Abstrakt
Baggrund
Aberrant blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF ) signalering har været forbundet med prostatakræft (PCA) progression. Men dens rolle i reguleringen af PCa cellevækst og overlevelse er ikke blevet godt karakteriseret.
Metodologi /vigtigste resultater
Brug forsøgsmodeller, der nøje efterligner klinisk patofysiologi PCa progression, vi viste, at PDGF er en overlevelsesfaktor i PCA celler gennem opregulering af myeloid celleleukæmi-1 (MCL-1). PDGF behandling inducerede hurtig nuklear translokation af β-catenin, formodentlig medieret af c-Abl og p68 signalering. Interessant PDGF fremmet dannelsen af et nukleart transkriptionel kompleks bestående af β-catenin og hypoxi-inducerbar faktor (HIF) -1α, og dens binding til Mcl-1-promotoren. Sletning af en formodet hypoxi respons element (HRE) inden MCL-1 promotor svækket PDGF effekter på Mcl-1-ekspression. Blokade af PDGF receptor (PDGFR) signalering med en farmakologisk inhibitor AG-17 ophævet PDGF induktion af Mcl-1, og induceret apoptose i metastatiske PCA celler.
Konklusioner /Betydning
Vores undersøgelse belyst en afgørende overlevelse mekanisme i PCA celler, hvilket indikerer, at afbrydelsen af PDGF-Mcl-1 overlevelse signal kan tilvejebringe en ny strategi til behandling af PCa metastase
Henvisning:. Iqbal S, Zhang S, Driss a, Liu ZR, Kim H-RC, Wang Y, et al. (2012) PDGF opregulerer Mcl-1 ved aktivering af β-Catenin og HIF-1α-afhængig signalering i human prostatacancer Cells. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10,1371 /journal.pone.0030764
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
Modtaget: Juni 21, 2011; Accepteret: December 20, 2011; Udgivet: januar 20, 2012 |
Copyright: © 2012 Iqbal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Department of Defense PC060566, American Cancer Society RSG-10-140-01, Emory University Research Committee Award, Kennedy Seed Grant (DW), National Cancer Institute tilskud 1R43CA141870 (AW), National Cancer Institute giver P01 CA98912, R01 CA122602 , Department of Defense PC060866 (LWKC), Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Grant (OK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion Salg
blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF) familie består af fem dimere isoformer: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC og -DD [1], som udøver deres cellulære virkninger gennem to strukturelt ligner tyrosinkinasereceptorer (PDGFR-a- og -p) udtrykkes af mange forskellige celletyper [2]. Ligandbinding til PDGFRs resulterer i dimerisering og autophosphorylering af receptorkinaser, efterfølgende rekruttere visse Src homologi 2 (SH2) domain-holdige adapter proteiner (f.eks, Src, Grb2 og Shc) til specifikke phosphorylerede tyrosinrester. Adskillige signaleringskaskader, herunder Ras-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), phospholipase-γ og Phos-phatidyl-inositol-3′-kinase (PI3K) /Akt, er blevet kendetegnet som de store nedstrøms veje medierer PDGF-funktioner [3] . Andre adapter molekyler (f.eks den Fer og Fes tyrosinkinase familie) og transkriptionelle faktorer (f.eks β-catenin) er også involveret i PDGF signalering i visse typer celle [4], [5], [6], [7], [8].
Aberrant PDGF-ekspression er ofte blevet forbundet med den neoplastiske bestanddel af humane tumorer, hvorimod PDGFRs hovedsagelig findes i fibroblastiske og vaskulær tumor stroma [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Disse observationer antydede, at tumor-afledt PDGF primært kan virke som en parakrin signalmolekyle i faste tumorer. Støtte dette koncept, de seneste undersøgelser har vist, at PDGF er en potent pro-angiogenetisk faktor ved at fremme rekruttering og vækst af stromale fibroblaster, perivaskulære celler og endotelceller, derved indirekte påvirker tumorvækst, metastatisk spredning og resistens [2], [3 ], [14], [15], [16]. Interessant ny dokumentation indikerede, at PDGF autokrin signalering også kan spille en vigtig rolle under tumorprogression. Mutations aktivering eller co-ekspression af PDGF ligander og receptorer er i stand til at stimulere tumorcellevækst og spredning i flere nonepithelial maligniteter, herunder glioblastomer og osteosarkom [17]. For nylig er autokrin PDGF signalering blevet forbundet med epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i carcinomceller fra bryst, colon, prostata og leveren, hvilket antyder en forårsagende rolle af autokrin PDGF signalering i metastase [7], [8], [18], [19]. Ikke desto mindre på trods af den veletablerede sammenhæng mellem dereguleret parakrin PDGF signalering og tumor progression, de funktioner og mekanismer autokrine PDGF signalering i epitelial kræftceller tilbage, undvigende [3], [17].
Køb af apoptose modstand er karakteristisk for metastatiske tumorceller, der kan give overlevelse fordele under invasion, metastase og kolonisering [20]. Vi har for nylig korreleret overekspression af myeloid celleleukæmi-1 (MCL-1), et medlem af Bcl-2-familien, med progressionen af prostatacancer (PSA) mod knoglemetastaser [21]. I denne undersøgelse, giver vi bevis for, at PDGF-BB er en overlevelsesfaktor i metastatiske PCA celler ved opregulering Mcl-1-ekspression gennem en signaleringsmekanisme medieret af transkriptionelle faktorer p-catenin og hypoxi-inducerbar faktor (HIF) -1α.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Menneskelig PCA cellelinjer ARCaP
E, ARCaP
M [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), c4-2 [23] og PC3 (ATCC) blev rutinemæssigt opretholdt i T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 5% føtalt bovint serum (FBS). For behandlinger med PDGF-isoformer, PCA-celler podet i 96-brønds plader (3.000 celler /brønd) blev serum-udsultet natten over, erstattet med frisk serumfrit T-medium og inkuberet i nærværelse af varierende koncentrationer af rekombinant human PDGF AA, -AB, -BB (R Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev tilsat til cellerne og inkuberet i 72 timer. Celleproliferation blev målt ved anvendelse af CellTiter 96 AQ proliferation assay ifølge producentens anvisninger (Promega, Madison, WI). Levedygtige celler blev talt i tre eksemplarer anvendelse af et hæmacytometer og trypanblåt-farvning.
Plasmider og små interfererende RNA’er (siRNA’er)
Den humane Mcl-1-promotorområdet fuld længde klonet ind i et ildflueluciferase reporter vektor pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Steven W. Edwards (University of Liverpool, Liverpool, UK) [24]. Hypoxi-responsive element (HRE) (fragment -900 til -884) -truncated konstrukt blev opnået ved fordøjelse af fuldlængde-promotoren under anvendelse af Kpnl (fra position -3914 til -855) og derefter ligeret under anvendelse af T4-DNA-ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA). Begge plasmidkonstruktioner blev bekræftet ved sekvensanalyse. Den pHIF1-luc reporter blev indkøbt fra Panomics (Fremont, CA). TOPFlash og FOPFlash T-celle faktor (TCF) reportere blev opnået fra Upstate (Billerica, MA). pTK-RL plasmid blev indkøbt fra Promega. Humant Mcl-1 ekspressionsvektor (pCMV-Mcl-1) blev opnået fra Origene blev Inc. humant β-catenin ekspressionsplasmidet tilvejebragt af Dr. Zhi-Ren Liu. On target
plus
SMARTpool siRNA’er mod β-catenin, p68, PDGFR-a og PDGFR-p, og kontrol siRNA blev opnået fra Dharmacon, Inc. (Chicago, IL). HIF-1a og kontrol siRNA blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Transient transfektion af DNA-konstruktioner og siRNA’er blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 eller Oligofectamine reagenser (Invitrogen) ifølge producentens protokoller og vores offentliggjorte procedurer [21], [25].
Western blot-analyse
Totale cellelysater blev fremstillet ved anvendelse radioimmunudfældning (RIPA) buffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Kerneproteiner blev ekstraheret ved anvendelse af en Novagen kit (EMD Biosciences, San Diego, CA). Immunoblotting analyse fulgt standardprocedurer [25]. ImageJ software (National Institutes of Health) blev anvendt til at kvantificere den relative protein-ekspression som normaliseret til lastning kontrol. Information til antistofferne anvendt i denne undersøgelse blev beskrevet i Supplemental tabel S1.
Immunopræcipitation
Immunopræcipitation Starter Pack (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Total nukleare lysater (1 mg) blev immunfældet med 5 ug kanin-anti-HIF-1α antistof, muse-anti-β-catenin antistof, mus-anti-c-Abl og kanin-anti-p68-antistof (supplerende oplysninger, tabel S1), eller normal IgG (R midterste panel: QRT-PCR-analyse af Mcl-1 mRNA-ekspression i respons på PDGF-BB behandlingen i ARCaP
M-celler (24 timer); højre panel: Virkningerne af PDGF-BB behandling (20 ng /ml, 72 h) på Mcl-1 protein-ekspression i ARCaP
M-celler. ImageJ blev anvendt til at kvantificere den relative ekspression af Mcl-1-protein. (D) Virkningerne af eksogent PDGF-BB på cytotoksicitet af docetaxel i ARCaP
M-celler, som bestemmes af MTS-analysen.
PDGF-BB inducerer Mcl-1-ekspression og antagoniserer apoptose i PCa celler
Interessant, blev PDGF-BB fundet væsentligt inducere Mcl-1-ekspression i PCA-celler (figur 1C, Supplemental Figur S1). Behandling med rekombinant human PDGF-BB forøgede Mcl-1-mRNA på en dosis- og tidsafhængig måde, selvom de optimale betingelser for den maksimale akkumulering af Mcl-1-mRNA varierede i forskellige PCA cellelinier. Western blot-analyse bekræftede de induktive virkninger af PDGF-BB på Mcl-1-ekspression på proteinniveauet. Disse data identificeres PDGF-BB som en ny regulator af Mcl-1-ekspression, som kan give en overlevelse mekanisme til at beskytte PCA celler fra apoptose. Faktisk tilsætning af PDGF-BB i PCA cellekulturer effektivt antagoniserede cytotoksicitet af docetaxel over et bredt område af doser (figur 1D).
ekspressionsprofil af PDGF autokrin signalering komponenter i PCA-celler
vi undersøgte ekspressionsmønsteret for PDGF’er og deres receptorer i PCA-celler (figur 2A). RT-PCR-analyser viste, at PDGF-isoformer differentielt udtrykt på mRNA-niveauet, og blandt dem, forøget PDGF-B og PDGF-D blev observeret i c4-2 og ARCaP
M-celler sammenlignet med den parentale LNCaP og ARCaP
E-celler, hhv. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [19], blev PC3-celler sig at udtrykke høje niveauer af PDGF-D, PDGFR-α og -β. Interessant, PDGFR-a mRNA’er tilsyneladende er betydeligt udtrykt i PCA-celler, hvilket er bekræftet ved proteinniveauet ved Western blot analyse. I modsætning, selvom PDGFR-p mRNA’er blev detekteret ved RT-PCR i de fleste PCA cellelinier, immunoblotting analyse kunne kun bekræfte proteinekspression i ARCaP
E og ARCaP
M-celler (figur 2A, højre panel). Taget sammen foreslår disse data en funktionel PDGF autokrin signalering i visse PCA-celler.
(A) Ekspression profil PDGFR signalering komponenter i PCA-celler, som analyseret ved RT-PCR og Western blotting. (B) Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på phosphorylering af PDGFR-α og -β i ARCaP
M-celler. (C) Virkningerne af nedbrydende PDGFR-α eller /og -P på Mcl-1 protein-ekspression i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med enten isotypespecifikke siRNA’er rettet mod PDGFR-α (venstre panel, 30 nM) eller PDGFR- β (centralt panel, 100 nM), eller en blanding af PDGFR-α og -p siRNA’er (højre panel) i 48 h, serum-udsultet natten over, og inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 72 timer. (D) Overpanel: De tidsafhængige virkninger af AG-17 (100 nm) på Mcl-1 mRNA-ekspression i ARCaP
M-celler; Bundplade: Virkningerne af AG-17 behandling på ekspressionen af Mcl-1 og spaltes PARP i nærvær (20 ng /ml) eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i ARCaP
M-celler. (E) Virkningerne af AG-17 behandling (100 nm, 72 h) på levedygtighed ARCaP
E og ARCaP
M-celler.
en autokrin PDGFR signalering medierer PDGF BB regulering af Mcl-1 i PCA-celler
Både PDGFR-α og -β var stærkt udtrykt i knogler metastatisk ARCaP
M-celler, og hurtigt phosphoryleret i en tidsafhængig måde som reaktion på stimulering af exogen PDGF-BB (figur 2B). Interessant, udtømning af enten PDGFR-α eller -β af isoform-specifikke siRNA blokerede ikke den induktive virkning af PDGF-BB på Mcl-1 ekspression (figur 2C, venstre og centrale paneler), hvilket antyder, at aktivering af enten receptorer kan være tilstrækkelig for opregulering af Mcl-1. Støtte denne hypotese, transient transfektion med en blanding af siRNA’er rettet mod både PDGFR-α og -β inhiberede den basale ekspression af Mcl-1, og ophævet PDGF-BB induktion af Mcl-1 ARCaP
M-celler (figur 2C, højre panel ). Alternativt giver behandling med AG-17 (Tyrphostin), en selektiv farmakologisk inhibitor af PDGFRs [28], reduceret Mcl-1-ekspression på både mRNA og protein niveauer og påfaldende øget spaltning af poly-ADP ribose polymerase (PARP), en indikator for apoptose . Disse virkninger blev svækket ved nærvær af PDGF-BB i kulturer (figur 2D). Konsekvent, AG-17 behandling ved lave doser (såsom 100 nM) effektivt induceret apoptose i ARCaP
E og ARCaP
M-celler (figur 2E), hvilket indikerer en central rolle PDGFR signalering i overlevelsen af PCA-celler.
β-catenin medierer PDGF regulering af Mcl-1-ekspression i PCA-celler
Aktivering af β-catenin pathway er en nedstrøms begivenhed af PDGF signalering i visse epitelcancerceller [7], [ ,,,0],8], [29]. Western blot analyse konstateret, at β-catenin og TCF4, en større β-catenin-interagerende transkriptionsfaktor [30], blev differentielt udtrykt i PCa celler (figur 3A), hvilket antyder en funktionel β-catenin-TCF4 signalering i disse celler. Faktisk var en kunstig TCF promotor aktiveres i både LNCaP-c4-2 og ARCaP
E-ARCaP
M cellelinier, og reporter aktiviteter syntes at være forbundet med øget
in vivo
metastatisk potentiale i c4-2 og ARCaP
M-celler (figur 3B). Det er værd at bemærke, at både β-catenin og TCF4 væsentligt blev præsenteret i kernen af ARCaP
E og ARCaP
M-celler (figur 3A, lav panel), som udviste markant højere basale TCF aktiviteter end både LNCaP eller C4 -2 celler (ved -100-fold) (Figur 3b).
(A) Ekspression profil af β-catenin-TCF signalering komponenter i PCA-celler. (B) TCF reporter aktivitet i LNCaP-c4-2 og ARCaP
E-ARCaP
M-celler. (C) Overpanel: Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på den nukleare translokation af β-catenin i ARCaP
M-celler; Bundplade: Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) hos TCF reporter aktivitet i nærvær (100 nM) eller fravær af AG-17. (D) Virkningerne af ektopisk ekspression af β-catenin (72 h) på Mcl-1-ekspression på både mRNA og protein niveauer. (E) Virkningerne af β-catenin udtømning på PDGF-BB regulering af Mcl-1-ekspression i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med β-catenin siRNA eller kontrol siRNA (30 nM) i 48 timer, serum-udsultet natten over, og inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 72 timer. (F) Virkningerne af β-catenin udtømning på Mcl-1 reporter aktivitet i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med β-catenin eller kontrol siRNA (30 nM) i 48 timer, og yderligere transficeret med en human Mcl-1 reporter i 24 timer. Efter serumudsultning natten over, blev cellerne inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer.
Ved PDGF-BB behandlingen, den nukleare tilstedeværelse af β-catenin blev hurtigt steg i ARCaP
M-celler (figur 3C, øverste panel). Konsekvent blev TCF reporter aktivitet også signifikant øget efter PDGF-BB-stimulering, som blev dæmpes ved forbehandling med AG-17 (figur 3C, bundpanel). Disse data viste, at PDGF-BB aktiverede β-catenin signalering i en PDGFR-afhængig måde.
For at undersøge betydningen af β-catenin i reguleringen af Mcl-1-ekspression, ARCaP
M-celler var forbigående transficeret med en konstruktion, der udtrykker vildtype-β-catenin. RT-PCR og Western blot analyserne viste, at ektopisk epression af β-catenin increseased Mcl-1 på både mRNA og protein niveauer (figur 3D). I modsætning, β-catenin depletering ved anvendelse af et siRNA pool effektivt hæmmede både den basale ekspression af Mcl-1 og dets induktion ved PDGF-BB (figur 3E). Konsekvent, hvorimod PDGF-BB signifikant inducerede luciferaseaktiviteten af et fuldlængde humant Mcl-1 promotoren i ARCaP
M-celler transficeret med ikke-målretning kontrol siRNA’er, denne effekt blev ophævet ved forbigående udtynding af endogen β-catenin (fig 3F). Disse resultater antydede, at aktivering af β-catenin signalering kan være tilstrækkelig og nødvendig for Mcl-1-ekspression i PCA celler.
PDGF aktiverer p68-β-catenin signalering i PCa celler
Vi undersøgte, om en c-Abl-p68-afhængige vej er involveret i PDGF aktivering af β-catenin signalering i PCA-celler [7]. Western blot-analyser vist sig, at c-Abl og p68 differentielt blev udtrykt i PCa celler (figur 4A). Ved PDGF-BB behandlingen, tyrosinphosphorylering af c-Abl og p68 blev hurtigt aktiveret, som vist ved immunopræcipitering-immunoblotting assays (figur 4B, venstre og midterste paneler). Vigtigt er det, blev tilstedeværelsen af β-catenin i p68 immunopræcipitater også steget i en tidsafhængig måde, hvilket antyder en forøget fysisk association mellem β-catenin og p68-proteiner (figur 4b, midterste panel), der blev yderligere bekræftet ved en gensidig immunopræcipitering eksperiment (figur 4B, højre panel). Faktisk PDGF-BB-induceret hurtig nuklear translokation af p68 inden for 30 min (figur 4C), der var forbundet med øget co-lokalisering af p68 og β-catenin i kernen (figur 4D). Disse data viste, at PDGF-BB kunne aktivere c-Abl-p68 kaskade og efterfølgende β-catenin signalering i PCA celler.
(A) Ekspression af c-Abl og p68 i PCA celler. (B) Venstre panel: Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på phosphorylering af c-Abl; midterste panel: Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på phosphoryleringen af p68 og ekspressionen af β-catenin i de p68 immunopræcipitater i ARCaP
M-celler. Phosphorylering af p68 på tyrosin sites blev detekteret under anvendelse af en pan-phosphoryleret-Tyr-antistof; højre panel: Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på ekspressionen af p68 i β-catenin immunpræcipitater i ARCaP
M-celler. (C) Virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på den nukleare translokation af p68 i ARCaP
M-celler. (D) Konfokal mikroskopi analyse af virkningerne af PDGF-BB på co-lokalisering af β-catenin og p68 i kernen i et tidsforløb eksperiment i ARCaP
M-celler. (E) Virkningerne af p68 udtynding på PDGF regulering af Mcl-1 i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med p68 eller kontrol siRNA (30 nM) i 48 timer, serum-udsultet natten over, og inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer (øverste panel) eller 72 timer ( bundpanel). Øvre panel: RT-PCR-analyse af mRNA-ekspression af p68 og Mcl-1; Bundplade: Western blot analyse af protein ekspression af p68, β-catenin og Mcl-1. (F) Virkningerne af p68 udtømning på Mcl-1 reporter aktivitet i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med p68 eller kontrol siRNA (30 nM) i 48 timer, og yderligere transficeret med humant Mcl-1 reporter i 24 timer. Efter serumudsultning natten over, blev cellerne inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer.
For at undersøge om p68 kræves til regulering af Mcl-1 udtryk, ARCaP
M-celler blev transficeret med p68 siRNA eller kontrol siRNA, og analyseret for ekspression af Mcl-1 ved mRNA og protein niveauer. Som vist i figur 4E, udtømning af p68 inhiberede endogen β-catenin og effektivt svækkede PDGF-BB induktion af Mcl-1-ekspression. Konsekvent blev Mcl-1-promotor-aktivitet signifikant inhiberet af behandling med p68 siRNA i ARCaP
M-celler, enten med eller uden tilstedeværelse af PDGF-BB i kulturerne (Figur 4F). Disse data viste en uundværlig funktion af p68 i reguleringen af Mcl-1 i PCA celler.
PDGF-BB fremmer protein interaktion mellem β-catenin og HIF-1α i PCa celler
Vores tidligere studier viste en vigtig rolle HIF-1α i knogle metastatisk PCA-celler [25]. Interessant, transfektion af en HIF-1α-specifikke siRNA signifikant reduceret Mcl-1-protein-ekspression i ARCaP
M-celler (figur 5A), hvilket antyder kan kræves, at HIF-1α til Mcl-1 regulering i PCA-celler. For at undersøge om PDGF-BB kunne inducere fysisk interaktion mellem HIF-1α og β-catenin, blev kerneproteiner fremstillet fra ARCaP
M-celler behandlet med PDGF-BB i varierende tider. Western blot analyse konstateret, at både HIF-1α og β-catenin hurtigt blev forøget i kernen (figur 5B). En co-immunopræcipitering assay viste, at som reaktion på PDGF-BB-stimulering, nuklear tilstedeværelse af β-catenin steg hurtigt i HIF-1a immunpræcipitater (figur 5C, øverste panel). Gensidigt co-immunpræcipitering med et anti-β-catenin antistof bekræftet en øget sammenslutning af nuklear HIF-1α med β-catenin efter PDGF-BB behandlingen (figur 5C, bundpanel). Den forbedrede co-lokalisering af β-catenin og HIF-1α proteiner blev yderligere demonstreret ved konfokal mikroskopi, der udkom med at nå den maksimale intensitet på 30 min på PDGF-BB-stimulering (figur 5D). Disse resultater viste, at i repsonse til PDGF-BB-stimulering, β-catenin fysisk interagerer med HIF-1α i kernen, hvilket kan føre til aktivering af Mcl-1 transskription i PCA-celler.
(A) virkninger af HIF-1α depletion på Mcl-1-ekspression i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transficeret med HIF-1α eller kontrol siRNA (30 nM) i 72 timer, og analyseret for Mcl-1 ekspression ved immunblotting. (B) Western blot-analyse af virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på den nukleare translokation af β-catenin og HIF-1α i ARCaP
M-celler. (C) Co-immunopræcipitationsanalyser af virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på samspillet mellem β-catenin og HIF-1α i kernen i ARCaP
M-celler. (D) Konfokal mikroskopi af virkningerne af PDGF-BB (20 ng /ml) på co-lokaliseringen af β-catenin og HIF-1α i kernen i ARCaP
M-celler.
En formodet HRE motiv er nødvendig for PDGF-BB aktivering af Mcl-1 promotor
HIF-1α bindes til HRE
cis
-elementer inden fortalerne for hypoxi-responsive gener og regulerer deres udtryk [31]. Vi undersøgte, om PDGF-BB-inducerede nuklear akkumulering af HIF-1α var forbundet med aktiveringen af HRE-afhængig transskription. I ARCaP
M-celler, PDGF-BB behandlingen signifikant forøget luciferaseekspression drevet af en kunstig HRE-promotor (pHIF-luc) (figur 6A). Interessant nok blev en formodet HRE motiv identificeret i humant Mcl-1 promoter region, som ligger mellem -900 og -884 nukleotider ved 5′-opstrøms for transkriptionsstartstedet [24]. For at undersøge den potentielle rolle af dette
cis
-element i PDGF regulering af Mcl-1 transkription, vi karakteriseret en deletionsmutant af det formodede HRE motiv anvendelse af human Mcl-1 promoter region som template (figur 6B). Den resulterende reporterkonstruktion (p-Mcl-1-Luc: ΔHRE) eller luciferase reporter drevet af fuld længde Mcl-1 promotoren (p-Mcl-1-Luc), blev forbigående udtrykt i ARCaP
M-celler henholdsvis og behandlet med PDGF-BB eller PBS. IL-6, som er blevet vist at aktivere Mcl-1 transkription i PCA og cholangiocarcinom celler gennem et signal transducer og aktivator af transkription 3 (Stat3) -afhængig mekanisme [32], [33], blev inkluderet som den positive kontrol. Luciferaseaktivitet assay viste, at PDGF-BB-induceret aktivering af p-Mcl-1-Luc-promotoren i højere grad end IL-6 i ARCaP
M-celler. Betydeligt, sletning af HRE-motivet ikke kun reduceret den basale aktivitet af Mcl-1-promotoren, men også ophævet de induktive virkninger af PDGF-BB på reporter-aktivitet. I modsætning, p-Mcl-1-Luc: ΔHRE, indeholdende en Stat3-bindende sekvens i position mellem -92 og -83 [32], forblev aktiveret ved IL-6 behandling (figur 6C). En tilsvarende virkning af HRE deletion på differentiel respons af Mcl-1 promotor til PDGF-BB og IL-6 blev også observeret i c4-2 celler (Supplemental Figur S2). Disse data viste, at den formodede HRE
cis
-element er nødvendig for PDGF-BB aktivering af Mcl-1-ekspression i PCA celler.
(A) Virkningerne af PDGF-BB på HIF -1 reporter aktivitet i ARCaP
M-celler. Cellerne blev transient transficeret med HIF-1 reporter eller pGL3 i 24 timer, serum-udsultet og inkuberet i nærvær eller fravær af PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer. (B) Skematisk diagram af human Mcl-1 promotoren og dets deletionsmutation på det formodede HRE webstedet. (C) Virkningerne af at slette den formodede HRE site på PDGF regulering af Mcl-1 promotor-aktivitet i ARCaP
M-celler. IL-6 (200 ng /ml) blev inkluderet som den positive kontrol. (D) på chip-Re-ChIP assay af virkningerne af PDGF-BB behandlingen (20 ng /ml) på bindingen af β-catenin og HIF-1α til humant Mcl-1-promotorområdet i ARCaP
M-celler.
PDGF-BB fremmer bindingen af både β-catenin og HIF-1α til Mcl-1-promotorområdet
Vi undersøgte, om PDGF-BB fremmet specifikke binding af både β-catenin og HIF-1α til Mcl-1 promotoren ved en sekventiel chip assay. Fraktioneret chromatin fra kontroller og PDGF-BB-behandlede ARCaP
M-celler blev først immunpræcipiteret med et β-catenin antistof og præcipitaterne blev underkastet en re-chip assay med en HIF-1α antistof.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.