellige gener [3]. En af de taxaner, paclitaxel, har sine stærkeste virkninger på βII isotype [4]. Da βII er overudtrykt i mange tumorer [10] det er ikke overraskende, men βII er også en vigtig del af nervesystemet [5], hvilket kan forklare den neurotoksicitet af taxaner. Den βIII isotype ville være et bedre mål, da det sker stort set i neuroner, men ved meget lavere niveauer end βII, mens dens udtryk er meget almindeligt i aggressive og metastatisk kræft [6]. Tredje, bindingen af ​​taxaner til mikrotubuli er meget kompleks, og lægemidlet har til at krydse fra det ydre miljø til bindingsstedet i hulrummet (indvendig) af mikrotubulus [11] for at tilvejebringe den katalytiske sekvens af begivenheder, der fører til polymerisation eller depolymerisering. Dette betyder, at taxanet først skal binde til et mellemliggende sted på overfladen af ​​mikrotubulus og derefter foretage sin vej inde. Dette mellemliggende hjemmeside adskiller sig også blandt isotyperne. De her beskrevne medikamenter er designet og testet både

in vitro

i silico

i et forsøg på at løse alle tre af de ovennævnte spørgsmål.

De kemiske strukturer af paclitaxel og docetaxel er vist i figur 1. Den anden generation semi-syntetiske stof docetaxel afviger ved to positioner fra paclitaxel. Erstatningen af ​​acetatesteren ved C-10 positionen med en hydroxylgruppe gør docetaxel mere vandopløselige og biotilgængeligt end paclitaxel [12,13], og som et resultat docetaxel er begunstiget af de to forbindelser til anvendelse i kliniske anvendelser. Mange tredje generation medicin er ved at blive udviklet til at forbedre forældrenes forbindelser, med målene for at forbedre vandopløselighed, tumor permeabilitet, og cellulære fastholdelse, hvilket resulterer i bedre resultater og længere overlevelsestid for patienter [14].

Taxaner specifikt målrette β-tubulin underenhed af α /β-tubulin heterodimer [15,16]. Placeringen af ​​bindingsstedet findes på hulrummet i den hule mikrotubulusstruktur. Eftersom mikrotubuli er sammensat af gentagne globulære proteiner, er mellemrum (nanopores) placeret langs længden af ​​mikrotubulus mellem hosliggende protofilamenter [2]. Det er gennem disse nanopores at taxaner har vist sig at flytte og få adgang til bindingssted på lumen [11,17]. Når bundet til det endelige bindingssted en konformationel ændring finder sted, hvor et motiv af β-tubulin kendt som M-sløjfe stabiliseres, forhindrer adskillelse af mikrotubuli [16]. Taxaner bindes i et 1: 1 forhold med heterodimerer langs længden af ​​mikrotubulus [18]. Selvom taxaner potentielt kan bindes til hver heterodimer i en mikrotubulusstruktur, er kun én taxan molekyle kræves for at stabilisere hundredvis af tubulin-heterodimerer [18,19].

Både α-tubulin og β-tubulin er fundet i flere isotyper udtrykkes af forskellige gener [20]. Der er mindst otte human p-tubulin isotyper, og er blevet observeret ekspressionen af ​​disse isotyper afviger i normale væv og tumorprøver [21]. Klasse er blevet observeret III β-tubulin (βIII) især at blive overudtrykt i mange former for kræft, især resistente kræft [6], mens βI er konstitutivt udtrykt, og βII er stærkt udtrykt i hjernevæv [21]. Baseret på overvejelser om strukturen af ​​mikrotubuli, mellemproduktet bindingssted i nanopore, og variationerne sekvens mellem p-tubulin isotyper, vi hypotese, at taxaner manipuleret til at interagere differentielt med tubulins vil udøve biologiske aktiviteter påvirket af steriske faktorer og /eller affiniteter manipuleret dele til bindingssteder, relativ overflod af tubulin isoformer, barrierer pålagt af lipid dobbeltlag (relativ opløselighed) og gratis energier af forening eller dissociation [2]. De specifikke mål behandles i denne undersøgelse, er:

At undersøge hydrogenbinding mellem C-7 hydroxyl af taxaner med Ser275 i

α

I og

β

II, deres relative interaktioner med den nanopore, og den deraf følgende spredning af taxaner til det bindingssted.

at undersøge hydrogenbinding mellem bevaret Ser278 i tubulin isotyperne (

β

jeg,

β

II og

β

III) med varierende sidekæder manipuleret ved C-10 af taxaner, deres relative interaktioner med nanopore og den deraf diffusion af taxaner til det bindingssted.

den underliggende forudsætning for første mål er baseret på datamodellering, som fandt, at i βIII tubulin, som har alanin i stedet for serin ved position 275, er ikke i stand til at danne en hydrogenbinding med C-7 hydroxyl i paclitaxel, hvilket igen svækker interaktionen af ​​paclitaxel med nanopore, hæmmer diffusion af paclitaxel til den mellemliggende bindingssted, og resulterer i en effektiv tab af paclitaxel aktivitet i mikrotubuli indeholder βIII tubulin [2].

test af det første mål kræver syntesen af ​​paclitaxel derivater med C-7-hydroxyl erstattet af en ikke-polær funktionel gruppe (Tx-a og Tx-B, figur 1) eller fluor (Tx-C, fig 1). Vi forventede at se nedsat fremme af polymerisation ved paclitaxel til mikrotubuli sammensat af βIII isotypen. Når enten Tx-A eller Tx-B testes dog forventer vi, at fremme af polymeriseringen er mindre påvirket af β-tubulin isotype; med andre ord bør virkningerne af Tx-A eller Tx-B være ufølsom (eller i det mindste mindre følsomme) til β-tubulin isotype. Tx-C skal have en mellemliggende aktivitet, på grund af den lavere energi i forbindelse med hydrogenbinding til fluoratom (3 kcal /mol i forhold til 5 kcal /mol). Vi var i stand til at syntetisere forbindelser Tx-A og Tx-C, og disse blev testet med

in vitro Salg polymerisationsbetingelser assays eller med cellelinien modeller for cytotoksisk aktivitet.

Udgangspunktet for den anden målet er, at en afstand på mellem 4 og 9 Å skal kalibreres for at få adgang Ser278, og dermed en sidekæde del kunne bidrage til at afhjælpe denne mangel. Hydrogenbinding mellem paclitaxel og Ser278 forventes at forårsage stabilisering af taxan interaktion ved nanopore, resulterer i hurtigere bevægelse af lægemidlet til bindingsstedet inde i mikrotubulus, forstærkede mikrotubulus-polymerisation, og øget cytotoksicitet. Afprøvningen af ​​det andet mål kræver syntesen af ​​flere ændringer i C-10 placering af paclitaxel. Vi designede taxaner med forskellige kædelængder på C-10 position ved hjælp af enten en guanidinium (forbindelse Tx-E og Tx-G, figur 1) eller et carboxylat (forbindelser Tx-D og Tx-F, figur 1) funktionel gruppe. Disse forbindelser forventes at være mere aktive end paclitaxel. Vi var i stand til at syntetisere forbindelser Tx-D og Tx-F og disse blev testet med

in vitro

polymerisations- assays eller med cellelinje modeller for cytotoksisk aktivitet.

Materialer og metoder

Kemisk syntese

Vi oprindeligt købte forbindelser Tx-A, Tx-C, Tx-D og Tx-F (fra blandt

i silico

designede forbindelser Tx-A gennem Tx-G fig 1) på grund af deres relativt lette syntese i tilstrækkelig udbytte og relativ renhed til at teste de foreslåede mål. Identiteterne af forbindelserne blev vurderet ved kernemagnetisk resonans (NMR) og renhed ved tyndtlagschromatografi (TLC); Forbindelserne Tx-A, Tx-C, Tx-D og Tx-F var 88%, 94%, 94% og 96% rent, henholdsvis med udbytter på 6%, 10%, 3,6% og 3,3%, henholdsvis. Alle forbindelser blev skik syntetiseret gennem kontrakt udbyder Helios Biotech Ltd., Edmonton, Alberta, Canada.

Cell Kultur

Brystkræft cellelinjer SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], og T-47D [24] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ing Swie Goping (University of Alberta, Canada). Disse er repræsentative brystkræft cellelinier afspejler den molekylære heterogenitet observeret i tumorer i et klinisk miljø. Den valgte cellelinjer støtte i generaliserbarhed af resultater og bidrage til at udelukke en direkte påvirkning af genotype-fænotype af en celle linje på bindingen og cytotoksiske potentiale af paclitaxel og dets analoger. Desuden har de udvalgte brystcancercellelinier tidligere blevet rapporteret at udvise varierende grader af paclitaxel resistens [25], og vores interesse var at kopiere disse resultater og at forhøre såfremt den indre modstand hæmmer de struktur-aktivitetsforhold i taxananaloger beskrevet i målsætninger undersøgelse. Brystcancertumorer er karakteriseret med hensyn til deres ekspression af forskellige celleoverfladereceptorer, såsom HER2 (human epidermal vækstfaktor receptor 2), estrogen receptor (ER) og progesteronreceptoren (PR), der er involveret i cellesignalering og cellulær proliferation.

SK-BR-3 cellelinie er HER2

+, eR

– og PR

-.

MDA-MB-231-cellelinje udtrykker ikke eller har meget lav udtryk for receptorerne (HER, eR eller PR) og betegnes triple negativ. Patienter med tredobbelt negativ receptor status gennemgå behandlinger med cytotoksiske behandlingsformer såsom paclitaxel eller docetaxel

T-47D cellelinje ER

+ men HER2

. -. Tumorer, der ER

+ og HER2

– (uanset om PR

+ eller PR

-) kaldes luminale A tumorer

Prognosen er bedst for luminale A. og værst for tredobbelt negativ; HER2

+ tumorer (Her2

+ og ER

-) har en mellemliggende prognose [26]

Et andet sæt af ikke-brystcancercellelinier blev også anvendt til at vurdere den generelle. af resultater med hensyn til paclitaxel og dets analoger, bortset fra at disse cellelinjer er godt karakteriseret for P-glycoprotein (P-gp) udtryk, og er klassificeret som enten narkotika følsomme eller resistente fænotyper. MES-SA (P-gp negative, vildtype) [27] og MES-SA /DX5 (P-gp positive, narkotika resistente) [28] uterin sarkom cellelinjer, og K-562 (P-gp negative, vildtype ) [29] og K-562 /R7 (P-gp positive, narkotika resistente) [30] kronisk myeloid leukæmi cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Charles Dumontet (University of Lyon, Frankrig). Dette panel blev valgt til at bestemme, om ændringerne i taxanet strukturer havde en effekt på substrat specificitet for multiresistens efflukspumpen, P-gp. MES-SA og MES-SA /DX5 er vedhæftende celler, mens K-562 og K-562 /R7 er suspension celler. Det er tidligere blevet rapporteret, at MES-SA /DX5 og K-562 /R7 cellelinier overudtrykker P-gp protein og udviser krydsresistens over for en række kemoterapeutiske forbindelser [28,31].

All celle linjer blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), ved 37 ° C, 5% CO

2 og i et fugtigt miljø. Adhærerende celler blev opretholdt i medier, indtil ~ 90% konfluente. Celler blev trypsinbehandlet i en opløsning af trypsin-EDTA (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) ved en slutkoncentration på 0,25%.

mikrotubulus Polymerisation Assay

bovin hjerne tubulin forberedelse og oprensning af apii og αβIII dimerer (α-tubulin var en blanding af isotyper; kun β-tubulin blev oprenset i βII og βIII henholdsvis) blev udført som tidligere beskrevet [32]. Mikrotubuli polymerisationsbetingelser assays blev udført som tidligere beskrevet [33]. Prøver (200 pi) af isotypically ren bovin hjerne tubulin (1,4 mg /ml) i tubulin buffer (100 mM MES-Na, 1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgC

2, 1 mM GTP, pH 6,4) blev inkuberet i nærvær af narkotika (1-16 uM) ved 37 ° C i 15 minutter i en DU model spektrofotometer (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) og turbiditeten af ​​prøverne blev overvåget ved 350 nm hver 8 s. De rå data blev erhvervet og behandles ved hjælp KINLOTUS software. De rå data blev efterfølgende baseline-korrigeret, og turbiditetsværdier blev afbildet mod tiden.

MTS Assay

Cell levedygtighed i nærværelse af lægemidlet blev bestemt ved anvendelse af CellTiter 96 AQ

ueous Non -Radioactive celleproliferationsassay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA). Celler blev podet i plader med 96 brønde (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA) ved niveauer proportional med deres vækstrate (i området fra 5 til 10 tusind celler per brønd) i et volumen på 100 pi og fik lov til at klæbe til pladen natten over. Den følgende dag blev cellerne behandlet med en rækkevidde på 100 pi 2x medikamentkoncentrationer for en slutkoncentration 1x lægemiddel pr brønd. Hver koncentration lægemiddel blev administreret til seks forskellige brønde, til at vurdere tekniske reproducerbarhed af assayet. Denne behandling blev opretholdt uændret for en 72 timers periode. Efter 72 timers behandling blev 30 pi MTS-reagens til hver brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i et tidsrum på 30 minutter til 4 timer, afhængigt af farveudvikling, en hastighed, der var variabel fra cellelinje til cellelinje. Relativ cellelevedygtighed blev bestemt ved måling af absorbansen af ​​hver brønd ved 490 nm og omdannet til en procent af den samlede rentabilitet sammenlignet med en ubehandlet kontrol. Eksperimentelle resultater er et gennemsnit af mindst n = 3 eksperimenter.

SDS-PAGE

natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) blev udført for western blotting. 10% polyacrylamidgeler (blandt en stamopløsning på 40% 29: 1 acrylamid /bis-opløsning, 0,375 M Tris, 0,1% (vol /vol) SDS, 0,1% (vol /vol) ammoniumpersulfat, 0,1% (vol /vol) TEMED (N, N, N ‘, N’-Tetramethylethylendiamin), vand til volumen) blev anvendt til alle vestlige blot eksperimenter. Polyacrylamid (7,5%) geler blev anvendt til Western blot-analyse af P-gp protein (170 kDa) til den krævede opløsning af proteinbånd i dette størrelsesområde. Total proteinlysater (25 ug) blev fyldt i 10 eller 15 godt polyacrylamidgeler under anvendelse 1x Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Geler blev kørt ved 200 V i ~ 1 time i 1 x Tris /glycin /SDS run buffer (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, USA), inden de fjernes og farves med Coomassie Blue eller overført til nitrocellulose membran til Western blot-analyse. Coomassie-farvede geler blev affarvet under anvendelse af en opløsning af 50% H

2O, 40% methanol, og 10% iseddike. Affarvet geler blev scannet på en CanoScan LiDE 600F (Canon Inc., Tokyo, Japan) og visualiseret ved hjælp af Adobe Photoshop 6.0 software (Adobe Systems, San Jose, CA, USA).

Western blot analyse

Efter gelelektroforese og overførsel af proteiner til nitrocellulosemembraner blev membranerne blokeret med 5% Tris pufret saltvand (TBS), plus mælk og Tween (TBSMT) (154 mM Tris-HCI, 1,37 M NaCl, 0,1% (volumen /volumen ) Tween20, 5% (w /v) mælk) opløsning i 1 time. Proteiner på membraner blev eksponeret natten over til primært antistof-TBSMT opløsning. Den følgende dag blev membraner vasket i Tris-bufret saltvand, plus Tween (TBST) (154 mM Tris-HCI, 1,37 M NaCl, 0,1% (v /v) Tween 20, pH 7,6), i 6 cykler med 5 min vask /inkubation for hver cyklus i TBST at fjerne ubundet antistof. Membraner blev yderligere udsat for sekundært antistof i TBST i 30 minutter. Efter sekundært antistof inkubation blev membranerne vasket i TBST i 12 cykler med 5 min vask /inkubering i hver cyklus i TBST til fjernelse af eventuelt ubundet sekundært antistof. Proteiner blev påvist efter en 5 min udsættelse for enten ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, England) eller Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) og den eksponerede film blev udviklet under anvendelse af en KODAK m35A X-OMAT Processor (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Proteiner detekteres ved hjælp primære muse-anti-humane antistoffer var: βIII (ab14545; Abcam, Cambridge, England), der anvendes i en fortynding på 1 i 1000, P-gp (ab3366; Abcam, Cambridge, England), der anvendes i en fortynding på 1 i 2000 og gede-anti-human actin (SC-1616; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) anvendt ved en fortynding på 1 4000. Sekundære antistoffer blev gede-anti-muse (115-035-003; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) ved en fortynding på 1 10.000 og kanin-anti-ged (305-035-045; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) anvendt ved en fortynding på 1 40.000. De originale film blev scannet, og billederne blev importeret til PowerPoint. Båndene er placeret på det forventede størrelsesområde blev beskåret ud af filmene. Størrelse og kontrast af hver figur blev indstillet således, at alle tal matcher i størrelse og derefter grupperet sammen. Kontrasten af ​​hele gruppen blev justeret, så båndene kan bedre visualiseres og farven var konsistent.

Statistisk analyse

GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) blev anvendt til at skabe figurer og udføre statistiske analyser af resultaterne. Standard t-test blev anvendt til at sammenligne cytotoksicitetsresultaterne for hver af analogerne i forhold til paclitaxel inducerede cytotoksiske profiler; som også for alle cytotoksiske analyseresultater med og uden andre variable (fx verapamil). En måde ANOVA (variansanalyse) blev anvendt til at vise den statistiske signifikans mellem lav, mellem og høj modstand medikament i cellelinier behandlet med paclitaxel og derivater.

Computational Simuleringer

Binding til taxanen bindingssted.

koordinater tubulin-taxan receptor-ligand-kompleks blev opnået fra FBF krystalstruktur 1JFF [34], som repræsenterer paclitaxel co-krystalliseret med tubulin. Koordinaterne for denne krystalstruktur blev anvendt til at opbygge de komplekser af andre taxanderivater. Strukturerne blev bygget ved hjælp af Avogadro 1.0.3 software [35]. Ni-komplekser blev bygget, herunder Tx-A gennem Tx-G samt paclitaxel og docetaxel som kontroller. Receptoren blev fremstillet ved at fjerne alfa-underenheden af ​​1JFF, da den ikke bidrage direkte til binding af taxaner. Den manglende første methioninrest blev tilsat, og C-terminalen blev dækket med en N-methyl-rest. Cofaktoren Guanosindifosfat (BNP) blev også indbefattet i strukturen og dens parametre blev opnået fra Meagher et al. [36] Ionisering tilstande af proteinrester blev tildelt ved hjælp af PROPKA serveren [37-39]. De ligander blev parametreres i overensstemmelse med den generelle AMBER kraftfeltet (gaff) [40] og delvise afgifter blev tildelt med AM1-BCC-metoden [41] ved hjælp af

forgemak

modul af AMBER 12 [42]. Komplekserne blev derefter bygget ved hjælp af

tleap

modul af AMBER 12, hvor proteinet blev parameteriseret hjælp af AMBERff12SB kraftfelt [43,44]. Komplekset blev solvatiseret i en trunkeret oktaedrisk kasse strækker 12 Å i hver retning. Komplekset blev derefter neutraliseret ved tilsætning af 16 natriumioner. Yderligere 22 natrium- og chloridioner blev tilsat for at opnå en saltkoncentration på 100 mM. Hver kompleks blev derefter minimeret med tunge begrænsninger (500 kcal /(mol Å)) på protein og uden SHAKE på brintatomer for 1000 stejleste nedkørsel kører efterfulgt af 1000 konjugeret gradient kørsler. Anden minimering med 3000 stejleste afstamning kørsler efterfulgt af 3000-konjugat gradient kørsler blev udført uden nogen begrænsninger. Opvarmning til en temperatur på 300 K under konstant volumen med rystes og begrænsninger på proteinet blev udført under anvendelse af en Langevin termostat for 20 ps. Density ligevægt ved konstant tryk for 200 ps blev derefter udført ved hjælp SHAKE på brintatomer og under gradvist faldende begrænsninger på tunge atomer. Dette blev efterfulgt af en produktionsfase af 10 ns ved 300 K under konstant pres hvor koordinater blev registreret hver 2 ps. Alle simuleringer blev udført under periodiske randbetingelser ved hjælp af partikel mesh Ewald fremgangsmåde til behandling af langtrækkende elektrostatik. Density, temperatur, total energi og RMSD blev kontrolleret for ligevægt. De sidste 2 ns af produktionen kører var efterbehandlet for gratis beregning bindingsenergi ved hjælp af Molecular Mechanics /Poisson-Boltzmann Surface Area (MM /PBSA) [45] eller Molecular Mechanics /Generaliseret Born overfladeareal (MM /GBSA) tilgange [46]. Vi udvindes 200 jævnt fordelte snapshots fra de sidste 2 ns af produktionen køre og brugte dem til MM /PBSA og MM /GBSA beregninger. Vi udførte også normal tilstand analyse for hver komplekse bruger 100 jævnt fordelte snapshots, der blev udvundet fra de sidste 2 ns af produktionsforløb. Da normal tilstand analyse er meget tidskrævende, brugte vi en tilgang, hvor proteinet er afkortet. Konkret alle rester længere end 12 Å fra liganden var afkortede, og analysen blev udført kun på det øvrige system. Denne fremgangsmåde har vist sig effektiv og tilstrækkelig nøjagtig ved Genheden et al [46]

I vores tilgang, den frie bindingsenergi beregnes efter formlen:. (1) hvor er den gennemsnitlige molekylære mekaniske energi herunder bidrag fra obligation, vinkel, to-plans, van der Waals og elektrostatiske vilkår. er solvatisering fri energi beregnes ved at løse Poisson-Boltzmann (eller Generalized Born) ligning for at opnå den polære solvatisering fri energi og ved at estimere ikke-polær solvatisering fri energi ved hjælp af et overfladeareal sigt. –

TS

MM

er entropien sigt skønnes ved hjælp normal tilstand analyse. Når den gennemsnitlige frie energi beregnes for liganden, receptoren, og komplekse, er bindingsenergien opnået ved følgende ligning:. (2)

Binding til mellemprodukt nanopore site

A mikrotubulus nanopore model blev konstrueret ved at kombinere elektron mikroskopi data for en mikrotubuli (1XRP) [47] med X-ray data for en αβ-tubulin heterodimer (1JFF) [34]. Begyndende fra protein- og nukleotid komponenter i 1JFF krystal, mangler rester (specielt a: 1,35-60 og p: 1), blev taget fra 1TUB [1] og overlejret på 1JFF. Dernæst blev protonering tilstand af ioniserbare rester i 1JFF bestemmes ved hjælp PROPKA og brintatomer tilsat for at opnå en komplet αβ-tubulin heterodimer. Endelig blev denne dimer anvendt til konstruktion af en del af en mikrotubulus hjælp elektronmikroskopi data fra 1XRP. Den anvendte model var til type 1 pore [2], og kun de fire tubulin monomerer støder op til pore blev bibeholdt.

Den bindende tilstand af paclitaxel til mellemproduktet bindingssted blev taget fra Freedman et al. [2] og overlejret på nanopore ovenfor beskrevne struktur, hvilket resulterer i nanopore-paclitaxel model anvendt i denne undersøgelse (figur 2) som et udgangsmateriale struktur til at definere den mellemliggende bindingssted i docking beregningerne. Bemærk at interdimer kontakter ikke er blevet ækvilibreret i denne model. Bindingen tilstand af paclitaxel i det mellemliggende bindingssted rapporteret af Freedman et al. afviger fra den rapporteret af Maccari et al. [48], som er placeret tættere til a

3-tubulin. Det er sandsynligt, at begge steder er stabile stater langs den samme internalisering pathway.

nanopore ses fra mikrotubulus ydre. Den blå cirkel angiver den mellemliggende bindingssted

Docking beregninger blev udført med Molecular Operating Environment (MOE Chemical Computing Group, Montreal, Canada).. MOE blev udvalgt til docking på grund af sin induceret-fit docking protokol og mulighed for nemt at modellere ligander med forskellige gebyrer og ionisering stater. De fire heterodimerer komponere type 1 pore blev anvendt til at definere receptoren, og fem taxaner (paclitaxel, Tx-A, Tx-C, Tx-D og Tx-F) blev forankret til stedet identificeret af Freedman et al. [2]. På grund af den lave pKa af carboxylsyregrupperne funktionelle grupper i Tx-D og Tx-F, blev disse to taxaner modelleret som anioniske (deprotoneret) til bedst repræsenterer deres struktur ved en fysiologisk pH. Scoring blev oprindeligt beregnet med London dG scoring funktion, bevarer 30 konformere (med dubletter fjernet). Efterfølgende forfining blev udført ved anvendelse af Forcefield fremgangsmåde og yderligere rescoring hjælp af GBVI /WSA dG scoring funktion. Fire forskellige docking protokoller blev anvendt med varierende størrelser af bindingssted og med enten en fleksibel eller en stiv receptor.

Resultater og Diskussion

tubulinpolymerisering Brug Paclitaxel og syntetiseret Derivater

tubulinpolymerisation assays blev udført under anvendelse af paclitaxelderivater at måle

in vitro

polymerisation aktivitet sammenlignet med paclitaxel. Disse eksperimenter anvendte affinitetsoprensede βII og βIII tubulin isotyper fra en bovin hjerne kilde; den α-tubulin var en blanding af isotyper; disse former for tubulin benævnes apii og αβIII henholdsvis.

Polymerisationsmekanismer kurver blev etableret ved hjælp af paclitaxel og fire af dets derivater med enten apii og αβIII. Polymerisationstiderne kurver på lægemiddelkoncentrationer på 10 uM er vist i fig 3A lægemiddelkoncentration på 10 uM var den koncentration, hvor forskellene mellem virkningerne af alle lægemidler var mest tydeligt synlige; dog blev observeret de samme tendenser på alle koncentrationsniveauer testet (1-16 uM).

Isotypically ren bovin hjerne tubulin (apii eller αβIII) på 1,4 mg /ml blev inkuberet i tilstedeværelse af narkotika og absorbansen ved 350 nm blev målt hvert 8. sekund i mindst 11 minutter. Koncentrationen af ​​hvert lægemiddel var 10 uM. PTX er paclitaxel.

Resultaterne viser, at paclitaxel svarer til den højeste mikrotubuli forsamling. Dette efterfølges af Tx-A, derefter ved Tx-C. Tx-D og Tx-F havde lignende værdier, med de langsomste satser af mikrotubulus-samling. Ingen af ​​de testede derivater overgået paclitaxel, hvad angår hastigheden af ​​tubulin-polymerisation. Der var en stigning i konstruktionen sats for paclitaxel med efterfulgt af Tx-A, derefter ved Tx-C. Tx-D og Tx-F havde lignende værdier, med de langsomste satser mikrotubulussamling

Resultatet ikke var i overensstemmelse med tidligere forudsigelser [2] og den underliggende forudsætning beskrevet for første mål:. Paclitaxel blev ikke observeret at være faldet polymerisation med βIII tubulin (observation var det modsatte af forventningen), og desuden Tx-A og Tx-C havde ikke den forventede adfærd. Hverken blev resultaterne i overensstemmelse med den underliggende forudsætning er beskrevet for det andet mål: Tx-D og Tx-F var ikke mere aktive end paclitaxel. Derfor er dette eksperiment ikke understøtter vigtigheden af ​​rester 275 eller 278, eller den forventede rolle mellemliggende bindingssted i mikrotubuli nanopore.

cytotoksicitet Paclitaxel analoger Against Breast Cancer Cell Lines.