PLoS ONE: genetiske varianter i telomer-Vedligeholdelse Gener og blærekræft Risk

Abstrakt

Telomerer er kritiske i at opretholde genomisk stabilitet. Genetiske varianter i telomer pathway gener kan påvirke telomer og telomerase-funktion, og efterfølgende kræftrisikoen. Vi evaluerede 126 SNPs fra 10 gener relateret til telomer regulering i forhold til risikoen blærekræft. Fem SNP’er, 4 fra TEP1 genet og 1 fra PINX1 genet, viste sig at være yderst signifikant (P 0,01). Ud af disse blev den mest betydningsfulde forening findes i rs2228041 af TEP1 (OR 1,66, 95% CI 1,19-2,31), mens rs1469557 af PINX1 havde en beskyttende virkning (OR 0,75, 95% CI 0,61-0,93). Haplotype analyse viste, at en TEP1 haplotype bestående af varianten alleler af 7 SNPs udviste en 2,28 gange forøget risiko (95% CI 1,13-4,60). Vi derefter udført kumulativ analyse af flere risikofaktorer varianter, samt klassifikation og regression Tree (CART) at lede efter gen-gen interaktioner. I kumulativ effekt analyse, gruppen med 4-5 risiko varianter havde en OR på 2,57 (95% CI = 1,62-4,09) versus referencegruppen med 0 risiko varianter. Den CART analyse kategoriseret individer i fem undergrupper med forskellige blære kræft risikoprofiler baseret på deres særskilte genotype baggrund. Til vores viden, dette er en af ​​de største, mest omfattende undersøgelser af blærekræft risiko vedrørende telomer-regulerende pathwaygen-SNPs og vores resultater støtter, at genetiske variationer af telomer vedligeholdelse modulere blærekræft risiko individuelt og i fællesskab.

Henvisning : Chang J, Dinney CP, Huang M, Wu X, Gu J (2012) genetiske varianter i telomer-Vedligeholdelse Gener og blærekræft Risk. PLoS ONE 7 (2): e30665. doi: 10,1371 /journal.pone.0030665

Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA

Modtaget: September 19, 2011; Accepteret: December 27, 2011; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver CA131335, CA74880, CA91846, og CA127615. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Telomerer danner enderne af kromosomer og består af nukleotid TTAGGG sekvensgentagelser og den associerede protein-kompleks shelterin i pattedyrceller [1], [2]. Telomerer forhindrer enderne af kromosomer fra at blive anerkendt som dobbelt-strenget pauser og er afgørende for genomisk integritet, forebyggelse end-to-end fusion, nucleolytisk nedbrydning, og atypisk rekombination [3]. Den shelterin kompleks, der består af seks kerneproteiner, hjælper til at forhindre genkendelse af telomerer ved DNA beskadigelse reparation pathways [2], og også modulerer telomeraseaktivitet [2], [4]. Telomerase, en specialiseret revers transkriptase, tilføjer TTAGGG gentager at aflange telomerer hjælp af en intern RNA-template [5].

I somatiske celler, telomerer gradvis forkorte med 30 til 200 bp efter hver mitotiske deling grund af ufuldstændig replikation af telomert DNA ved DNA-polymeraser, der er kendt som den endelige replikation problem [6]. Når telomer længde bliver kritisk kort, tab af resultater beskyttelse telomer i initiering af celle ældning og i sidste ende fører til apoptose, udløser DNA-skade respons på telomer kromosom ender, som er anerkendt som dobbelt-strenget pauser [7]. En sådan proces resulterer i stærk selektion for celler med defekte DNA damage reaktioner, der kan omgå denne telomer kontrolpunkt [8]. Ubegrænset proliferation er opnået gennem opregulering af telomerase, der kompenserer for telomer erosion i cancerceller [9]. er blevet detekteret telomeraseaktivitet i -85% af cancere, og er karakteristisk for de fleste kræftformer [10], [11]; i flere tert-transgene musemodeller, konstitutiv telomerase ekspression øget kræftincidens [12]. Tab af telomer funktion og fortsatte spredning fører til ende-til-ende fusioner, brudte kromosomer, brud-fusion bro cykler og generel genetisk ustabilitet; resultatet accelereres genetiske ændringer, der er ansvarlige for yderligere vækst fordele og cancer celleudvikling [13].

omvendt forhold mellem telomer længde og alder er også veldokumenteret [9]. Satsen for telomer nedslidning er afhængig af mange faktorer: rygning, fedme, usund livsstil og oxidativt stress er alle forbundet med kortere telomerer [14]. Genetik stærk indflydelse telomer længde og genetisk arvelighed af leukocyt telomer længde er anslået til omkring 80% [15]. Telomer afkortning har været forbundet med øget risiko for flere kræftformer, med blærekræft er den mest konsekvente [16]. Tidligere undersøgelser har vist, at enkelt-nucleotid polymorfismer (SNP’er) i telomer pathway gener associeret med ændret risiko cancer; for eksempel en nylig undersøgelse viste varianter af telomerase-associeret protein (

TEP1

) forbundet med øget blærekræft risiko [17]. I denne aktuelle undersøgelse, tog vi en sti tilgang til at evaluere sammenslutning af haplotype tagging og funktionelle SNPs i kritiske telomer vedligeholdelse gener, herunder shelterin komponent, telomerase, og telomer /telomerase forbundet gener, med risiko blærekræft i en stor rets- kontrol undersøgelse.

Resultater

Patient karakteristika

i alt 803 kaukasiske patienter diagnosticeret med blærekræft og 803 kaukasiske kontrolpersoner blev inkluderet i denne undersøgelse (tabel 1). Cases og kontroller blev matchet på køn (p = 0,95) og alder (p = 0,10). Sager havde en højere procentdel af nuværende rygere (47,45%) versus kontroller (23,29%, p = 5.15E-21), og blandt nogensinde rygere, kasser havde en højere betyde pack år (43.02 ± 30,73 år) versus kontroller (29,92 ± 27.87 år, p = 2.78E-12).

risiko forbundet med individuelle SNPs

Blandt de 126 analyserede SNP’er blev 24 SNPs (19%) signifikant associeret med blærekræft risiko på 5% niveauet. Efter fjernelse SNP’er med høj binding (r

2 0,8 mellem nogle få tagging SNPs og kodende SNP’er), forblev 18 SNP’er for den efterfølgende analyse (tabel 2). Det er bemærkelsesværdigt, at 7 SNPs i både

TEP1

og

PINX1

gen var signifikante ved p 0,05. Alle SNPs i

TEP1

var forbundet med øget risiko, og alle SNPs undtagen én i

PINX1

var forbundet med nedsat risiko for blærekræft. En SNP i POT1, en i TRF2, og to i TNKS var også signifikant. Eftersom multipel testning blev udført, vi beregnet Q-værdi (en falsk opdagelse sats justeret P-værdi) for at justere signifikansniveauet for individuelle SNP’er og Q-værdier for disse 18 SNPs var mellem 0,08 og 0,12 (data ikke vist).

af særlig interesse, 5 SNPs blev fundet at være yderst signifikant (p 0,01), 4 fra

TEP1

og 1 fra

PINX1

. Fordelingen af ​​SNP’er findes i tabel 3. Ud af disse blev den mest betydningsfulde forening findes i rs2228026 af

TEP1

(OR 1,72, 95% CI 1,20-2,44), mens rs1469557 af

PINX1

havde en beskyttende virkning (OR 0,75, 95% CI 0,61-0,93). At udforske samspillet mellem genetiske varianter med rygning status, alder, og tumor stadie, vi udførte stratificeret analyse på disse 5 højsignifikante SNPs, men vi har ikke bemærket nogen signifikant forskel på yderste periferi i aldrig og nogensinde-rygere, i gamle alderen og unge i alderen individer, og i ikke-muskel invasive og muskel-invasive tumorer (data ikke vist).

Fordi mange SNPs i

TEP1

gen var forbundet med øget risiko, og fire ud af 5 meget betydelige SNPs var fra

TEP1

, vi udførte haplotypeanalyse på syv væsentlige

TEP1

SNPs (tabel 4). Sammenlignet med halpotype med vildtype alleler i alle 7 SNP’er, haplotypen indeholder variante alleler i alle 7 SNPs udviste en signifikant øget risiko (OR 2,28, 95% CI 1,13-4,60, p = 0,022). Ingen af ​​de andre hapiotyper viste betydning i at påvirke blæren kræftrisiko

Kombineret effekt af flere SNPs

5 højsignifikante SNPs (p 0,01). Blev anset for kumulative virkninger af SNPs på risiko blærekræft. Vi fandt en signifikant gen-dosering effekt for at øge blærekræft risiko med stigende antal ugunstige genotyper (p for trend = 3.31E-06), og patienterne blev kategoriseret i 3 risikogrupper i henhold til antallet af ugunstige genotyper. Sammenlignet med personer med ingen ugunstige genotyper, at risikoen for blærekræft progressivt med tilsætning af ugunstige genotyper, med yderste periferi på 1,2 (95% CI 0,92-1,62) for lav risikogruppe med en ugunstig genotype, 1,64 (95% CI 1.22- 2.21) til medium-risikogruppe med 2-3 ugunstige genotyper og 2,57 (95% CI 1,62-4,09) for højrisikogruppe med 4-5 ugunstige genotyper (tabel 5).

CART analyse

All signifikant associeret SNP’er (tabel 2) blev analyseret for potentielle gen-gen interaktioner gennem CART analyse. Den oprindelige opdeling var på rs2228041 af

TEP1

, den mest betydningsfulde SNP ud af dem, vurderet for risiko blærekræft. Den endelige træ havde 5 terminale knuder (figur 1). Tabel 6 opsummerer Risikoestimaternes for enkeltpersoner i hver terminal node. Node 1 (N = 101), bruges som reference, havde den laveste risiko og består af patienter, der var GG for rs11250080 på

PINX1

, TC /CC for rs1469557 på

PINX1

, og AA for rs2228041 på

TEP1

. Sammenlignet med personer i node 1, blev de øvrige knuder forbundet med øget blærekræft risiko med yderste periferi spænder fra 1,74 til 3,28 baseret på forskellige genotype kombinationer. Personer i node 5 (N = 177) med AG /GG til rs2228041 på

TEP1

havde den højeste risiko (OR 3,28, 95% CI 1,94-5,57).

Discussion

Denne undersøgelse evaluerede sammenhængen mellem et sæt af SNPs i telomer vedligeholdelse gener og blærekræft risiko. Atten signifikante SNP’er blev fundet: blandt SNPs med meget signifikant sammenhæng (p 0,01), 4 var fra telomerase protein komponent 1 (

TEP1

) og 1 var fra PIN2 /TRF1-interagerende protein 1 (

PINX1

). Vi fandt også en signifikant kumulative virkning af flere SNPs og potentielle gen-gen interaktioner vedrørende risiko.

telomer afkortning og telomerase aktivering er knyttet til genomisk ustabilitet og tumorigenese. Mange undersøgelser har vist, at kortere telomer længde er forbundet med højere risiko for flere kræftformer [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], med den stærkeste beviser i blærekræft [25]. Telomerase er aktiv i de fleste kræftformer og er afgørende for tumorigenese. Det er sandsynligt, at de undersøgte genetiske varianter påvirker kræftrisiko gennem ændringer i mekanismer, der involverer telomer regulering, telomer længde, eller telomerase funktion.

Tidligere undersøgelser har vist valgt genetiske varianter i gener af telomer vej og blærekræft risiko [26 ], [27].

TEP1

er en bestanddel af Ribonukleoproteinkompleks og binder til telomerase. En SNP (rs1760897) i

TEP1

er for nylig blevet forbundet med en øget risiko for blærekræft [17]. Vi genotypet også denne SNP i denne aktuelle undersøgelse og fandt denne SNP var forbundet med et grænsetilfælde signifikant øget risiko for blærekræft (OR 1,17, 95% CI 0,94-1,45 og OR 1,27, 95% CI 0,91-1,79 for heterozygote og homozygote variant genotyper henholdsvis; p for trend = 0,08). Hertil kommer, at vores undersøgelse fandt vi 7

TEP1

SNPs forbundet med øget risiko blærekræft. Den mest markante SNP blev rs2228041. Denne SNP er en ikke-synonym SNP, Arg1155Gln. Ændring af en stærk basisk aminosyre (arginin) til en neutral aminosyre (glutamin) kan forventes at påvirke protein struktur og funktion. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at afgøre, hvordan dette

TEP1

SNP påvirker TEP1 funktion, telomerase-aktivitet, og blærekræft risiko. Vores haplotypeanalyse understøtter også rolle TEP1 i blærekræft ætiologi.

Ud over

TEP1

, fandt vi stor betydning i en SNP på

PINX1

gen og lavere blærekræft risiko.

PINX1

regulerer telomerase funktion og kan direkte binde til TERT og hæmme telomerase-aktivitet; inhibering af

PINX1

øger telomeraseaktivitet, mens overekspression gør det modsatte [28]. En tidligere undersøgelse viste, at

PINX1

hæmning fører til afvigende telomerase aktivering og telomer forlængelse, gå på kompromis med telomer funktion og forårsager kromosomal ustabilitet, og der er dokumentation for den rolle,

PINX1

som en tumor suppressor, der gennem et telomerase-afhængig mekanisme [29]. Vores resultater giver yderligere støtte, som

PINX1

er en potentiel tumor suppressor. Potentielt, genetisk variation af

PINX1

gen kunne ændre kræftrisiko gennem mekanismer telomer regulering, og flere undersøgelser er berettiget til at vurdere genetiske varianter inden for

PINX1

gen og association med risiko blærekræft, samt at definere, hvordan

PINX1

regulerer telomerer gennem telomerase-afhængige eller uafhængige mekanismer.

Vi udførte kumulativ analyse af flere SNPs. Selvom det analyserede SNPs individuelt haft moderat effekt på risiko blærekræft, fandt vi en stærkere kumulativ effekt. Disse resultater bekræfter multigenicity for blærekræft, som nævnt i tidligere undersøgelser [30], [31], [32], og identifikation af flere risikofaktorer varianter yderligere kunne forbedre risikostyringen forudsigelse. Samt, vi udførte CART analyse for at udforske høj ordens gen-gen interaktioner mellem SNPs. Da blærekræft er en multi-faktor sygdom, samspillet mellem genetiske variationer samt miljømæssige faktorer såsom rygning og erhvervsmæssig eksponering, kan forventes at bidrage med en akkumulerende effekt til risiko.

Der er flere styrker af denne undersøgelse . Prøven størrelse er relativt stor for en kandidat gen undersøgelse. Undersøgelsen befolkning er homogen med minimal confounding af befolkningens struktur. Patienterne blev alle histologisk bekræftet. SNP panelet er udtømmende. Der er også et par begrænsninger af denne undersøgelse. Vi brugte en falsk opdagelse sats (FDR) tilgang til at justere for multipel testning og FDR-justerede P-værdier var mellem 0,08 og 0,12 for de betydelige SNPs. En FDR tærskel på 0,2 blev foreslået af tidligere undersøgelser for kandidat-gen undersøgelser [33]. Nogle af de foreninger er sandsynlige chance fund. Fremtidige eksterne valideringer i uafhængige studier er berettiget til at bekræfte resultaterne af vores undersøgelser. Hertil kommer, at CART analyse var sonderende, og resultaterne skal tolkes med forsigtighed. Ikke desto mindre er vores undersøgelse tyder stærkt på, at genetiske variationer i telomer vedligeholdelse gener modulere blærekræft risiko individuelt og i fællesskab.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patienter underskrevet en skriftlig informeret samtykke og denne undersøgelse er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Review Boards (IRB) af MD Anderson Cancer center, Baylor College of Medicine, og Kelsey-Seybold Clinic.

undersøgelse befolkning og dataindsamling

Denne undersøgelse omfattede blærekræft patienter, der blev rekrutteret fra The University of Texas MD Anderson Cancer center og Baylor College of Medicine, rekruttering starter i 1999. sager blev alle histopatologisk bekræftet og tidligere ubehandlede for chemotheraphy eller strålebehandling pre-rekruttering. Der var ingen begrænsninger for ansættelse på alder, køn, eller scene. Kontrolpersoner blev rekrutteret fra Kelsey Seybold, den største private multispecialty læge gruppe i Houston. De var raske uden forudgående historie af kræft, undtagen ikke-melanom hudkræft, og blev matchet til patientens sager efter alder (± 5 år), køn, og etnicitet. Detaljeret spørgeskema data, herunder demografi, familie historie, rygning status, alkoholindtagelse, arbejdsforhold og sygehistorie blev indsamlet fra alle fag gennem personlig samtale. Personer, der havde røget mindre end 100 cigaretter i deres levetid blev defineret som aldrig rygere, enkeltpersoner, som havde røget mindst 100 cigaretter i deres levetid, men havde afslutte mere end 12 måneder forud for diagnosen (tilfælde) eller interview (kontroller) blev defineret som tidligere rygere, og enkeltpersoner, der var i færd med rygning eller som havde stoppet 1 år før blev defineret som rygere. Tidligere og nuværende rygere blev defineret som nogensinde rygere. Svarprocenten for cases og kontroller var 92% og 76,7%, hhv. Fordi 90,6% af patientpopulationen var af kaukasisk, vi inkluderede kun kaukasiere i dette studie.

SNP udvælgelse og genotyping

Vi valgte 10 af de vigtigste gener kodende for proteiner involveret i telomer vedligeholdelse, herunder telomerase, shelterin proteiner, og flere telomer associerede proteiner, baseret på litteratur minedrift. Tagging SNPs blev udvalgt af binning algoritme LDSelect software (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl) (r

2 0,8, MAF 0,05) inden for 10 kb opstrøms for 5 ‘utranslaterede region (UTR) og 10 kb nedstrøms for 3’UTR af hvert gen. Vi inkluderede også alle de bekræftede kodende SNP’er i dbSNP databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Det endelige antal SNPs for hvert gen regionen var som følger:

PINX1

, 27; POT1, 8; PIP1, 1;

TEP1

, 42; TRF2, 2; TRF2IP, 2; TERT, 12; TNKS, 21; TNKS1BP1, 5; og TNKS2, 6. Genomisk DNA blev isoleret fra perifert blod ved hjælp af QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Genotypebestemmelse blev udført ved anvendelse Illumina s iSelect custom SNP-array platform ifølge producentens Infinium II assayprotokol (Illumina). Genotypebestemmelse data blev derefter analyseret og eksporteret hjælp BeadStudio software (Illumina). Den gennemsnitlige takst for SNP-array var 99%. Tilfældigt valgt 2% af prøverne blev kørt i dubletter og overensstemmelsen af ​​genotype opkald var 99,9% for duplikerede prøver

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af STATA 10,0 software (Stata Corp. ). χ

2 test og Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligning kategoriske variabler, og Students

t

test blev anvendt for kontinuerlige variabler. Godhed-of-fit χ

2-analyse blev anvendt til at teste Hardy-Weinberg ligevægt. Effekter af SNP på risiko blærekræft blev estimeret som odds ratio (OR) og 95% konfidensinterval (CI). Ubetinget multivariable logistisk regression blev udført under dominante, recessive, og additive modeller af arv justering for alder, køn og rygning status, hvor det er relevant. Falsk opdagelse sats (FDR) baseret Q blev beregnet til individuel SNP at justere for multipel testning. Vi anvendte en tærskel på 0,20 for Q-værdi, der tidligere er foreslået som mere passende for moderate-sized studier med kandidat-gen tilgange [33]. Haplotype analyse blev udført på SNPs i

TEP1

gen

For den samlede virkning af flere SNPs på kræftrisiko, SNPs med signifikant sammenhæng (P-værdi for bedste montering model 0,01). Var evalueret. Brug af emnet gruppen uden ugunstige genotyper som reference, regioners og 95%-initiativer blev beregnet for de andre grupper ved hjælp ubetinget multivariat logistisk regression justeret for alder, køn, rygning status og pakke år. Ugunstige genotyper var underopdelt i 3 grupper (lav-, mellem- og høj-risiko) efter antal ugunstige genotyper. Referencegruppen var en uden ugunstige genotyper. High-ordens-gen-gen interaktioner blev undersøgt via Klassificering og Regression Tree (CART) analyse, udført ved hjælp HelixTree Genetics Analysis Software (v. 4.1.0, Golden Helix). Kort fortalt CART bruger rekursiv partitionering at skabe et beslutningstræ muliggør identifikation af forskellige kombinationer af variabler på forskellige niveauer af risiko. Analyse starter med roden node med alle tilfælde og kontroller, bestemmer den mest optimale split, dvs. mindste P-værdi, for hvert af følgende node, med mangfoldighed justeret P-værdier til at styre trævækst (p 0,05). Processen fortsætter, indtil terminale knuder har ingen statistisk signifikant split eller nå en forudbestemt minimal størrelse. Yderste periferi og 95% CIs for hver terminal node blev beregnet ved hjælp af logistisk regression. P value≤0.05 blev anset for at være grænsen for signifikans i denne undersøgelse; alle statistiske analyser var tosidet.