PLoS ONE: Distinct genetiske ændringer i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Tyktarmskræft (CRC) udvikling omfatter ofte kromosomal instabilitet (CIN), der fører til amplificeringer og sletninger af store DNA-segmenter. Epidemiologiske, kliniske, og cytogenetiske undersøgelser viste, at der er betydelige forskelle mellem CRC tumorer fra afroamerikanere (AAS) og kaukasiske patienter. I denne undersøgelse, vi bestemt genomisk kopi nummer afvigelser i sporadiske CRC tumorer fra AA’ere, for at undersøge mulige forklaringer på de observerede forskelle.

Metode /vigtigste resultater

Vi anvendte genom-bred vifte komparativ genom hybridisering (aCGH) med en 105k chip til identifikation kopital aberrationer i prøver fra 15 AAS. Derudover gjorde vi en befolkning sammenlignende analyse med aCGH data i kaukasiere samt med et meget opreklameret liste over tyktarmskræft gener (CAN gener). Der var i gennemsnit 20 aberrationer pr patient med flere amplifikationer end sletninger. Analyse af DNA-kopi antal hyppigt ændringer kromosomer viste, at deletioner forekom primært i kromosomer 4, 8 og 18. Kromosomale duplikationer forekom hos mere end 50% af tilfældene på kromosomer 7, 8, 13, 20 og X. CIN profil viste nogle forskelle sammenlignet med kaukasiske ændringer.

konklusioner /betydning

kromosom X forstærkning i mandlige patienter og kromosomer 4, 8 og 18 sletninger var fremtrædende afvigelser i AA’ere. Nogle kan gener blev ændret ved høje frekvenser i AA’ere med

EXOC4, EPHB6, Gnas, MLL3

TBX22

som de hyppigst slettet gener og

HAPLN1, ADAM29, SMAD2

og

Smad4

som de hyppigst forstærkede gener. Den observerede CIN kan spille en markant rolle i CRC i AA’ere

Henvisning:. Ashktorab H, Schäffer AA, Daremipouran M, Smoot DT, Lee E, Brim H (2010) Særskilte genetiske ændringer i kolorektal cancer. PLoS ONE 5 (1): e8879. doi: 10,1371 /journal.pone.0008879

Redaktør: Ulrich Zanger, Dr. Margarete Fischer-Bosch Institut for Klinisk Farmakologi, Tyskland

Modtaget: September 30, 2009; Accepteret: 2 januar 2010; Udgivet: 26 Jan 2010

Copyright: © 2010 Ashktorab et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af PHS bevilling fra National Institutes of Health CA102681, den Intramural Research Program for NIH, NLM og GCRC pris fra Howard University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige kræftform i USA [1]. Det har en højere forekomst og forårsager flere dødsfald i afroamerikanere end i andre racer. De fleste kolorektale cancere skyldes adenomer, i en proces beskrevet som adenom-carcinom-sekvensen [2]. Ligesom andre kræftformer, initiering og progression af CRC er forbundet med en ophobning af ændringer i funktionen af ​​vigtige regulatoriske gener og genetisk ustabilitet.

Der er beskrevet tre store former for genetisk ustabilitet i CRC [2], [3 ], [4]. I omkring 13% af CRC tilfælde fejlparringsreparationsmangel fører til mikrosatellit instabilitet (MIN) [5]. Ca. 40% af CRC tumorer er kendetegnet ved epigenetiske ændringer især DNA-methylering, et fænomen betegnet CpG Islands Methylator fænotype (CIMP) [6], [7]. I de resterende 47% af CRC’er, kromosomal ustabilitet fører til gevinster og tab på store dele af kromosomer [8].

CIN kategori omfatter kræft med aneuploide eller polypagtige karyotyper, og kræft, der har flere gevinster eller sletninger af kromosomale arme, eller flere translokationer. CIN resultater fra specifikke mutationer og /eller gener bliver bragt til tavshed, og kan skyldes strukturelle mangler, der involverer centromerer eller centrosom, mikrotubuli dysfunktion, telomerer erosion, kromosombrud og fiasko af cellecyklus checkpoints [9]. Købet af tilbagevendende kromosomale gevinster og tab i progression fra høj kvalitet adenomer til invasive karcinomer findes i CRC tumorer [10]. En af de tidligste erhvervede genetiske abnormiteter under CRC progression involverer kromosom 7 forstærkning, som også er observeret hos nogle kolon adenomer [11]. På senere stadier, andre specifikke kromosomforandringer blevet almindeligt, såsom gevinst ved 8Q, 20Q [12], 7, 13 [13], [14] og sletninger på 8p, 17p, 18q [13], [15] 15q og 20q [16].

CIN og MIN fænotyper blev oprindeligt betragtet gensidigt udelukkende, da MIN tumorer generelt har stabile og diploide karyotyper [17], [18]. Men de seneste undersøgelser vist, at MIN og CIN kan forekomme i samme tumor [19], [20]. Trautmann et al. fundet, at mindst 50% af MSI-H-tumorer har en vis grad af kromosomale forandringer [21]. Selvom bevis for en vis grad af CIN kunne findes i størstedelen af ​​MSI-H-tumorer, de specifikke ændringer identificerede afveg mellem MSI-H og MSS tumorer. MSI-H-tumorer havnen gevinster kromosomer 8, 12, 13 og tab af 15q og 18q mens MSS tumorer har en høj grad og variabel kromosomal vifte af aberration [16], [21].

LASSMANN et al. studerede 287 målsekvenser i 22 kaukasiske kolorektale tumorer og fundet hyppige afvigelser i bestemte regioner af kromosomer 7, 8, 13, 17, 20 og foreslog nogle kandidatgener med hyppige sletning eller forstærkning i disse regioner [22]. Undersøgelser, der identificerer gener med ændret kopi nummer forbundet med tumorigenese kan føre til påvisning af specifikke mål for kræftbehandling og øge vores forståelse af tumorigenese. Vi hypotesen, at identifikation af kromosomafvigelser i CRC’er fra AA patienter kan hjælpe med at forklare aspekter af tyktarmskræft patogenese specifikke for denne population. Derfor undersøgte vi CIN i AA CRC patienter ved at anvende aCGH til tumorprøver. Vi sammenlignede vores resultater med de nyligt offentliggjorte resultater i kaukasere [22], og en liste over tyktarmskræft gener foreslået af Sjöblom et al [23] efter deres grundige genetisk analyse af 11 kolon tumorer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Howard University Board Institutional Review, og blev opnået skriftligt informeret samtykke.

Patienter

Friske frosne biopsier fra colon (n = 15) blev opnået fra afrikansk-amerikanske patienter, der gennemgår koloskopi på Howard University Hospital. Denne undersøgelse blev godkendt af Howard University Board Institutional Review. Formålet med denne undersøgelse blev forklaret til patienterne før koloskopi og de deltagende patienter gav informeret samtykke. Kliniske data indsamlet på hver patient inkluderet race, køn, der er forbundet fortid sygehistorie, medicinforbrug, og arvelig colon cancer. Patienter blev anset for støtteberettigede, hvis koloskopi resulterede i en diagnose af adenocarcinom, bekræftet ved histopatologi. Fra gennemgang af medicinske journaler, blev kliniske oplysninger indsamles og registreres på grundlag af amerikanske Blandede kræft iscenesættelse system. Patienterne i denne undersøgelse selv identificeret som AA’ere.

Prøver Valg og DNA Extraction for aCGH Analyse

Friske tumorblokke blev skåret i 5 um sektioner på SuperFrost dias (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) . Tumor og normale områder var kendetegnet af en patolog (E.L) under anvendelse af H Promega) blev mærket ved vilkårlig priming med Cy5-dUTP og Cy3-dUTP, henholdsvis ved hjælp af Agilent Genomisk DNA Labeling Kit Plus. Efter reaktionen mærkning blev de individuelt mærkede test- og referenceprøver koncentreret ved anvendelse Microcon YM-30 filtre (Millipore, Billerica, MA) og derefter kombineret. Efter probe denaturering og præ-annealing med Cot-1-DNA, blev hybridisering udført ved 65 ° C med rotation i 40 timer ved 20 omdrejninger i minuttet. Fire trin blev udført med Agilent Oligo CGH vaskeopløsninger: vaskebuffer 1 ved stuetemperatur i 5 min, vaskepuffer 2 ved 37 ° C i 1 min, en acetonitril skylning ved stuetemperatur i 1 min og en 30 sek vask ved stuetemperatur i Agilents stabilisering og Tørring Solution. Kopiér nummer variationer (CNVs) blev identificeret ved Agilent Feature Extraction software 9 og analyseret med Agilent CGH analytics 3.4 software, ved hjælp af de statistiske algoritmer z score og ADM-2 ved hjælp af følsomhed tærskler på 2,5 og 9, henholdsvis, og en glidende gennemsnit vindue på 0,2 Mb . Steder af CNVs blev rapporteret med hensyn til det menneskelige genom sekvens samling Build 35, hG17 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Analyse af Gene Indhold af CNVs

Navne på gener foreslået i [22], [23] blev standardiseret ved hjælp af webstedet HUGO Gene Nomenklaturudvalget (www.genename.org). Placering af disse gener blev bestemt ved hjælp af datafiler underliggende NCBI s MapViewer browser (www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview). Brug af software nyudviklet til denne undersøgelse, identificerede vi hver overlapper mellem kandidatgener og CNVs således at gevinst eller tab forholdet var mere ekstrem end en brugerdefineret tærskel for forholdet. For resultaterne vist nedenfor, brugte vi de tærskler for ≥1.2 og ≤0.8 for gevinster og tab, hhv. Softwaren tager som input:

En fil af gener med kromosomet, startposition, og slutposition af hvert gen,

En liste over CNVs angive start, afslutning, og forholdet mellem hver gen;.

Tærskelværdier for gevinster og tab

den software rapporter hver gen sådan, at der er en skærende gevinst /tab, hvis forholdet er over /under de brugerdefinerede nøgletal. For eksempel genet

APC

ligger på humant kromosom 5 i intervallet [112.101.484, 112.209.836]. To patienter har tab med nøgletal 0,8 skærer intervallet [112.101.484, 112.209.836], og syv patienter har gevinster med nøgletal 1.2 skærer samme interval. De samme tærskler blev anvendt i undersøgelsen [22], som vi sammenlignet vores resultater. Resumé statistikker om forstærkningerne og sletninger blev tabuleret i den nye software og bruge Excel.

Resultater

Karakteristik af de analyserede prøver

Vi studerede 15 kolon adenokarcinomer fra AA patienter. Gennemsnitsalderen for denne gruppe af patienter var 63,5 år med otte kvinder og syv mænd. Tumorerne blev hovedsagelig moderat differentieret (93%), og i trin II eller III (87%). To tredjedele af prøverne var højresidig (67%; tabel 1). En sammenligning af vores gruppe af patienter med dem i LASSMANN et al [22] har vist ingen statistisk signifikante forskelle mellem de to grupper (tabel 1).

Resume af genomisk Ændringer

Alle 15 sager viste nogle kromosomal ustabilitet. Disse kromosomafvigelser var ikke ligeligt fordelt over alle kromosomerne. Kun kromosom 21 viste ingen amplifikationer, og kun kromosom 8 viste ingen sletninger. I alt 182 forstærkning begivenheder og 101 sletning begivenheder blev fundet i 15 prøver alle sammen, med gennemsnitlige tællinger af 12,1 amplificeringer og 6,7 sletninger per patient. gennemsnit på 20 aberrationer blev fundet i hver patient på denne undersøgelse. Amplifikationer var fremtrædende i kromosomer 2 (40%), 6 (47%), 7 (80%), 8 (60%), 12 (40%), 13 (60%), 16 (47%), 20 (67 %) og X (60%). Kromosomale sletninger var hyppigere på kromosomerne 2 (47%), 4 (53%), 5 (60%), 7 (40%), 8 (67%), 17 (40%), 18 (60%), 19 (40%), og 22 (40%, tabel 2).

de afvigelser blev ulige fordelt blandt de 15 patienter med fire patienter, der har mindre end 10 aberrationer (patienter 3, 11, 12 og 13 ). Antallet af aberrationer synes ikke at være fase-specifik, da disse fire patienter er i trin 1, 3c, 3c og 3a henholdsvis. Andre patienter med disse stadier vises mange flere afvigelser (patienter 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11 og 13). Antallet af CNVs synes ikke at afhænge af patienternes alder da patienter 1 og 2, den yngste i vores gruppe (51 og 53 år), har 55 og 42 aberrationer henholdsvis mens patienter 3, 11, 12 og 13 med det færreste antal aberrationer er 65, 83, 73 og 61 år, hhv. Der var også ingen sammenhæng mellem køn og hyppigheden af ​​CNVs.

Sammenligning af aCGH data med CRC CAN Gener

En analyse af Sjöblom et al. [23] af 11 bryst og 11 colontumorer førte til oprettelsen af ​​en liste over potentielt ændrede gener i disse former for tumorer. Mere end 90% af tumorerne var stadie IV i Sjöblom et al sammenlignet med 6,6% i denne undersøgelse. Vi kontrolleret vores aCGH data for gevinster /tab af de 68 gener, der viste sig at være generelt ændres i tyktarmskræft tumorer. De fleste af disse gener viser en ikke-nul frekvens af ændring i vores prøver. Blandt de CRC generne fastlagt af Sjöbolm et al [23], den mest almindeligt slettet i vores prøver var

EPHB6, EXOC4 (SEC8L1), Gnas, MLL3

og

TBX22

. De mest almindeligt forstærkede gener var

HAPLN1 (CRTL1), ADAM29, SMAD2

og

Smad4 Hotel (tabel 3).

komparativ analyse af aCGH data mellem AA’ere og kaukasiere

Vi sammenlignede vores aCGH data for AA patienter med listen over de mest slettet eller forstærkede gener opnået med kaukasiske tumorvæv ved LASSMANN et al. [22]. De colorektale cancere i vores undersøgelse var mere end 90% moderat differentieret som ligner den LASSMANN et al undersøgelse. Men andelen af ​​trin II og III tumorer var, 68% og 32% i LASSMANN et al og 33%, 53% i denne undersøgelse. Vores Sammenligningen viste, at 29 gener har et lignende mønster af ændringer i begge populationer, mens 13-gener viste forskellige profiler (tabel 4). Af disse 13 gener,

ATM

genet blev hovedsageligt forstærket i kaukasiere.

DCC

genet blev hovedsageligt forstærket i kaukasiere men slettet i AA’ere (p 0,05).

EGR2, FLII, LLGL1, MAP2K5, PCNT, RAF1, SP6, THRB

, og

TOP3A

gener er blevet slettet i kaukasiere men uændret i AA patienter. Seks gener var slettet i AA’ere, men ikke i kaukasiere med statistisk signifikante forskelle nemlig;

ATM, INS, KAL1, LRRC32, TOP3A

og

XIST

(tabel 4).

STS

gen blev slettet i kaukasiere (p 0,05) og forstærkes i AA’ere mens

PRPF6

blev opformeret i AA’ere og uændret i kaukasiere (tabel 4). Metoden til sammenligning udelukket identificere gener, der ofte ændres i AA’ere, men ikke indgår i LASSMANN et al undersøgelse.

Diskussion

For at dechifrere de mulige genetiske årsager ligger til grund for høj forekomst af tyktarmskræft i AA’ere, vi tidligere gennemført undersøgelser på MSI, methylering af CAN gener og mutationer af kendte gener såsom

BRAF

KRAS

[24], [25], [26 ]. Mens disse undersøgelser viste nogle af de genetiske og epigenetiske detaljerne i denne population, har ingen vist nogen slående forskelle mellem AA’ere og den almindelige befolkning. Vi her foretaget den første analyse af hele genomet af colon tumorer fra AA patienter med det mål at have en mere omfattende billede af de genomiske regioner er involveret i colon carcinogenese. Vi sammenlignede vores resultater med dem, der blev offentliggjort den kaukasiske prøver [22] og med en bredt omtalte liste over tyktarmskræft gener [23].

Et gennemsnit på 20 afvigelser blev fundet i de analyserede tumorer styrkelse af kromosomale i denne population med mere forstærkning (12,13 per tilfælde) end sletninger (6,73 per sag) peger i retning af en højere rolle for onkogener aktivering end tumorsuppressorgener ustabilitet i colon carcinogenese deaktivering i denne proces. De CRC ændringer målrettet visse kromosomer mere end andre. Kromosomer 7, 8, 13, 20 og X blev amplificeret i mere end 50% af tilfældene i denne undersøgelse. Det er fastslået, at kromosomerne 7, 8, 13 og 20 er involveret i CRC gennem forstærkning [22]. Vores resultater tyder den yderligere betydning af kromosom X, som blev amplificeret i 60% af tilfældene. Mange publikationer henviser til kromosom X indeholder tumorsuppressorgener detekteret efter sletninger i tumorer [27]. Forstærkning af kromosom X p og q arme forekom hyppigere hos de mandlige patienter (5 ud af 7 (71,4%)) end de kvindelige dem (2 af 8 (25%)). En undersøgelse af japanske CRC patienter fandt ligeledes, at gevinster på kromosom X er mere fremtrædende i mandlige end kvindelige patienter [28].

I vores undergruppe af 7 mandlige patienter, 3 (42,8%) viste en sletning af en fælles region der spænder fra Yq11.223 gennem centromeren til Yp11.31 båndet. Der er debat over mulige rolle Y kromosomale tab i sygdomme som akut myeloid leukæmi eller om en sådan proces er bare aldersrelateret [29]. Patienter 4, 7 og 10 med Y-kromosomale sletninger er 71, 57 og 64 år hhv. er behov for en større mandlig CRC befolkning til at sortere ud rolle denne kromosomet kan spille i tyktarmskræft.

Kromosomer som sletninger er kendt for at være hyppige i CRC er 8, 15, 17 og 18 [22]. I vores gruppe, kromosomer 4, 8 og 18 viste sletninger i over 50% af tilfældene, mens kromosomer 15 og 17 blev slettet ved frekvenser på 33,3% og 40%. Således af foranstaltningen af ​​kromosomer med hyppige sletninger, CRC i AA’ere synes, at svare til CRC i kaukasiere.

Vi kontrollerede liste med 68 gener fra Sjöblom et al [23], der er potentielt involveret i tyktarmskræft at se status af disse gener i vores gruppe patienter. Alle disse gener viser en vis grad af ændring (amplifikation eller deletion) i vores patienter. Disse resultater styrke deres CAN-gen status (tabel 3). En af de mest slettede gener var

EPHB6

der er kendt for at hæmme brystcancercellelinier invasivitet [30]. Andet gen

EXOC4 (SEC8L1),

som indeholder en polymorfisme associeret med type 2-diabetes [31] blev også hyppigt deleteret i vores prøver, og vides at spille en rolle i synaptogenese og hjernens udvikling [32]. Proteinet EXOC4 er en del af exocyst kompleks, der er blevet impliceret i brystcancer invasionsevne [33].

MLL3

gen ændres ikke i koreanske CRC patienter [34] og sjældent ændres i en anden undersøgelse [35], men det er en af ​​de hyppigste mål for sletning i vores gruppe af patienter.

Gnas

gen, hvis ekspression forøger Galphas udtryk er en proapoptotiske gen involveret i mange faste organer kræftformer [36]. Dens funktion er i overensstemmelse med vores konstatering af, at det også er stærkt slettet i AA CRC patienter. Mutationer i hyppigt slettede gen

TBX22

er knyttet til ikke-syndromisk ganespalte [37], men

TBX2

har nogen kendt rolle i tumorigenese.

Blandt de CAN generne fra Sjöblom et al. liste [23], følgende er blandt de hyppigst forstærket i AA patienter:

SMAD2, Smad4, ADAM29

, og

HAPLN1

. Proteiner ifølge ADAM familie er en gruppe af metalloproteinase hvoraf ADAM17 er den mest studerede. ADAM17 er påkrævet for dannelsen af ​​de aktive former af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) ligander, og dets funktion er afgørende for udviklingen af ​​epitelvæv [38]. Skulle ADAM29 fungerer også til at aktivere vækst receptorer, så dens forstærkning i tumorer ville give mening.

HAPLN1 Hotel (

CRTL1

) genet koder en ekstracellulær matrix protein, der spiller en vigtig rolle i hjerte udvikling [39]. Udtrykket af

HAPLN1

kan ændres i løbet af kolorektal carcinogenese [40]. Begge

SMAD2

Smad4

er kendt for at være involveret i celleproliferation, apoptose og differentiering gennem TGF vej [41]. Som sådan kan deres forstærkning være medvirkende til vækstfremme og carcinogenese sammen med andre gener.

Vi kontrollerede 42 CRC gener foreslået af LASSMANN et al. at være hyppige mål for CNVs [22]. Kommenterer nogle få af de gener, for hvilke de kaukasiske og AA prøver viste forskellige mønstre af aberrationer.

ATM

gen, hvis kodede protein er afgørende for DNA-skader reaktion og bidrager til cellulære homeostase [42], blev ofte forstærket i kaukasiske patienter, men ikke i AA-gruppe. På den anden side,

PRPF6

kun amplificeret i atomabsorptionsspektrometri (tabel 4). Mutationer i gener fra samme familie (

PRPF3

,

8

, og

31

) har været impliceret i retinitis pigmentosa [43]. Men ingen rolle i kræft i

PRPF6

eller andre relaterede gener er kendt. To gener viste modstående ændringer i de to patientgrupper;

DCC

primært forstærket i kaukasiere men slettes i AA’ere, mens

STS

gen blev slettet i kaukasiere og forstærkes i AA’ere. Faktisk

DCC

generelt nedreguleres eller slettes hos patienter med tyktarmskræft på grund af dens GTS egenskaber, som er mere i overensstemmelse med dens sletning status ved hjælp aCGH i vores patienter [44]. Den konstitutive ekspression af

STS Salg gen (steroidsulfatase genet) fremmer væksten af ​​humane brystcancerceller [45]. Mens forskellene mellem LASSMANN et al, Sjöblom et al [22], [23] og vores studie kan være delvis på grund af omfanget af kromosomafvigelser, viste data i vores undersøgelse, at hverken tumor stadium eller differentieringsstatusen havde en effekt på kromosomale ustabilitet. Der er behov for fremtidige undersøgelser, hvor scenen og differentieringsfaktorer matchede tumorer fra forskellige populationer evalueres.

Afslutningsvis vores aCGH analyse af 15 AA colorektale carcinomer, viser, at alle tumorer indeholde et vist niveau af kromosomal ustabilitet. Georgiades et al. har identificeret en gruppe af carcinomer uden CIN [4]. Dette er ikke tilfældet for vores AA patienter. Et større antal patienter er nødvendig for at undersøge, om der findes sådanne CRC tumorer inden AAere eller alle AA CRCs har nogle niveauer af CIN. En mere omfattende analyse involverer MSI og methylering profiler af de analyserede tumorer, foruden CIN analyse kunne også kaste mere lys over de vanskeligheder og særlige forhold i disse forskellige processer i tumorigenese. Rolle kromosom X forstærkning i kolon carcinogenese i AA patienter, især mænd, fortjener yderligere undersøgelser.

Tak

Forfatterne takker M. Nouraie for hans bemærkninger om den statistiske del af dette manuskript.