PLoS ONE: GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin Pathway ofte anvendes Cancer Invasion aktiveres af VEGFR2 at fremme Angiogenesis

Abstrakt

angiogenese og kræft invasiv høj grad bidrage til kræft malignitet

Arf6. og dets effektor, AMAP1, ofte overudtrykt i brystkræft, og udgør en central pathway at inducere invasion og metastase. I denne vej, er Arf6 aktiveres af EGFR via GEP100. Arf6 udtrykkes kraftigt også i humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) og er impliceret i angiogenese. Her fandt vi, at HUVEC’er også stærkt udtrykkelig AMAP1, og at vaskulær endotelvækstfaktor-receptor-2 (VEGFR2) rekrutterer GEP100 at aktivere Arf6. AMAP1 funktioner ved binding til cortactin i cancer invasion og metastase. Vi viser, at samme GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej er afgørende for angiogenese, herunder celle migration og rørformet formation, samt til forbedring af celle permeabilitet og VE-cadherin endocytose af VEGF-stimuleret HUVEC’er. Komponenter af denne tilgang, er stærkt udtrykt i patologisk angiogenese, og blokering af denne vej effektivt inhiberer VEGF eller tumor-induceret angiogenese og choroideaneovaskularisering. Den GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej, aktiveret af receptortyrosinkinaser, synes at være almindelig i angiogenese og cancer invasion og metastase, og giver deres nye terapeutiske mål

Henvisning:. Hashimoto A, Hashimoto S, Ando R, Noda K, Ogawa E, Kotani H, et al. (2011) GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin Pathway ofte anvendes Cancer Invasion aktiveres af VEGFR2 at fremme angiogenese. PLoS ONE 6 (8): e23359. doi: 10,1371 /journal.pone.0023359

Redaktør: Toru Ouchi, University of Chicago, USA

Modtaget dateret 25. april 2011; Accepteret: 13 juli 2011; Udgivet: 15 August, 2011

Copyright: © 2011 Hashimoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-støtte fra Ministeriet for Undervisning, Videnskab, sport og kultur i Japan (MESSC), den Takeda Science Foundation, og Mitsubishi Foundation. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

vaskulær endotel vækstfaktorer (VEGF’erne) er vigtige faktorer involveret i angiogenese [1] – [4]. Et familiemedlem af VEGF’erne, nemlig VEGF-A, blev oprindelig opdaget som en vaskulær permeabilitet faktor [5]; og den primære funktion af VEGF-signalering involverer forøgelse af endothelial-celle permeabilitet og vaskulær lækage [6]. En lille GTPase, Arf6, er blevet impliceret i VEGF-signalering og angiogenese. Det er blevet vist at ekspression af en dominant negativ form af Arf6, Arf6 (T27N), i humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) inhiberer vaskulær endotel vækstfaktor receptor-2 (VEGFR2) -medierede intracellulær signalering, såsom Rac1 aktivering [ ,,,0],7]. Konsekvent, undertrykkelse af Arf6 aktivitet via Slit2-Robo4 pathway blokerer angiogenese og fremmer vaskulær stabilitet [8]. Men den mekanisme for, hvordan VEGFR2 regulerer Arf6 aktivitet, samt de mekanismer, som Arf6 funktioner i angiogenese, og også i andre aspekter af VEGF-signalering, stadig stort set forbliver undvigende.

En lille GTPase, Arf6, primært regulerer genanvendelse af plasmamembran-komponenter og spiller pleiotrope roller, herunder membran fremspring og remodellering [9], [10]. Vi har tidligere vist, at forskellige brystcancerceller overeksprimerer både Arf6 og dets effektor, AMAP1; og at overudtrykte Arf6 og AMAP1 udgør derefter en robust signalering akse for at fremkalde invasion og metastase [11] – [15]. I invasion og metastase, GEP100, en guanin nukleotid veksler for ARF GTPaser, er hovedansvarlig for Arf6 aktivering, og denne aktivering kræver foreningen af ​​GEP100 med ligand-aktiverede epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) [15]. Patologiske undersøgelser afslørede, at komponenter i denne vej er højt udtrykt i 40-80% af de primære tumorer i humane bryst- [12], [15]. AMAP1 funktioner ved binding til cortactin i cancer invasion og metastase. Blokering af GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej af siRNA’er eller inhibitorer effektivt blokerer brystkræft invasion og metastase [11] – [13], [15]. Læs-outs af denne Arf6 pathway omfatter afbrydelse af E-cadherin-baserede celle-celle sammenvoksninger [15], ved at inducere E-cadherin endocytose (vores upublicerede resultater).

Protein udtryk for Arf6 markant forøget i HUVEC’er når dyrket med VEGF, og i en mus bagben iskæmi model, hvor angiogenese afhænger primært VEGF [7], [16]. Her fandt vi, at HUVEC’er også meget hurtig AMAP1, sammenlignes med niveauet i særdeles invasive brystkræftceller. Vi fandt også, at GEP100 fysisk forbinder med ligand-aktiverede VEGFR2 at aktivere Arf6, og at Arf6 derefter rekrutterer AMAP1. Som kræft invasion og metastase, AMAP1 funktioner ved at binde til cortactin i angiogenese. Denne GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin pathway er væsentligt ikke kun for VEGF-induceret endotelcellemigration og rørformede formation, men også for VEGF-induceret forøgelse af VE-cadherin endocytose og cellepermeabilitet. Komponenter af denne vej er højt udtrykt i CD31-positive fartøjer med patologisk angiogenese, og blokering af denne vej effektivt hæmmer patologisk angiogenese. Vores resultater viser, at GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej, aktiveres af vækstfaktor receptor tyrosinkinaser, er almindelig i angiogenese og invasion og metastase af visse brystkræftceller, og dermed giver nye terapeutiske mål for humane sygdomme karakteriseret ved hyper-angiogenese og ondartet kræft udvikling

Materialer og metoder

Celler

HUVEC’er blev købt fra Iwaki og dyrket i endotel vækst på mellemlang 2 (EGM2, Lonza)., i henhold til producentens instruktion. Bemærk, at EGM2 indeholder en lav koncentration af VEGF, en koncentration, der ikke er åben for offentligheden. MDA-MB-231 og MCF7-celler, opnået fra American Type Culture Collection, blev dyrket som tidligere [15] beskrevne. Cos-7-celler blev dyrket i DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS, Hyclone).

Angiogenese

Kvantificering af angiogene responser blev udført af den rettede

in vivo

angiogenese-assay (DIVAA, Trevigen), ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 20 pi VEGF (500 ng ml

-1) eller MDA-MB-231-celler (5 x 10

6 ml

-1) blev injiceret i angioreactor rør, som blev fyldt med basalmembran ekstrakter; og rørene blev derefter implanteret subkutant i den dorsale områder af nøgne mus. Ni dage senere rørene blev opsamlet, og mængderne af Isolectin B4 akkumuleret inden basalmembranen ekstrakter blev målt ved anvendelse af en multiplate fluorescerende læser (ARVO, Perkin Elmer), efter proteolytisk fordøjelse af basalmembranen. For siRNA behandling blev RNA-duplexer blandet med AteloGene (Koken), ifølge producentens instruktioner; og 200 pi af blandingen blev injiceret i de nederste sider af angioreactor rør implanteret i mus, på dag 0 og dag 4. P4-TAT peptidet og kontrol SC-peptidet blev tilsat ind i angioreactor rør før implantation. Disse undersøgelser blev udført ved Osaka Bioscience Institute, og de protokoller, der anvendes til dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af udvalget Animal Research Osaka Bioscience Institute (Permit nummer: 07-103).

Laser-induceret CNV

CNV blev udført som beskrevet tidligere [17], [18]. En dag før laser administration, 5 mg kg

-1 P4-TAT eller SC peptid blev injiceret intraperitonealt i 2 måneder gammel mand C57BL /6 mus (CLEA Japan). Den næste dag musene blev bedøvet med pentobarbital (0,05 mg g

-1 kropsvægt) og deres elever dilaterede med 0,5% phenylephrin og 0,5% tropicamid (Santen). CNV blev induceret med en 532 nm laser (Lumenis Novus Spectra). Fire laser pletter (200 MW, 75 um pletstørrelse, 100 msek) blev anbragt i hvert øje ved anvendelse af en spaltelampe leveringssystem og et dækglas som en kontaktlinse. Produktion af en boble på tidspunktet for laserbehandling, hvilket indikerer brud på Bruch membran, er en vigtig faktor i at opnå CNV; derfor, forbrænder kun, hvor en boble blev produceret blev inkluderet i denne undersøgelse. Umiddelbart efter laserbehandling, 5 mg kg

-1 P4-TAT eller kontrol scrambled peptid blev injiceret intraperitonealt dagligt i 7 dage. På forsøgsdag 8 blev musene bedøvet, og perfunderet gennem den venstre ventrikel med 5 ml PBS efterfulgt af 2 ml 0,5% FITC-mærket dextran (Mr 2.000 kDa, Sigma) i 1% gelatine. Blev øjnene udskrællet og fikseret i 2% paraformaldehyd i 30 min. Den forreste segment og retina blev derefter fjernet fra øjestykket. Omkring 4 til 6 afslappende radiale indsnit blev foretaget, og de resterende nethindepigmentepitelet (RPE) -choroidal-scleral kompleks blev flatmounted med Vectashield Mounting Medium (Dako) og dækglas. Flatmounts blev undersøgt med et mikroskop (BIOREVO, Keyence) og billeder af hver CNV blev digitalt lagret. Øjne med blødende komplikationer såsom glaslegeme blødning eller subretinal blødning forårsaget af laser bestråling blev udelukket fra evalueringen. Den gennemsnitlige størrelse af CNV-læsioner blev derefter målt, og data er præsenteret som middelværdi ± S.E.M. med

n

som angivet. Forsøgene dyr blev udført i overensstemmelse med Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Forskning og Udvalget for Animal brug og pleje af Hokkaido University.

VE-cadherin endocytose

VE-cadherin endocytose blev analyseret ved VE-cadherin antistof-bindende fremgangsmåde, som beskrevet [19]. Kort fortalt HUVEC’er, udpladet med en konfluerende densitet, blev prestarved med EGM2 uden serum i 4 timer, og derefter inkubering med et monoklonalt antistof BV6 (10 mg ml

-1), som er imod det ekstracellulære domæne af VE-cadherin, ved 4 ° C i 1 time. Efter afvaskning det ubundne antistof ved skylning celler med iskold EGM2 blev cellerne derefter inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i nærvær eller fravær af VEGF (50 ng ml

-1). Celler blev derefter vasket med 25 mM glycin (pH 2,5) indeholdende 3% bovint serumalbumin i 15 minutter ved omgivelsestemperatur til fjernelse af overfladebundne antistoffer og fikseret i 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100, og udsat til mærkning af internaliserede BV6 molekyler ved anvendelse af et antistof mod muse IgG konjugeret med Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). For siRNA behandling blev celler præinkuberet med RNA-duplexer i 48 timer, før udpladning. For TAT-peptid behandling blev celler inkuberet med TAT peptider i 30 minutter ved 37 ° C mellem 4 timer sult og mærkning med BV6. Antallet af celler, der udviser mindst en gruppe på fem eller flere syrefast VE-cadherin-positive vesikel-lignende strukturer blev talt (n 300). Resultater udtrykkes som middelværdi ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg, og statisk analyse blev udført under anvendelse af ANOVA.

Andre fremgangsmåder

GST-GGA pulldown, immunpræcipitation, immunblotting, antistoffer og kemikalier, cDNA’er, siRNAs, transfektioner, rørformet formation, kemotaktisk Transwell migration, to dimensionelle celle migration aktivitet immunhistokemisk farvning, celle permeabilitet, immunfluorescerende mikroskopi, GST-PH binding, levedygtighed og RT-PCR er beskrevet i Støtte Materialer og metoder S1.

Resultater

VEGF aktiverer Arf6 via GEP100 i endotelceller

Selvom Arf6 aktivitet er impliceret i VEGF-signalering og angiogenese, er det endnu ikke vist, om VEGF aktiverer Arf6. Vi fandt, at stimulering af primær kultur af HUVEC’er af VEGF faktisk induceret aktivering af endogent Arf6 (figur 1A). Denne aktivering var forbigående, toppede på 1 min og faldt derefter, som observeret med andre små GTPaser [20]. HUVEC’er udtrykker overvejende VEGFR2 blandt VEGFR-familiemedlemmer. Tyrosinphosphorylering af VEGFR2 forekom inden for 1 min, toppede ved 3 min og faldt med 10 min efter stimulering (figur 1A).

A, Aktivering af Arf6 og tyrosinphosphorylering af VEGFR2 upon VEGF stimulering af HUVEC’er. B, nedfældning af GEP100 med VEGFR2 upon VEGF stimulering af HUVEC’er, analyseret ved anti-GEP100 immunpræcipitering (IP) og anti-VEGFR2 immunoblot. PI, præimmun serum. C-D, aktiviteter Arf6 (C), og Erk og Akt (D) i HUVEC’er transficeret med siRNA’er for GEP100 eller irrelevante sekvenser (IRR) efter VEGF stimulation. E, nedfældning af VEGFR2-V5 og dets tyrosinphosphoryleringssteder-deficiente mutanter (951F, 1175F og 1214F) med HA-GEP100 udtrykt i COS-7-celler, analyseret ved anti-HA (GEP100) immunpræcipitation og anti-V5 (VEGFR2) immunoblot. F, Aktivering af Arf6-HA ved VEGFR2-V5 eller dets mutanter (951F, 1175F og 1214F) upon VEGF stimulering i Cos-7 celler, hvor ikke-mærkede GEP100 cDNA blev samtidigt transfekteret. I A-F, 10 ng ml

-1 VEGF blev anvendt til stimulering i 1 min (+) eller i de angivne tidsrum, mens kontroller omfattede celler uden stimulering (0 min eller -). Arf6 aktiviteter blev vurderet af GST-GGA pulldown metode (A, C, F). Total, totale cellelysater (20 ug). I A-D, HUVEC’er blev dyrket i lav serum (0,5% FCS) medium i 16 timer før stimulering. Disse assays blev udført mindst to gange og repræsentative tal er vist.

Selvom signalveje nedstrøms for VEGFR2 er blevet grundigt undersøgt [21], ingen af ​​dem kunne fortolke mekanismer Arf6 aktivering. Desuden kan mere end en enkelt type GEF aktivere Arf6 [22], [23]. Vi derefter forsøgt at identificere GEF (r) hovedansvarlig for denne VEGF-induceret Arf6 aktivering. GEP100 binder til tyrosinphosphoryleret EGFR [15]. Vi testede, om GEP100 bindes også til tyrosinphosphoryleret VEGFR2, og fandt, at VEGFR2 er copræcipiteret med GEP100 i HUVEC’er endogent, når cellerne blev stimuleret af VEGF (figur 1B). Vi derefter slået ned GEP100 af siRNA metoden i HUVEC’er, og fandt at denne knockdown stort set afskaffet VEGF-induceret aktivering af Arf6 (figur 1C og figur S4). Disse resultater tyder på, at GEP100 er hovedansvarlig for VEGF-induceret aktivering af Arf6 i HUVEC’er.

VEGF-signalering er kendt for at aktivere Erk og Akt [21]. Silencing af GEP100 påvirker ikke aktiveringen af ​​Erk og Akt i HUVEC’er (Figur 1D). Disse resultater, sammen med resultaterne ovenfor beskrevne bekræfte specificiteten af ​​GEP100 i VEGF-signalering, og indikerer, at VEGF signalvejen, der aktiverer Arf6 er uafhængig af at aktivere Erk og Akt i HUVEC’er. Endvidere aktivering af Erk og Akt både forekomme 10 minutter efter VEGF-stimulering, som er meget langsommere end aktiveringen af ​​Arf6.

Mode GEP100 binding til ligand-aktiverede VEGFR2

Derefter undersøgte vi, den præcise mekanisme, hvorved ligand-aktiverede VEGFR2 beskæftiger GEP100. PH-domænet af GEP100 binder til visse phosphorylerede tyrosiner af EGFR [15]. Vi først undersøgt, om denne PH-domæne bindes også til phosphorylerede tyrosiner af VEGFR2. Til dette udtrykte vi V5-tagget VEGFR2 i COS-7 celler, og deres lysater blev trukket ned

in vitro

med PH-domænet af GEP100, fusioneret til glutathion

s

transferase (GST). Vi fandt, at GST-GEP100 PH-domæne trækker ned ligandaktiveret VEGFR2-V5, mens PH domæner af ARNO eller phospholipase Cδ ikke gør (figur S1). VEGFR2 har 6 store tyrosiner, phosphorylerede på VEGF stimulation: Tyr951, Tyr996, Tyr1054, Tyr1059, Tyr1175 og Tyr1214 [21] (se figur S2). Vi syntetiserede disse tyrosin peptider i deres phosphorylerede form, og fandt, at GST-GEP100 PH-domæne binder til den phosphorylerede Tyr951 peptidet, men ikke til de andre phosphorylerede peptider (figur S3). Desuden har GST-GEP100 PH-domænet ikke binde sig til den ikke-phosphorylerede Tyr951 peptid (figur S3). Vi bekræftede phosphorylering af Tyr951 upon VEGF-stimulering i HUVEC’er (fig S5).

Baseret på disse resultater, vi derefter genereres en mutant form af VEGFR2-V5, hvori Tyr951 blev ændret til phenylalanin (951F) og udtrykt det i Cos-7-celler sammen med hemagglutinin (HA) -mærket GEP100, og fandt at denne mutant ikke er copræcipiteret med HA-GEP100 (figur 1E). Som en kontrol, vi bekræftet, at vildtype VEGFR2-V5 er copræcipiterede med HA-GEP100 (figur 1E). Endvidere har mutationer af de andre tyrosiner, såsom Tyr1175 og Tyr1214, i phenylalanin (1175F og 1214F, henholdsvis) ikke påvirke samtidig udfældning (figur 1E). Vi udtrykte derefter VEGFR2-V5 eller dens mutanter sammen med Arf6-HA og GEP100 i COS7-celler, og målte aktiviteter af Arf6-HA ved anvendelse af GST-GGA pulldown metoden [24]. Vi fandt, at 951F mutant af VEGFR2-V5 ikke inducerer aktiveringen af ​​Arf6-HA reaktion på VEGF, mens 1175F og 1214F mutanter, samt vildtype VEGFR2-V5, inducerer Arf6-HA-aktivering (figur 1F). Disse resultater indikerer, at VEGFR2 fysisk associerer med GEP100 at aktivere Arf6 upon VEGF stimulation: en forening, som kræver bindingen af ​​phosphoryleret Tyr951 af VEGFR2 og PH-domænet af GEP100. Vi bekræftede også, at Tyr951-phosphorylerede form af VEGFR2 er copræcipiteret med GEP100 fra HUVEC’er endogent efter VEGF stimulation (figur S2).

Krav om Arf6 i VEGF-induceret rørformet dannelse og migration

Tubular (eller kapillær-lignende) netværksdannelse af HUVEC’er dyrket

in vitro

er en af ​​de kendetegnende processer nødvendige for angiogenese [1], [2]. For at undersøge inddragelsen af ​​Arf6 i VEGF-induceret angiogenese, vi derefter testet virkningerne af Arf6 siRNA. Knockdown af Arf6 væsentligt forringet VEGF-induceret rørformet formation, sammenlignet med kontroldyr irrelevante RNA-duplexer (IRR) (figur 2A og figur S4), uden at det påvirker cellelevedygtighed (figur 2B). VEGF-induceret celle vandrende aktivitet er en anden kendetegnende for angiogen aktivitet [25]. Arf6 siRNA behandling afskaffet VEGF-induceret trans-migreringsaktiviteter næsten helt, som blev vurderet ved hjælp af modificerede Boyden kamre [26] (se figur 2C). VEGF-induceret todimensionale aktiviteter migration, vurderet af sårheling analysen [27], blev også næsten fuldstændig blokeret af Arf6 siRNA behandling (figur 2D).

HUVEC’er, behandlet med siRNAs for Arf6 eller irrelevante sekvenser ( IRR), blev underkastet den rørformede netværksdannelse assay i nærvær af 10 ng ml

-1 VEGF (a), til en levedygtighed assay (B), og at en migration assay anvendelse af en modificeret Boyden kammer (C) eller ved anvendelse af en sårhelende assay (D) i nærvær og fravær af VEGF (10 ng ml

-1). I A og D, blev assays udført mere end to gange, og repræsentative tal er vist. I B, blev mere end 1 × 10

4 celler scoret i hver analyse. I C, er data præsenteret som antallet af celler observeret pr mikroskopisk felt (× 20), som transmigrated Boyden kammer filter. Seks felter blev talt i hvert assay. Fejl søjler viser middelværdi ± sem, n = 3. * p. 0,05

Høje niveauer af AMAP1 udtryk i HUVEC’er og inddragelse af GEP100 og AMAP1 i VEGF-induceret angiogene aktiviteter

AMAP1 er en downstream effektor for Arf6, og fungerer i kræft invasion og metastase [12]. De fleste maligne brystcancerceller med høje invasive aktiviteter unormalt overudtrykke både Arf6 og AMAP1 proteiner, mens weakly- eller ikke-invasiv brystcancer celler udtrykker kun marginale niveauer af disse to proteiner [11], [12]. HUVEC’er vides at udtrykke Arf6 på et højt niveau [7], som vi fandt næsten ækvivalent med den observeret med yderst invasive MDA-MB-231 brystcancerceller (figur 3A). HUVEC’er udtrykker også AMAP1 på et meget højt niveau, hvilket også kan sammenlignes med MDA-MB-231 celler (figur 3A).

A, Expression af Arf6 og AMAP1 proteiner i HUVEC’er og at sammenligne med dem i invasive ( MDA-MB-231) og ikke-invasive (MCF7) brystcancerceller, ved immunblotting 20 ug totale cellelysater ved anvendelse af antistoffer som angivet. β-actin blev anvendt som kontrol. B-E, HUVEC’er, behandlet med siRNAs for GEP100, AMAP1, cortactin eller irrelevante sekvenser (IRR), blev underkastet den rørformede formation assay (B), modificeret Boyden kammer assay (C), sårheling assay (D) eller cellelevedygtighed assay (E), som i figur 2. AMAP2 siRNAs blev inkluderet som en anden kontrol (B, E). Disse assays blev udført mindst to gange, og repræsentative tal er vist. Fejl søjler viser middelværdi ± S.E.M., n = 3. * p. 0,05

Vi undersøgte næste hvorvidt GEP100 og AMAP1 er involveret i VEGF-induceret angiogene aktiviteter

in vitro

. Knockdown af GEP100 og AMAP1 hver væsentligt påvirket VEGF-induceret rørformet formation, og næsten fuldstændigt blokerede VEGF-induceret celle migrerende aktiviteter (figur 3B-3D og figur S4), uden at påvirke cellernes levedygtighed (figur 3E). Som kontrol vi også slået ned AMAP2 [28] (se figur S4), en nær isoform af AMAP1, og ikke observere en hæmmende effekt på rørformede dannelse (figur 3B).

Krav om cortactin og dets association med AMAP1 i VEGF-induceret angiogene aktiviteter

AMAP1 funktioner ved at danne et kompleks med cortactin i invasive brystkræftceller [12], [13]. Vi fandt, at AMAP1 danner et kompleks med cortactin også i HUVEC’er, og dette kompleksdannelse væsentligt større, når cellerne blev dyrket med VEGF (figur 4A). Desuden cortactin siRNA’er effektivt hæmmede VEGF-induceret angiogene aktiviteter

in vitro

, uden at påvirke cellernes levedygtighed (figur 3B og 3E).

A, nedfældning af cortactin med AMAP1 i HUVEC’er dyrket i nærvær af 10 ng ml

-1 VEGF, analyseret ved anti-AMAP1 immunpræcipitering og anti-cortactin immunoblot, som angivet. PI, præimmun serum. B-D, HUVEC’er, dyrket i nærvær af P4-TAT (P4) eller et kodet celle permeabel peptid (SC) ved 10 uM (C, D, F) eller ved koncentrationer som angivet (B, E) i 1 forudgående h til analyse, blev underkastet den rørformede formation assay (B), modificeret Boyden kammer assay (C), sårheling assay (D) og celleviabilitetstest (E), som i figur 2, i nærvær af peptiderne. Copræcipitation af cortactin med AMAP1 i disse celler blev analyseret som ovenfor (F). Total, totale cellelysater (20 ug). Disse assays blev udført mindst to gange, og repræsentative tal er vist. Fejl søjler viser middelværdi ± sem, n = 3. * p. 0,05

Vi har tidligere designet en celle-gennemtrængelig peptid, nemlig P4-TAT, der blokerer AMAP1 og cortactin bindende, og dermed hæmmer kræft invasion og metastase [13]. P4-TAT, men ikke kontrollen krypteret TAT-peptid (SC), blokerede VEGF-induceret angiogene aktiviteter

in vitro

, ligesom rørformet formation og cellemigrering, på en dosis-afhængig måde, uden at påvirke cellernes levedygtighed ( Figur 4B-4E). Vi bekræftede, at P4-TAT, men ikke SC endogene blokerer binding af AMAP1 med cortactin i HUVEC’er (Figur 4F). Disse resultater indikerer, at AMAP1 funktioner via sin kompleksdannelse med cortactin i HUVEC’er, og dette kompleks dannelse er nødvendig for VEGF-induceret angiogene aktiviteter.

Inddragelse af Arf6 signalvejen i angiogenese

Vi derefter undersøgt, om GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej er involveret i patologisk angiogenese

in vivo

. For dette, vi først bekræftet, at CD31-positive patologiske skibe [16] er stærkt positiv for GEP100 og AMAP1 (figur 5A). Antistoffer mod Arf6 gælder for immunhistokemi var ikke tilgængelig. Vi derefter testet GEP100 siRNAs og P4-TAT. Til dette angioreactor rør [29], fyldt med VEGF eller MDA-MB-231-celler, blev implanteret i nøgne mus, og 9 dage senere mængderne af Isolectin B4 akkumuleret inden rørene blev målt. MDA-MB-231-celler er kendt for at producere flere angiogene faktorer [30]. Administration af GEP100 siRNAs, præ-blandet med AteloGene [31], i mus implanteret med disse angioreactors inhiberede deres angiogenese på en dosis-afhængig måde, mens et irrelevant RNA duplex ikke gjorde (figur 5B og 5D). P4-TAT, men ikke SC, inhiberede også denne angiogenese på en dosis-afhængig måde (figur 5C og 5E).

A, Immunhistokemi af granulationsvæv og arvæv sektioner ved anvendelse af de angivne antistoffer. Barer, 100 uM. B-E, Effekter af GEP100 siRNAs og P4-TAT (P4) på ​​angiogenese blev målt ved anvendelse angioreactors implanteret i nøgne mus, der indeholdt basalmembran ekstrakter og VEGF (500 ng ml

-1) eller MDA-MB-231-celler (1 × 10

5 celler); og mængder af Isolectin B4 akkumuleret inden basalmembranen ekstrakterne blev målt efter inkubation i 9 dage. siRNA’er, blandet med AteloGene i koncentrationer som angivet, blev injiceret i mus på dag 0 og dag 4. tat-peptider blev tilsat til angioreactors før implantation, i de angivne koncentrationer. Et irrelevant RNA duplex (IRR) eller et kodet peptid (SC) blev anvendt som kontroller. Fejlbjælker viser middelværdi ± S.E.M., n = 8. * p 0,05. F-G, Effekt af P4-TAT på CNV formation. Repræsentative mikrografer af CNV læsioner i choroiodale flatmounts fra et dyr behandlet med P4-TAT eller SC. Rød stiplet linie viser omfanget af CNV-læsioner fyldt med FITC-dextran. Scale bar, 100 pm. Kvantitativ analyse af den gennemsnitlige CNV størrelse er vist i G. Fejl søjler viser middelværdi ± sem, n = 70 til 77. * P. 0,05

Vi desuden undersøgt virkningerne af P4-TAT på choroidal neovaskularisering (CNV), som er den vigtigste årsag til svær synstab hos patienter med aldersrelateret makuladegeneration [32], ved anvendelse af laser-induceret choriodeaneovaskularisering i mus [17], [18]. P4-TAT eller SC peptid blev injiceret intraperitonealt i mus dagligt fra en dag før laserbehandlingen indtil afslutningen af ​​eksperimentet. Vi valgte intraperitoneal administration snarere end direkte injektion i øjnene, for at forhindre skade øjnene af sidstnævnte fremgangsmåde. P4-TAT var også effektive til at hæmme CNV (figur 5F og 5G).

Inddragelse af Arf6 signalvejen i endotelpermeabilitet og VE-cadherin endocytose

Den primære funktion af VEGF-signalering indebærer fremme endotelcelle permeabilitet og vaskulær lækage. VEGF signalering inducerer endocytose af VE-cadherin, og dette endocytose er afgørende for forbedring af endotelpermeabilitet [33], [34].

Vi derefter undersøgt, om det GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej også er involveret i endotelpermeabilitet og VE-cadherin endocytose. VEGF øger permeabiliteten af ​​intakte HUVEC’er med to gange, målt ved paracellulær bevægelse af dextranmolekyler [19], [35] (se også figur 6A). Vi derefter undersøgt virkningerne af siRNA’er for GEP100, Arf6 og AMAP1 på permeabilitet. For siRNA’er at være effektive i dette assay, skal siRNA behandling påbegyndes 36 h før cellerne genudpladet på kamre til dannelse sammenflydende monolag. Vi fandt, at HUVEC’er, behandlet med disse siRNA’er allerede udviser høje niveauer af permeabilitet selv uden VEGF, og reagerer ikke på VEGF stimulation til at ændre deres permeabilitet, (figur 6A). Vi målte næste hastighederne for endocytose af VE-cadherin, fra plasmamembranen til cytoplasmaet. VEGF accelererer VE-cadherin endocytose af flere folder i intakte HUVEC’er [19] (se figur 6B og 6C). Som i tilfældet med permeabilitet, HUVEC’er behandlet med GEP100, Arf6 eller AMAP1 siRNAs, udviste alle høje VE-cadherin optagelse selv uden VEGF, og reagerede ikke på VEGF (figur 6B og 6C). Intakte HUVEC’er udviser VE-cadherin-baserede celle-celle kryds med høj integritet, mens VEGF stimulation fremkalder deres uregelmæssige, uorganiserede morfologi [19] (se også figur 6B). Vi fandt, at VE-cadherin-baserede celle-celle junctions bliver uorganiseret selv uden VEGF-stimulering, når celler behandles med disse siRNA’er (figur 6B). I disse eksperimenter blev irrelevante og AMAP2 siRNAs anvendt som negative kontroller. Disse resultater antyder, at tabet af disse proteiner forstyrrer cellerne danner deres intakte celle-celle sammenvoksninger, og celler med sådanne uorganiserede celle-celle sammenvoksninger ikke længere følsom over for VEGF regulering.

HUVEC’er, behandlet med siRNAs for Arf6, GEP100, AMAP1 eller en irrelevant sekvens (IRR) (a-C), eller ved P4-TAT (P4) eller SC-peptid (D-F), blev underkastet en permeabilitet assay ved at måle paracellulær bevægelse af FITC-dextran (Mr 40 kDa) (a, D), og til et VE-cadherin optagelse assay ved at spore endocytose af celleoverfladen VE-cadherin-molekyler (B, C, E, F). I A-C blev celler forbehandlet med siRNA’er i 36 timer før udpladning. I D-F, blev TAT peptider tilsat til konfluente kultur og inkuberet i 30 minutter før analyse. VE-cad, grøn; kerner, blå. Skalaen søjler repræsenterer 10 um. Fejl søjler viser middelværdi ± S.E.M., n = 3. * P. 0,05

Vi derefter testet P4-TAT. I modsætning til de siRNA-behandlinger er beskrevet ovenfor, kan P4-TAT tilsættes direkte til cellekulturer, der er sammenflydende og allerede danner normale, intakte celle-celle sammenvoksninger. Vi fandt, at tilsætning af 10 uM P4-TAT at de sammenflydende kultur blokerer VEGF-medieret forstærkning af cellen permeabilitet, mens det ikke påvirker permeabiliteten i fravær af VEGF (figur 6D). Ligeledes P4-TAT blokerede VEGF-induceret endocytose af VE-cadherin, mens det ikke forårsage internalisering af VE-cadherin i celler dyrket i fravær af VEGF (figur 6E og 6F). VEGF-induceret morfologiske ændringer af celle-celle kryds blev også blokeret af P4-TAT (figur 6E). Disse virkninger af P4-TAT var dosisafhængig, og kontrollen SC peptid ikke udviser sådanne hæmmende virkninger (Figur 6D-6F). Tilsammen konkluderer vi, at GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vej er afgørende for VEGF regulering af endotelceller permeabilitet og VE-cadherin endocytose. Vores resultater antyder også, at komponenter af denne pathway væsentlige kan være involveret i dannelsen af ​​intakte endotheliale celle-celle sammenvoksninger, som cellekulturmediet allerede indeholder en lav koncentration af VEGF.

Discussion

angiogenese og cancer invasion aksjer flere fælles egenskaber [36]. Vi har tidligere vist, at GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin pathway anvendes til invasion og metastase af mange brystcancerceller; og i dette papir viser vi, at denne vej også anvendes i angiogenese, herunder brystcancer-induceret angiogenese og choroideaneovaskularisering. Overekspression af Arf6 og AMAP1 proteiner er nødvendige for en effektiv funktion af denne vej i invasion og metastase [11], [12]. Både Arf6 og AMAP1 udtrykkes også i høje niveauer i endotelceller, som set med yderst invasive brystcancerceller.