PLoS ONE: PARP Hæmning sensibiliserer til lav Dose-Rate Radiation TMPRSS2-ERG Fusion Gene-udtrykkende og PTEN-Mangelfuld Prostata Cancer Cells

Abstrakte

Udsættelse for genotoksiske stoffer, såsom bestråling producerer DNA-skader, toksicitet, der er augmented når DNA-reparation er svækket. Poly (ADP-ribose) polymerase-inhibitorer (PARP) fandtes at være “

syntetisk dødelig

” i celler deficiente i BRCA1 og BRCA2 der forringer homolog rekombination. Men da mange tumorer, herunder prostatacancer (PSA) sjældent har på sådanne mutationer er der stor interesse for at finde alternative determinanter for PARP-inhibitor følsomhed. Vi evaluerede effektiviteten af ​​stråling i kombination med PARP-hæmmer, rucaparib i PCA celler. Kombinationen indekset for klonogene overlevelse efter stråling og rucaparib behandlinger viste synergistiske interaktioner i et panel af PCA cellelinier, er stærkest for LNCaP og VCap celler, som udtrykker ETS gen fusionsproteiner. Disse resultater korrelerede med synergistiske interaktioner for ældning aktivering, som indikeret ved β – galactosidase-farvning. Fravær af PTEN og tilstedeværelse af ETS gen fusion således lettet aktivering af degeneration, som bidrog til faldet klonogene overlevelse. Øget radiosensitivitet i tilstedeværelse af rucaparib var forbundet med vedvarende DNA pauser, som bestemt ved χ-H2AX, p53BP1, og RAD51 foci. VCap celler, som huser de

TMPRSS2-ERG

genfusion og PC3-celler, der stabilt udtrykker en lignende konstruktion (fusion III) viste forøget følsomhed overfor rucaparib, som igen, øget strålingen svar på et tilsvarende omfang som DNA-PKcs inhibitor NU7441. Rucaparib radiosensitized PCA-celler med en klar fordel ved lavdosis-rate stråling (LDR) administreret over en længere periode, der forårsagede forøget DNA-beskadigelse. LDR efterligner brachyterapi, som anvendes med succes i klinikken, var mest effektiv, når det kombineres med rucaparib ved at inducere vedvarende DNA-skader og senescens, hvilket fører til nedsat klonogene overlevelse. Denne kombination var mest effektive i overværelse af

TMPRSS2-ERG

i mangel af

PTEN

, hvilket indikerer klinisk potentiale for brachyterapi til patienter med mellemliggende og høj risiko PCa.

Henvisning: Chatterjee P, Choudhary GS, Sharma A, Singh K, Heston WD, Ciezki J, et al. (2013) PARP Hæmning sensibiliserer til lav Dose-Rate Radiation TMPRSS2-ERG Fusion Gene-Udtrykke og PTEN-Mangelfuld Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 8 (4): e60408. doi: 10,1371 /journal.pone.0060408

Redaktør: Philip J. Tofilon, National Cancer Institute, USA

Modtaget: 31 oktober 2012; Accepteret: 26 Februar 2013; Udgivet: 2 April, 2013

Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev primært støttet af Pfizer RDG, med yderligere støtte fra National Cancer Institute (CA127264 til AA) og United States Department of Defense ph.d.-Training Award (PC094405 til KS). Det blev også delvist understøttet af National Insitutes of Health tilskud P30 CA43703 for brug af Radiation Resources Core Facility, Case Western Reserve University og CASE Comprehensive Cancer Center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev primært støttet af Pfizer RDG. Stamopløsninger af rucaparib blev leveret af Pfizer. Forfatternes kolleger på Clovis Oncology forudsat forslag og vejledning. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest ofte diagnosticeret tumor hos mænd, der tegner alene for 29% af hændelsen sager [1]. Det er den anden mest almindelige dødsårsag på grund af cancer hos mænd efter lungekræft. Bestråling er en vigtig behandling modalitet til PCA, med et klinisk respons opnås på -85%. Det er primært brugt til tidlige fase sygdom, som adjuvans til kirurgi, og i kombination med kemo-terapi, der tillader dets anvendelse ved lavere doser, med højere effektivitet og med mindre cytotoksisk virkning til de tilstødende normale væv.

Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er repræsenteret af en familie af proteiner, som udtrykkes rigeligt, primært lokaliseret i kernen, og er involveret i mange vigtige cellulære processer, såsom respons på DNA beskadigelse, reparation, og når skaden er alvorlig, celledød via apoptose eller nekrose [2]. PARP-1 og -2 er kendt for at have en rolle i forskellige DNA reparationsmekanismer, såsom basen excision reparation, homolog rekombination (HR) [3], og ikke-homolog endesammenbinding (NHEJ) [4]. Efter detektering af DNA beskadigelse, ved hjælp af dets DNA-bindende domæne, aktiveret PARP-1 udløser poly-ADP-ribosylering af histoner og PARP-1 selv. Vigtigere, PARP-1 sikrer regulering af DNA-replikation gaffel progression af HR på beskadiget DNA [5]. PARP-1 er involveret hovedsagelig i reparation af enkeltstrengede brud, som, hvis ikke-udbedret omdannes til dobbeltstrengede brud (DSB’er) under DNA-replikation. PARP-inhibitorer (PARPi) repræsenterer en ny klasse af midler, der forhindrer syntesen af ​​poly-ADP ribose ved at berøre de efterfølgende DNA-reparationsprocesser, og som et resultat af DNA-skader fortsætter [2]. PARPi derfor kan fungere som et enkelt middel i HR-mangel tumorer (fx BRCA1 /2-defekt) gennem “

syntetisk letalitet

” [6]. Deaktivering NHEJ i HR-deficiente celler via DNA-PKcs inhibering kan vende effekten af ​​PARPi-medieret dødelighed [7]. Stråling inducerer PARP-aktivitet og dets inhibering forbedrer celledød og forbedrer tumorvækstforsinkelse i bestrålede lungekræft modeller [8]. Niveauer af PARP-1 er også steget i avanceret, kastrere resistente PCa [9], [10], derfor er dets anvendelse i kombination med strålebehandling at øge strålebehandling tiltalende.

“

syntetisk letalitet

“-konceptet har været effektiv i pattedyrceller i tumor-modeller med defekte BRCA1 eller BRCA2, der som en konsekvens har defekt HR [3] og er derfor modtagelige for brug af PARPi som monoterapi [11]. For tumorer, hvor sådanne mutationer er sjældne, såsom PCa, er der et presserende behov for at identificere yderligere DNA skader og reparation defekter, der kan give en “

syntetisk dødelig

” kombination med PARPi. Således at udvide brugen af ​​PARPi ud tumorer med defekte BRCA1 /2 er af stor interesse.

I slutningen af ​​fase PCa, bi-allele sletning af

PTEN

(Phosphatase og tensin homolog) gen er en fælles begivenhed, der er blevet foreslået at påvirke HR DNA-reparation. PTEN antagoniserer PI3K /AKT overlevelse pathway ved sin phospholipid 3-phosphataseaktivitet, som på sin side regulerer proliferation, migration og apoptose. Komplet tab af

PTEN

også stimulerer en stærk ældning respons, der fungerer som en ekstra mekanisme til tumor undertrykkelse. Ældning er blevet foreslået at fungere som en anti-tumor-mekanisme som reaktion på DNA-skade ved at inducere en irreversibel vækststandsning og begrænse den replikative levetid celler [12]. Svarende til BRCA1 /2-defekte tumorceller,

PTEN

-null PCA celler er blevet rapporteret til at være følsomme over for PARPi.

I denne undersøgelse undersøgte vi svar på en potent PARP-hæmmer, rucaparib alene eller i kombination med stråling i et panel af PCA cellelinier. Vores data understøtter effektiviteten af ​​rucaparib som en potent PARPi for strålingssensibiliserende PCA celler, mest effektivt, når det anvendes ved lave doser-satser i celler, der huser den

TMPRSS2-ERG

gen fusion eller er

PTEN

deficiente

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig PCa cellelinjer PC3, blev LNCaP, DU145, og VCAP fås fra ATCC (Manassas, VA).; C4-2 blev beskrevet tidligere [13]. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium, bortset DU145 (DMEM) og VCap (modificeret DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals), L-glutamin (Invitrogen), og 100 enheder /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen) i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Stamopløsninger af rucaparib, der leveres af Pfizer, blev foretaget i DMSO (Sigma Aldrich).

For transfektion blev celler podet ved -80% sammenløb i et antibiotikum-frie medier.

TMPRSS2-ERG

fusion III (den mest almindelige) isoform [14] generøst tilvejebragt af Dr. Michael Ittmann blev transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000, efterfulgt af selektion for neomycin modstand med 1 mg /ml G418 (Invitrogen). Effektiviteten af ​​transfektion blev bekræftet ved Western blotting (fig. S1A).

Stråling Behandling

Ioniserende stråling blev leveret med en konventionel cæsium-137 χ-strålerøret (JL Shepherd Associates, San Fernando, CA), ved en dosis på 146 cGy /min [15]. Dosis-rate eksperimenter blev udført ved at ændre placeringen af ​​pladerne eller ved hjælp af et dæmpningsled. En Ir-192 kilde til stråling, der udsender beta-partikler, ansat en custom-fabrikeret celle bestråler, med design af enheden som beskrevet [16].

Analyser for Colony Dannelse og Ældning

i den kolonidannelse assayet blev 500 celler /60 mm skål (eller 750 celler /60 mm skål for LNCaP) udpladet dagen før behandling. Rucaparib blev indgivet ved de angivne doser kontinuerligt. To uger efter behandling med stråling eller /og rucaparib blev celler farvet med 0,1% krystalviolet, og cellekolonier med 50 celler blev scoret af en alfa-billedanalysator (Alpha Innotech Corp). Den senescens assay blev udført som beskrevet [17]. Efter seks eller tolv dage blev cellerne fikseret og procentdelen af ​​β-galactosidase-positive celler blev bestemt ved tælling ≥five forskellige felter (-70 celler /prøve).

Immunofluorescens

Celler blev udpladet på dækglas i 35 mm dyrkningsskåle. Efter behandling blev cellerne fikseret med 2,0% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur, vasket 3 × i 5 minutter med phosphatbufret saltvand (PBS), permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min, og blokeret i 3 % FBS i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 i 1 time. Dækglassene blev derpå immunfarvet ved anvendelse af antistoffer mod χ-H2AX (Millipore), 53BP1 (Abcam), eller RAD51 (Santa Cruz Biotechnology) efterfulgt af en fluorescens-konjugeret (Invitrogen) sekundært antistof, som beskrevet [17]. Kvantificering var baseret på data observeret fra ≥70 celler.

Statistiske Analyser

For synergi analyse, celler blev behandlet med rucaparib og bestråling, alene eller i kombinationer i et forhold svarende forholdet mellem deres median -Effekt doser, hvor hver dosis i hvert forsøg udpladet i tredobbeltbestemmelse og hvert eksperiment udført tre gange. Samspillet mellem de to behandlinger i klonogene celle overlevelse og senescens assays blev derefter bestemt baseret på den isobolografiske metode til Chou og Talalay, som tidligere beskrevet [18], [19]. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af to-vejs ANOVA og den statistiske signifikans er tildelt for p. 0,05

Western Blot Analyser

Celler blev lyseret og underkastet immunoblotting som beskrevet [17], [ ,,,0],20] og undersøgt med antistoffer mod V5 tag (Thermo Scientific), at detektere

TMPRSS2-ERG

fusion III genet og β-actin (Sigma Aldrich) som en belastning kontrol.

Resultater

Øget følsomhed af PCA Cell Lines til Radiation når Kombineret med Rucaparib

Ioniserende stråling og DNA-skadelige stoffer betydeligt inducerer PARP-1 og niveauer af PARP er højere i tumorer [9], [10 ] derfor PARPi kunne anvendes til at sensibilisere til DNA-skadelige kemo- eller radioterapi. Klinisk succes PARPi på en kohorte af patienter [21], der omfattede nogle med PCa bedt vores interesse i at udforske den potentielle anvendelse af rucaparib (CO-338, tidligere kendt som AG014699 og PF-01.367.338) som en strålingssensibilisator. Rucaparib, den første PARPi der er blevet udviklet [22], [23], og er i øjeblikket afprøvet i kliniske forsøg har ikke været –previously anvendes til PCA-celler. Undersøgelse sin langsigtede effekt på celle overlevelse angivet en dosis respons for stråling og rucaparib for forskellige PCA-celler (Fig. 1A). VCAP og LNCaP (rucaparib koncentration: 0,25, 0,5, og 0,75 uM) viste maksimal følsomhed over for rucaparib, efterfulgt af PC3 og c4-2 celler. I kombination med 1,5 Gy χ-bestråling, LNCaP-celler udviste den højeste følsomhed til så lavt som 0,75 uM rucaparib (fig. 1B). Synergy beregninger isobologram analyse (se materialer og metoder) blev udført for de fire doser af stråling, der spænder 1-5 Gy i kombination med rucaparib (koncentrationsområde fra 0,6 til 3,12 uM). For PC3, en koncentration af rucaparib så lav som 1,25 uM viste et signifikant fald i antallet af kolonier med en potent strålingssensibilisering effekt. DU145 celler var mindst lydhøre over for stråling og rucaparib, alene og i kombination med en begrænset effekt kun opnås ved de højeste doser. VCap celler imidlertid mens de viste en lignende reaktion for stråling som DU145, til kombination med rucaparib udviste en synergistisk vekselvirkning (fig. 1B og fig. S2A). Kombinationsindekset afslørede den stærkeste synergi (CI 0,2) i LNCaP-celler efter kombinationen stråling og rucaparib, med doser af stråling så lave som 0,5 Gy og 0,25 uM rucaparib bliver effektiv. PC3-celler udviste en moderat synergi (Cl = 0,7) efter 4 Gy stråling og 2,5 uM rucaparib, hvorimod c4-2 celler viste en additiv virkning (Cl = 0,9) (fig. 1B og fig. S2).

A, Stråling og rucaparib dosis-respons i PC3, c4-2, DU145, VCAP og LNCaP celler blev etableret af klonogene celle overlevelse assays. Venstre paneler angiver reaktion på stråling, dem på retten til at rucaparib. B, synergistiske virkning af kombinationen af ​​stråling og rucaparib på klonogene overlevelse i LNCaP, PC3, c4-2 og VCAP celler, hvor CI 1 repræsenterer synergi og CI 1 en antagonistisk interaktion mellem de to behandlinger. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

Rucaparib og Stråling Fremkald Ældning i PTEN-mangel og TMPRSS2-ERG Fusion-udtrykkende celler

Ældning er kendt for at repræsentere en vigtig reaktion på både stråling og PARPi at virkninger på celledeling og i sidste ende klonogene overlevelse. De behandlede celler viste karakteristiske markører for ældning efter seks dage. Disse omfattede fladtrykt cellemorfologi med akkumuleringen af ​​SA-β-galactosidase-positive celler (Fig. S3A).

PTEN

null PC3, LNCaP, og c4-2 cellelinjer viste en stråling og PARPi dosisafhængig stigning i SA-β-galactosidase-positive celler til behandling enten med stråling eller rucaparib (fig. 2A og 2B) . LNCaP havde det højeste antal senescentceller efter enten enkelt middel eller kombinationsbehandlingen. I modsætning hertil DU145 celler, som har en vildtype

PTEN

allel viste næsten ingen aldrende celler selv ved de højeste anvendte doser. Kombinationen indeks for senescens SA-β-galactosidase-farvning indikerede en moderat-stærk synergi (CI = 0,5-0,7) i PC3, LNCaP, og c4-2 celler (Fig. 2C og fig. S2). De senescens karakteristika blev opretholdt frem til mindst tolv dage, med en svag stigning i antallet af β-galactosidase-positive celler (fig. 2D og fig. S3B). Disse data indikerer, at senescens bidrager til nedsat overlevelse af

PTEN

deficiente celler, og at omfanget af senescens korrelerer med klonogene overlevelse.

Procentdel af β- galactosidasepositive celler blev bestemt efter stråling (A ) og rucaparib (B), behandling i

PTEN

deficiente LNCaP, c4-2, og PC3 celler. Procentdelen af ​​β-galactosidase-positive celler blev bestemt ved tælling ≥five forskellige felter (-70 celler /prøve). C, Synergy analyser for degeneration i LNCaP, PC3, og c4-2 celler til kombinationsbehandlingen. Se fig. S2 og 3 for β-galactosidase-farvning og yderligere synergi analyser. D, blev bestemt Procentdel af β-galactosidase positive c4-2 celler efter 12 dages behandling med stråling ± rucaparib. E, forældre- og

TMPRSS2-ERG

fusion gen-udtrykkende PC3 celler blev kvantificeret for SA-β-galactosidase farvning efter 6 dage efter 4 Gy stråling, 2,5 uM rucaparib, og DNA-PKcs korrosionsinhibitor NU7441 (500 nM ), alene eller i kombination. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

VCAP celler, som huser den

TMPRSS2-ERG

fusion gen, erhvervede aldrende celler efter stråling og PARPi (fig. S4 ). Disse celler er afhængige af fusionsgenet, derfor undersøge senescens efter knock-down af

TMPRSS2-ERG

var ikke informative. Derfor brugte vi PC3 celler, der udtrykker samme isoform,

TMPRSS2-ERG fusion III

til yderligere ældning eksperimenter. PC3 celler, der udtrykker

TMPRSS2-ERG

havde et øget antal SA-β-galactosidase-positive celler efter bestråling (fig. S4). Virkningen af ​​

TMPRSS2-ERG

ekspression var sammenlignelig med det, der blev opnået i PC3-celler bestrålet i nærvær af DNA-PKcs korrosionsinhibitor NU7441 (p = 0,0002), mens NU7441 alene ikke inducerede senescens i enten cellelinie . Rucaparib behandling i kombination med strålebehandling signifikant (p 0,0001) øgede antallet af senescentceller i

TMPRSS2-ERG

udtrykkende PC3-celler, som igen korrelerede med PC3 celler behandlet med stråling, rucaparib, og NU7441, (p = 0,0009) (fig. 2E). NU7441 behandling inducerede ikke ældning i PC3 celler, der udtrykker den

TMPRSS2-ERG

fusion efter stråling, alene eller i kombination med rucaparib. Disse data indikerer, at DNA-PKcs aktivitet er kritisk for ældning som angivet ved det øgede antal senescentceller i

TMPRSS2-ERG

udtrykkende celler eller når DNA-PKcs inhiberes.

Rucaparib Øger Vedholdende Stråling-induceret DNA Damage Foci

Vi undersøgte næste, om effektiviteten af ​​behandlingerne var relateret til deres evne til at fremkalde DNA-skader. χH2AX og p53BP1 etableres surrogater til måling ioniserende stråling fremkaldt foci (IRIF) [24]. Bestråling genereret et øget antal χH2AX foci ved 3 og 6 timer, som blev stærkt formindsket ved 24 timer, hvilket indikerer reparation af DNA-skade (fig. 3A). I modsætning hertil, når cellerne blev bestrålet i nærvær af rucaparib, χH2AX foci varet ved 24 timer. Desuden foci for p53BP1, en anden etableret markør for DSBs, var mere fremtrædende efter 24 timer efter bestråling, med den kombinerede behandling med rucaparib resulterer i et forøget antal af foci (fig. 3B). RAD51 er et centralt element i HR; dens udtryk var ikke påvirket af

PTEN

status, i overensstemmelse med en nylig rapport [25]. Alligevel er kombinationen af ​​rucaparib og stråling viste vedvarende RAD51 foci ved 24 timer (fig. 3C), hvilket indikerer, at kombinationen er mere effektiv til at påføre vedvarende DNA-skader i de behandlede celler.

χH2AX (A) og 53BP1 (B) foci blev bestemt ved immunofluoresecence mikroskopi ved 24 timer efter kombineret behandling med stråling og rucaparib i PC3 og LNCaP-celler (venstre panel), med tidsafhængige kinetik vist (højre panel). C, RAD51 foci blev visualiseret og kvantificeret i PC3-celler på samme måde efter 24 timers behandling. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

LDR fører til øget DNA Skader og til nedsat Cell Survival

Stråling administreres i klinikken enten som ekstern stråle strålebehandling (EBRT ) eller brachyterapi. Stråling til behandling af PCa ved brachyterapi anvender typisk dosering på 70 cGy /h sammenlignet med 200-300 cGy /min, der almindeligvis anvendes til EBRT til

in vitro Salg stråling studier af humane cancercellelinier med konventionelle strålegivere. For at undersøge effektiviteten af ​​lavere doser-rates blev c4-2 og PC3-celler eksponeret for dosishastigheder på 56 til 690 cGy /min, for at opnå en total dosis på 5Gy. Jo længere eksponeringstid direkte korreleret med mere omfattende DNA-skader, hvilket resulterer i færre kolonier (fig. 4A) og mere χH2AX og 53BP1 foci (fig. 5A og 6A). Den laveste dosis sats (56 cGy /min) øgede antallet af χH2AX foci signifikant (p 0,0002) sammenlignet med den konventionelle dosishastighed (146 cGy /min). Tilsætning af rucaparib signifikant (p 0,0001) induceret DNA-skader som målt ved et øget antal χH2AX foci (fig 5B.). Endvidere var der signifikant (P 0,0001) steg antallet af p53BP1 foci efter kombinationsbehandlingen (Fig 6B.). Den laveste dosis på stråling (56 cGy /min) inducerede signifikant mere 53BP1 IRIF (p = 0,004 0,0007 for c4-2 og PC3 celler) sammenlignet med dosishastigheden højeste (690 cGy /min)

A blev Klonogene overlevelse analyser udført for PC3 (venstre panel) og c4-2 celler (højre panel) ved forskellige doser-satser ± 1,25 uM rucaparib. B, c4-2 celler blev udsat for forskellige doser af stråling fra en Ir-192 kilde ± 2,5 uM rucaparib. En total dosis på 5 Gy (venstre panel) og 10 Gy (højre panel) blev leveret stråling; derfor eksponeringstiden afveg for de forskellige doser-kurser, der anvendes. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

A, Konfokal immunfarvning for χH2AX foci, enumarated i PC3 og c4-2 celler efter stråling ved de angivne doser. B, Kvantificering af dosisafhængig dannelse af γH2AX foci. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

A, konfokal immunfarvning af 53BP1 foci i PC3 og c4-2 celler efter stråling ved de angivne doser. B, Grafisk fremstilling af dosisafhængig 53BP1 IRIF generation. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3).

Lignende forsøg blev udført med en LR-192 strålekilde (fast total dosis på 5 og 10 Gy) ± rucaparib. De celler, som modtog den laveste dosis-rate (4,34 cGy /h), leveret i den længste periode, dannede færre kolonier i forhold til dem, der udsættes for moderat til højere doser (26,8 cGy /h) af stråling (fig. 4B). Rucaparib stærkt reduceret kolonidannelse selv ved den højeste LDR testede dosis (26,8 cGy /h), som krævede -18 h for at opnå 5 Gy.

PARP Hæmning radiosensibiliserer TMPRSS2-ERG Fusion Gene-udtrykkende celler i et omfang Lignende til DNA-PKcs Hæmning i Forældrekontrol Celler

fusion mellem

TMPRSS2

, en androgen-reguleret onkogen, og en ETS transskription faktor østrogen-regulerede gen, ERG genereret af en interstitiel sletning på kromosom 21 eller ved gensidig translokation er til stede i -50% af tidligt stadium PCa [26]. VCAP celler, der udtrykker

TMPRSS2-ERG

endogent blev radiosensitized ved rucaparib (Fig. 1B og fig. S2A). Disse celler er afhængige af

TMPRSS2-ERG

som de stopper prolifererende når det er afladet ved siRNA (data ikke vist). Derfor blev PC3-celler transficeret med

TMPRSS2-ERG

fusion III isoform, den mest almindelige PCa fusionsgenet. Dens stabil ekspression ikke havde en signifikant effekt på radiosensitivitet, estimeret ved klonogene overlevelse assays (fig. S1B) og af χH2AX og 53BP1 foci. Men når det blev administreret sammen med rucaparib, antallet af kolonier blev reduceret signifikant (p = 0,0105) (fig. 7B). Denne effekt var sammenlignelig med, hvad der blev opnået i PC3 celler behandlet med DNA-PKcs inhibitor NU7441. Den rucaparib Kombinationen yderligere radiosensitized disse celler (p = 0,0005), i et omfang, der kan sammenlignes med celler, der udtrykker

TMPRSS2-ERG

fusion gen behandlet med rucaparib (fig. 7A). Et øget antal 53BP1 og χH2AX foci var synlige, selv ved den laveste dosering, hvilket yderligere understreger, at rucaparib er en potent strålingssensibiliserende for PCA celler, der huser en fusion gen (fig. 7C).

A, Klonogen overlevelse assay i PC3 celler efter 4 Gy stråling ± 2,5 uM rucaparib og DNA-PKC’er korrosionsinhibitor NU7441 (500 nM, venstre panel). B, Klonogene overlevelse analyser i PC3 celler og derivater, der udtrykker TMPRSS2-ERG fusion III ved forskellige doser-satser ± 2,5 uM rucaparib. C, Immunfarvning for χH2AX og 53BP1 i PC3-celler, der udtrykker fusionsgenet efter strålebehandling ± rucaparib behandling i 24 timer. Fejl søjler repræsenterer SD af middelværdien (n = 3)

Diskussion

Rucaparib (CO-338, tidligere kendt som AG014699 og PF-01.367.338)., En PARPi repræsenterer en ny klasse af agenter med dokumenteret antitumor aktivitet mod humane cellelinjer og xenografter indeholder muteret eller epigenetisk tavshed BRCA1 /2 [4], [27]. Tidligere arbejde har påvist, at PARP-1 interagerer med TRMPRSS2-ERG, således tilvejebringer en mekanistisk rationale for anvendelse af PARPi i ETS genfusion-positive PCa [3]. Her viser vi for første gang dens effektivitet som en strålingssensibiliserende middel i et panel af PCA cellelinjer, med maksimal synergi opnås med lavdosis-rate (LDR) frem for konventionel dosis stråling. LDR anvendte doser her efterligne de ansatte i klinisk praksis for PCa brachythrepay [28]. Vi mener, at denne konstatering er vigtig, da brachyterapi er mere effektiv end EBRT for PCa behandling, og det kan anvende molekylære mekanismer, der fremmer forbedret kræftcelle radiosensitivitet, i vores undersøgelse gennem øget ældning. Faktisk kemisk inhibering af PARP-1-aktivitet induceret markant strålingssensibilisering af flere eksponentielt voksende tumorcellelinier i 5-30 cGy dosisområde. LDR radiosensibilisering af aktivt dividere tumorceller ved PARPi tyder på, at de kan have en rolle i at forbedre effektiviteten af ​​ultra-fraktionerede eller LDR regimer [29]. Vores undersøgelser viser, at rucaparib er en meget potent PARPi, synergizes med kliniske doser af stråling opnået under brachyterapi. Dets anvendelse som en rediosensitizer er effektivt selv når dosis stråling er stærkt reduceret, en situation opleves som det radioaktive “frø” henfald under omfattende gang de anvendes i PCA patienter.

Rucaparib, den første PARPi der var udviklet og afprøvet i klinikken (i 2003 under navnet AG014699) [22], [23], er også blevet vist at være effektiv i tumorxenotransplantater af bryst-, lunge-, tyktarms-, colorektal og pancreascancer [27], [30 ]. Samtidig har det vist sig at være ikke-toksiske i mus, som bar mindst en funktionel kopi af BRCA2 genet. Vores undersøgelse er den første nogensinde gennemført for rucaparib i PSA. Mens vi ikke har forfulgt lignende xenografundersøgelser, baseret på de ovennævnte rapporter med forskellige tumortyper, alle tyder på, at disse resultater vil blive oversat til PCa xenograftmodeller.

Rucaparib er blevet undersøgt i kombination med forskellige kemoterapeutiske midler. Det viste sig at være effektiv i kombination med platin i bryst- og æggestokkræft xenograftmodeller [27], [31]. Vores undersøgelse er den første til at undersøge dens effektivitet i kombination med strålebehandling. Andre PARPi, i kombination med bestråling, blev rapporteret at forårsage betydelig tumorvækst forsinkelse i lungekræft

in vivo

modeller [8], og at være effektive radiosensibilisatorer i både lunge og PCa cellelinjer [32]. Sensibilisering for stråling og alkylerende midler blev forstærket i DSB reparation-mangelfulde celler [33], i overensstemmelse med den bemærkelsesværdige følsomhed over for PARP hæmning af BRCA-1 og BRCA-2-mangelfulde tumorceller [6]. ABT-888 (veliparib) PARPi blev for nylig vist at forøge reaktionen af ​​PCA-celler og tumorer til bestråling i DU145 og PC3-celler [34]. Kombinere ABT-888 med 6 Gy resulterede i forsinket tumor genvækst sammenlignet med enten alene agent kun PC3 xenotransplantattumorer, mens DU145 tumorer fortsatte med at vokse. Svarende til vores studier, PC3 men ikke DU145-celler og tumorer blev vist at indeholde rigelige aldrende celler udviser vedvarende DNA skader foci [34]. Vi viser, at rucaparib er effektiv i ekstra

PTEN

deficiente celler, herunder dem, der huser ETS genfusioner. Det er klart, kan effekten af ​​PARPi afhænge af en kompetent senescens reaktion på akkumuleret DNA-skade, såsom når

PTEN

er mangelfuld, eller når

TMPRSS2-ERG

udtrykkes. En nylig undersøgelse har fundet, at rucaparib radiozensitization kan være også NF-KB afhængig [35]. I denne undersøgelse viser vi, at

TMPRSS2-ERG

, foruden

PTEN

mangel, kan sensibilisere til PARPi, som synergistisk med strålebehandling.

Da mutationer i BRCA1 /2 at give en “

syntetisk letalitet

” forhold med PARPi er sjældne i PCa, er der betydelig interesse i at definere andre molekylære markører for PARPi følsomhed. Faktisk sensibilisering til PARPi har for nylig vist sig at blive forøget ved at blokere DNA-skader signalering gennem ATM /Chk2 [36], [37] og MRN-komplekset gennem Mre11 [38]. I modsætning hertil blokerer NHEJ DNA reparation gennem p53BP1 [39], kan faktisk modvirke den udsøgte følsomhed over for PARPi forårsaget af BRCA1 mangel [40]. På den anden side, udtryk for p53 i vores PCa celle panel og en nylig rapport [39] ikke gøre en forskel, da både p53 null (PC3) eller p53 dygtige (LNCaP, c4-2) celler reagerede så godt på PARPi som en strålingssensibilisator. Svaret var temmelig afhænger primært af en kompetent senescent respons, der var fraværende i DU145 celler, der har en funktionel

PTEN

allel og en trunkeret, ikke-funktionel retinoblastoma tumor suppressor [41].

ETS genfusioner findes i størstedelen af ​​PCA tilfælde [26]. Ekspressionen af ​​fusionsgenet er ansvarlig for celleproliferation i PCA celler, som udtrykker

TMPRSS2-ERG

[42]. Mus prostata blottet for

PTEN

display forbedret tumor tilblivelse i overværelse af overudtrykte ERG [43]. En nylig rapport vist, at fusion genekspression ændrer radio- og kemo-følsomhed, når røntgenstråling administreres i kombination med paclitaxel [44]. Svarende til BRCA1 /2-mangel, inhibitorer af PARP-1 øge omfanget af DNA-skader oprindeligt fremmes ved overekspression af fusionsgener [3]. Derfor prostatatumorceller huser ETS-fusioner, såsom

TMPRSS2-ERG

er mere udsat for robust respons på PARPi, alene på i kombination med LDR. En anden undersøgelse har imidlertid fundet, at

PTEN

deletion i PCA-celler kan ikke nødvendigvis forbinder med tab af RAD51 funktion [25], med følsomhed over for en anden PARPi er forbundet i stedet med en defekt i MRE11 ekspression. Vi opdagede, at DNA-PKcs inhibering med

TMPRSS2-ERG (data ikke vist)

har en kritisk rolle for ældning aktivering. Bemærkelsesværdigt, har DNA-PKcs udtryk for nylig blevet vist at forudsige respons på strålebehandling i PCa [45].

Ud over sin rolle i DNA skader og reparation, en transskriptionel rolle er også blevet tilskrevet PARP-1 [3], senest indikerer, at det er nødvendigt for androgen receptor funktion, især i kastrationsresistent modeller af PCa [46].