PLoS ONE: FoxQ1 Overekspression påvirker dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft, Associates med fænomenet EMT

Abstrakt

Baggrund

Vi bestemt udtryk for forkhead kasse Q1 (FoxQ1) , E-cadherin (E-cad), Mucin 1 (MUC1), vimentin (VIM) og S100 calcium-bindende protein A4 (S100A4), alle epitel-mesenchymale overgang (EMT) indikatoren proteiner i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) vævsprøver. Vi undersøgte også sammenhængen mellem disse fem proteiner udtryk og andre clinicopathologic faktorer i NSCLC. Endelig har vi vurderet den potentielle værdi af disse markører som prognostiske indikatorer for overlevelse i NSCLC-patienter.

Metoder

Kvantitativ real-time PCR og immunohistokemi blev brugt til at karakterisere ekspressionen af ​​FoxQ1 mRNA og protein i NSCLC. Angivelse af udskrifter og oversat produkter til de andre fire EMT indikator proteiner blev vurderet ved immunhistokemi i de samme kliniske NSCLC prøver.

Resultater

FoxQ1 mRNA og protein blev opreguleret i NSCLC forhold til den normale væv (

P

= 0,015 og

P

0,001 henholdsvis). Ekspression af FoxQ1 i adenocarcinom var højere end i pladecellekræft (

P

= 0,005), og høj ekspression af FoxQ1 korreleret med tab af E-cad-ekspression (

P

= 0,012), og unormal positivitet af VIM (

P

= 0,024) og S100A4 (

P

= 0,004). Yderligere overlevelse analyse viste, at høj ekspression af FoxQ1 (

P

= 0,047) og E-cad (

P

= 0,021) var uafhængige prognostiske faktorer.

Konklusion

FoxQ1 måske spiller en særlig rolle i EMT af NSCLC, og kunne bruges som en prognostisk faktor for NSCLC

Henvisning:. Feng J, Zhang X, Zhu H, Wang X, Ni S, Huang J (2012) FoxQ1 Overekspression Influences dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft, Associates med fænomenet EMT. PLoS ONE 7 (6): e39937. doi: 10,1371 /journal.pone.0039937

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: Marts 27, 2012; Accepteret: 29 maj 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Feng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Social Udvikling og Anvendt Forskning Projekter (S2010041) af Nantong regering, Kina; Internationalt samarbejde og udveksling (2011) fra Institut for Sundhed Jiangsu; og ph.d. Fund (2010) af Tilknyttede Hospital i Nantong University, Nantong, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigst forekommende cancer type, og den førende årsag til kræft død globalt, med større dødelighed end bryst-, prostata- og tarmkræft kombineret [1], [2]. I løbet af de seneste tre årtier i Kina, har lungekræft dødeligheden steget med 465%, med disse maligne sygdomme blive den anden førende dødsårsag efter leverkræft [3]. Trods store fremskridt i behandlingen af ​​cancere i de seneste år, er prognosen for patienter med lungecancer er stadig dårlig, med 5-års overlevelsesraten mindre end 15% [4], [5]. De fleste patienter med lungecancer er langt fremme periode af sygdommen på diagnosetidspunktet, og ca. 85% af disse kræftformer er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1], [6].

Mange nyere undersøgelser har bemærket, at epitel-mesenkymale overgang (EMT) er en kritisk hændelse i tumor invasion og metastase i epitel-afledte kræft [7] – [10], herunder NSCLC [11] – [14]. Bevidstheden om de EMT fænomener går tilbage så tidligt som 1908. I løbet af 1990’erne, tjente EMT mere anerkendelse som en muligvis vigtig mekanisme i kroniske sygdomme, såsom orgel fibrose og kræft [15]. EMT er kendetegnet ved nedregulering af epiteliale differentieringsmarkører E-cadherin (E-cad) [16] – [20] og Mucin 1 (MUC1) [21], og den opregulering af mesenchymale markører, såsom vimentin (VIM) [17] – [20], [22], [23], fibronectin [17], [20], [24] og S100 calcium-bindende protein A4 (S100A4) [25] – [28]. Tidligere undersøgelser har beskrevet en nøglerolle for forkhead box Q1 (FoxQ1) i regulering EMT og aggressivitet i human cancer [29] – [32].

FOXQ1, tidligere kendt som HNF-3 /forkhead homolog 1 (HFH1 ), tilhører et medlem af forkhead transskription faktor familie [32] – [34], som er udtrykt i forskellige væv og spille vigtige roller i udvikling, stofskifte, kræft og aldring [30], [34]. Som en af ​​de første forkhead gener undersøgt, har FOXQ1 blevet impliceret at undertrykke glat muskel-specifikke gener, såsom Sm22α og telokin i A10-celler [35]. FOXQ1 har vist sig at være en nedstrøms mediator af Hoxa1 i embryonale stamceller [36]. Menneskelig FOXQ1, beliggende på kromosom 6p23-25, er blevet isoleret og karakteriseret [33] og spiller en væsentlig rolle i ætiologien af ​​human cancer [31], [32].

Et-trins q RT-PCR blev udført for at bekræfte ekspressionen af ​​FoxQ1 mRNA i humane væv. Resultater blev normaliseret til GAPDH mRNA-niveau. Den FoxQ1 mRNA-niveau i NSCLC væv var højere end i peritumoural væv med statistisk signifikans ved hjælp af en parret-prøver T-test. **

P

0,05. Barer indikerer standardafvigelser (S.E.)

(A) 1 og 2:. Lunge pladecellekræft væv mønster med H 3 og 4: høj ekspression af FoxQ1; 5 og 6: tab af E-cad udtryk; 7 og 8: stærk VIM-positiv farvning. (B) 1 og 2: lungeadenocarcinom væv mønster med H 3 og 4: positiv farvning for FoxQ1; 5 og 6: negativ farvning for MUC1; 7 og 8: opreguleret udtryk for S100A4. (C) 1 og 2: lungeadenokarcinom væv med H 3 og 4: negativ IHC for FoxQ1; 5 og 6: stærk immunologisk reaktion af E-cad; 7 og 8: negativ for S100A4. (D) 1 og 2: lunge pladecellecarcinom væv med H 3 og 4: lavt udtryk for FoxQ1; 5 og 6: høj ekspression af MUC1; 7 og 8: svag udtryk for VIM. Original forstørrelse var × 40 for 1, 3, 5 og 7; og × 400 til 2, 4, 6 og 8. |

(A) Kurver beregnet for FoxQ1 udtryk. Høj udtryk i FoxQ1 gruppen (rød linje) angivet betydeligt mindre overlevelse end lav og ingen udtryk i FoxQ1 gruppen (blå linje). (B) Kurver beregnet for E-cad udtryk. Livslængde hos patienter med positiv E-cad-farvning er meget kortere (rød linje) end hos patienter med negativ E-cad-farvning (blå linie).

Nylige undersøgelser har beskrevet, at FOXQ1 har vist sig at være overudtrykt i kolorektal cancer [29], [31] og brystkræft [31], [32], hvor patienterne har dårlige kliniske resultater [31], [32]. Selv overekspressionen af ​​FOXQ1 i cancercellelinier bekræftede, at genet kan spille en rolle i udviklingen af ​​lungecancer [29], [33] viser overensstemmelsen mellem FOXQ1 ekspressions- og EMT faktorer til at bestemme dets kliniske signifikans i NSCLC ikke tidligere har været rapporteret.

Vi analyserede ekspression af FoxQ1 genet ved anvendelse af kvantitative revers transkription polymerasekædereaktioner (RT-PCR’er) i små, frisk frosne NSCLC vævsprøver. Ekspression af FoxQ1 protein og fire fælles EMT indikator proteiner (E-cad, MUC1, VIM og S100A4) blev vurderet ved immunhistokemi ved hjælp af de samme væv microarray (TMA) sektioner. Derudover undersøgte vi forholdet mellem udtrykkene for de fem gener, der koder disse proteiner og andre klinisk-patologiske faktorer i NSCLC. Endelig har vi vurderet den potentielle værdi af disse markører som prognostiske indikatorer for overlevelse hos patienter med NSCLC.

Metoder

Patienter og TMA af NSCLC prøver

Efter en hel patologisk gennemgang i henhold til den 7. udgave af TNM i lungekræft [37], blev et panel af formalin-fikserede paraffinindstøbte NSCLC væv med tilsvarende tumor-tilstødende væv, der gennemgår kirurgisk terapi opnået fra Tilknyttede Hospital i Nantong University mellem januar 2005 og december 2006. Kliniske data (herunder køn, alder, histologisk type, kvalitet, scene, tumorstørrelse, differentiering, lymfeknude metastaser status) blev opnået fra hver patientens journal.

Blandt de arkivmateriale, 103 væv blokke fra NSCLC patienter med 5 års opfølgende overlevelse optegnelser var til rådighed og anvendes til konstruktion af TMA. Et repræsentativt areal af hver tumor blev valgt og 2,0 mm vævskerner blev anvendt til at konstruere en TMA af Shanghai overgå Biotech (Kina). Kvaliteten af ​​TMA sektioner blev bekræftet under anvendelse hæmatoxylin-eosin-farvning (H revers, 5′-AGG TTG TGG CGC ACG GAG TT-3′) blev designet til at give en 92-bp PCR-produkt. Dataene blev normaliseret ved anvendelse af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) som reference gen (fremadrettet primer, 5′-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 ‘; revers primer, 5’-TGC CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA-3 ‘).

Immunhistokemi (IHC)

IHC blev udført som tidligere beskrevet [39]. Deparaffinerede snit (4 um tykke) fra array-blokke blev separat farves på en Autostainer Universal Staining System (LabVision, USA) under anvendelse af følgende primære antistoffer: muse-anti-FOXQ1 (1:300 fortynding Abcam, UK), muse-anti-E -cad (1:120; Invitrogen, USA), monoklonalt muse-anti-MUC1 (1:200; Novocastra, UK), monoklonalt muse-anti-VIM (1: 100; Invitrogen, USA), og polyklonalt kanin-anti-S100A4 (1 :100, Newmarker, USA). Sekundære antistoffer blev anvendt, var: Envision ged anti-mus HRP (DAKO, USA), Envision gede-anti-kanin-HRP (DAKO, USA). Evalueringen af ​​immunfarvning af disse sektioner blev gjort blind for to trænede patologer, der var uvidende om den kliniske baggrund af prøverne

De procentdele af FoxQ1-positive celler blev scoret og placeret i fire kategorier efter farvning:. 0 til 0%; 1 for 1-33%; 2 for 34-66%; og 3 for 67-100%. De FoxQ1 farvning intensiteter blev også scoret som: 0, blev 1, 2, eller 3. Summen af ​​de procentsatser og intensitet scores bruges som den endelige FoxQ1 farvning score, som vi har skitseret tidligere [39] og er blevet defineret som følger: 0-2, lav udtryk; og 3-6, høj ekspression. Men for positivitet af de udvalgte EMT beslutningstagere (E-cad, MUC1, VIM og S100A4), ingen påviselige eller 10% positiv farvning af tumorceller blev anset som negativ, mens ≥10% positiv farvning af tumorceller blev betragtet positive [40]. Alle prøver blev vurderet ved 4 × og 10 × forstørrelse.

Statistiske metoder

FoxQ1 mRNA-niveau i frisk frosne NSCLC væv og tilsvarende ikke-kræft væv blev normaliseret til GAPDH og analyseret ved hjælp af Wilcoxon signed rank test for Nonparametric Tests. Foreninger mellem clinicopathologic variabler og FoxQ1 proteinekspression blev undersøgt af χ

2 tests. Chi-squared blev anvendt til at bekræfte korrelationen mellem ekspression af FoxQ1 og EMT indikator proteiner. Overlevelseskurver blev beregnet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Kaplan-Meier og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Faktorer vist sig at være af prognostisk betydning i de univariate modeller blev vurderet ved anvendelse af en multivariat Cox regressionsmodellen. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data blev analyseret ved hjælp af STATA 9.0 software (Stata Corporation).

Resultater

FoxQ1 mRNA ekspression i NSCLC og peritumoural væv

Total RNA blev ekstraheret fra de frisk frosne NSCLC væv og underkastet ettrins-QRT-PCR for at undersøge FoxQ1 mRNA-ekspression. Vi undersøgte også prøver fra tilstødende matchede tumorvæv. Når normaliseret til GAPDH, det betyde ekspressionsniveauer af FoxQ1 mRNA i NSCLC og tilsvarende ikke-kræft væv var 0,15 ± 0,02 og 0,04 ± 0,02 (

P

= 0,015), hhv. FoxQ1 udtryk var 3,75 gange højere i gennemsnit i cancer prøver end i ikke-maligne væv (fig. 1).

IHC resultater for FoxQ1 og EMT indikator proteiner i NSCLC væv

Typisk immunhistokemisk farvningsmønstre observeret for de fem gener, der koder for FoxQ1 og de andre fire indikator EMT proteiner i NSCLC er vist i figur 2. Positiv farvning for FoxQ1 var primært lokaliseret til tumorceller og pneumocytter i cytoplasmaet og plasmalemma på forskellige niveauer. Mens positiv kernefarvning kunne ses, blev FoxQ1 immunomærkning ikke observeret i stroma af disse væv. Høj FoxQ1 ekspression blev detekteret i 82/103 (50.49%) af NSCLC væv og var i 38 (20,39%) af de hosliggende matchede tumorvæv. Dataene viste statistisk signifikans ved hjælp χ

2 test analyse (χ

2 = 38,6450,

P

0,001). Og var i overensstemmelse med FoxQ1 mRNA-niveauer i NSCLCs

Positiv ekspression af E-cad og MUC1 blev lokaliseret til cellemembranen, og en kombination af plasmalemma og cytoplasma i NSCLC-tumorceller hhv. Positiv immunohistokemisk farvning for VIM og S100A4 i cancerceller blev observeret i cytoplasmaet, og en kombination af kernen og cytoplasmaet. En undtagelse til dette var de positive stromale fibroblaster.

Forholdet mellem udtryk for FoxQ1 proteiner og klinisk-patologiske parametre i NSCLC

De associationer mellem FoxQ1 udtryk og klinisk-patologiske træk af NSCLC er vist i tabel 1. FoxQ1 proteinekspression i adenocarcinom var højere end i planocellulært karcinom med statistisk signifikans (χ

2 = 10,7089,

P

= 0,005) ved χ

2 test analyse. I modsætning hertil blev der ikke signifikante associationer set med patientens alder, køn, tumor diameter, histologisk karakteren af ​​tumor, lymfeknude metastaser status, og scene gruppering med TNM.

Sammenhæng mellem udtryk for FoxQ1 og EMT-indikatoren proteiner

forholdet mellem udtryk for FoxQ1 og de fire EMT indikatoren proteiner blev beregnet og er blevet skitseret i tabel 2. Det blev bemærket, at epitel protein tab frekvenser i 103 NSCLC væv var 66,02% for E-cad og 18.45 % for MUC1. Unormale mesenchymal protein ekspressionsfrekvenser de samme prøver var 23,30% for VIM og 68,93% for S100A4. Resultatet viste også, at høj ekspression af FoxQ1 korreleret med et tab på E-cad-ekspression (χ

2 = 6,308,

P

= 0,012), og anomale positivitet af VIM (χ

2 = 1,396,

P

= 0,024) og S100A4 (χ

2 = 8,374,

P

= 0,004) i kliniske NSCLC prøver.

Survival analyse

Flere kendte prædiktive faktorer for dårligt resultat i NSCLC blev vurderet til at validere kohorte af patienter repræsenteret ved denne TMA (tabel 3). Høj udtryk for FoxQ1 protein (

P

= 0,023) og lav ekspression af E-cad protein (

P

= 0,002) viste en statistisk signifikant sammenhæng med fem års overlevelse ved Cox regression univariat analyse. Ud over disse to genetiske markører blev andre NSCLC kliniske prognostiske faktorer, såsom differentiering af tumoren og TNM fase inkluderet i en multivariat Cox regressionsmodellen. Vores data viste, at høj FoxQ1 udtryk (

P

= 0,047) og et tab af E-cad-ekspression (

P

= 0,021), blev bekræftet at være uafhængige prognosticators for lav overlevelse NSCLC.

Overlevelse blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Resultaterne identificeret, at patienter med en høj FoxQ1 ekspression eller tab af E-cad-ekspression havde en signifikant kortere overlevelsestid, sammenlignet med dem med lav eller konserveret ekspression, (fig. 3).

Diskussion

i denne undersøgelse ved hjælp af en TMA, vi understregede prognostiske værdi af FoxQ1 udtryk i NSCLC. Høj udtryk for FoxQ1 kunne påvises i TMA’er af tumorprøver og var signifikant korreleret med nedsat samlet overlevelse. Endvidere viste resultaterne, at FoxQ1 ekspression blev signifikant associeret med EMT i en undergruppe af patienter. Gennem multivariat analyse blev høj ekspression af FoxQ1 og reduceret E-cad udtryk vist sig at være uafhængige prognostiske biomarkører for dårlig samlet overlevelse. Så vidt vi ved, er dette den første rapport fra klinisk-patologisk betydning FoxQ1 Udtryk med relation til EMT i kliniske NSCLC vævsprøver.

For nylig, akkumulere tyder på, at den menneskelige FoxQ1 spiller en central rolle i reguleringen af ​​EMT af brystkræft [31], [32], og aggressivitet i tyktarmskræft [29], [32]. Der er betydelig bevis på, at tilstedeværelsen af ​​EMT fænomen indikerer korte overlevelse i lungekræft [11] – [14]. For at identificere forholdet mellem FoxQ1 og EMT i lungecarcinom blev fire hyppige indikator biomarkører undersøgt i lungekræft TMA hjælp IHC. Interessant nok viste vores resultater, at høje niveauer af ekspression for FoxQ1 proteinet korreleret med aftagende E-cad-proteinekspression, og stigninger i VIM og S100A4 proteinekspression.

Nogle forfattere har vist, at E-cad er forbundet med metastase af lungekræft [12]. VIM menes ikke at være forbundet med overlevelse i lungekræft [14], selv om S100A4 er blevet korreleret med prognose af lunge pladecellecarcinom [41] i kliniske forskningsundersøgelser. Vi bestemt også den prognostiske effekt af EMT markør udtryk ved univariate og multivariate analyse. Vores resultater viste, at den eneste markør forbundet med resultatet var E-cad.

Nylige undersøgelser har bekræftet, at FoxQ1 at være et værdifuldt prognostisk indikator for dårlig overlevelse i brystkræft [31], [32]. Imidlertid blev høj ekspression af FoxQ1 genet også observeret i lungekræft, mavekræft, og tyktarmskræft cellelinjer [29]. Således er vores foreliggende resultater bekræfter tidligere resultater vedrørende FoxQ1 udtryk i NSCLC, især i lunge adenocarcinom.

Selv om de nøjagtige mekanismer i FoxQ1 s tumorigene effekter i NSCLC ikke er blevet beskrevet fuldt ud i vores nuværende undersøgelse, den molekylære basis for associering mellem FoxQ1 og EMT er velkendte inden tumor. De opnåede fra vores data resultater er i overensstemmelse med dem, der præsenteres i det spirende litteratur, som havde erklæret, at undertrykkelsen af ​​FoxQ1 førte til en stigning i E-cad udtryk i menneskelig carcinom [31], [32]. Kollektivt, resultaterne i vores nuværende undersøgelse bekræftede, at FoxQ1 kunne potentielt bruges som en EMT markør i NSCLC.

Som konklusion har vi vist, at FoxQ1 var stærkt udtrykt i NSCLC og kunne bruges som en direkte prognosticator af et negativt resultat. Også vores resultater understøttes af, at FoxQ1 har en funktionel rolle med hensyn til EMT-relaterede gener i NSCLC.