PLoS ONE: Gnas Mutationer Identificer et sæt med højresidig, RAS Mutant, villøs Colon Kræft

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse er at bestemme den genetiske hyppigheden af ​​Gnas aktiverende mutationer i kolorektal cancer, og den tilsvarende patologi Gnas mutant tumorer. Onkogene mutationer i Gnas er blevet beskrevet i en række neoplasmer herunder hypofysen, nyren, pankreas, og for nylig, i coloncancer. For at sikre frekvensen i tyktarmskræft vi ansat en følsom pyrosekventering platform for mutation påvisning af R201C og R201H Gnas hotspots i tumor prøver, der repræsenterer alle kliniske faser. Vi har desuden analyseret for KRAS og BRAF-mutationer som tidligere rapporter har vist, at disse ofte co-forekomme med aktivering Gnas mutationer. Af de 428 colontumorer analyseret, mutationer i Gnas var til stede i 10 af prøverne (2,3%), hvilket indikerer dette en betydelig, om end sjælden, mutation i kolorektale tumorer. Ni Gnas mutante tumorer (90%) nærede samtidige aktiverende mutationer i enten KRAS eller BRAF onkogen, som var signifikant større end mutationen hyppigheden af ​​disse gener i tumoren befolkning (56%, p 0,0305). Alle ti af de Gnas mutant tumorer opstod i den rigtige (proksimale) kolon (p 0,007), og 7 af 8 sager anmeldt udstillet en markant villus morfologi. Tilsammen indikerer disse data, at Gnas mutant kolon tumorer har normalt synkrone mutationer i KRAS eller BRAF, har ret-sidet i placering, og er forbundet med en villøs morfologi

Henvisning:. Fecteau RE, Lutterbaugh J, Markowitz SD, Willis J, Guda K (2014) Gnas Mutationer Identificer et sæt med højresidig, RAS Mutant, villøs tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (1): e87966. doi: 10,1371 /journal.pone.0087966

Redaktør: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, USA

Modtaget: Oktober 17, 2013; Accepteret: December 31, 2013; Udgivet: 30 Januar 2014

Copyright: © 2014 Fecteau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af PHS tilskud 1P50CA150964 (SDM, JW, KG), CA148980 (KG), P30CA43703, T32GM007250 (REF) og CA059366 (REF) og ved gaver fra Marguerite Wilson Foundation (SDM), Leonard og Joan Horvitz Foundation (SDM ). Richard Horvitz og Erica Hartman-Horvitz Foundation (SDM), og National Colorectal Cancer Research Alliance (SDM) De finansieringskilder havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Colorectal tumorigenese er kendetegnet ved en række genetiske afvigelser, der omdanner den normale colon epitel i en invasiv cancer [ ,,,0],1]. Vi har tidligere defineret et sæt af 140 gener, der gennemgår periodisk somatisk mutation i kolorektal cancer (CRC), hvilket tyder disse sandsynligvis førere af tumorprogression [2], [3]. Et af disse gener var Gnas, hvor vi fandt tilbagevendende mutationer i codon 201, der ændrede højt konserveret Arg

201 til enten cystein (R201C) eller histidin (R201H) [2], [3]. Gnas er en kendt onkogen, som først blev beskrevet i vækst-hormon secernerende hypofyseadenomer og er siden blevet fundet at være muteret i en række neoplasmer, overvejende ved codon 201 hotspot [4] – [7]. Gnas codon 201 mutationer er særligt hyppige i intrapapillary mucinøse neoplasier (IPMN) i bugspytkirtlen, hvor 67% af tilfældene er mutant [8]. Hovedproduktet af Gnas locus, den Gsα underenheden af ​​heterotrimere G-proteiner, virker til at transducere signaler fra G-protein-koblede recptors (GPCR’er) til effektor enzymet adenylatcyklase i G-stimulerende (Gs) pathway, hvilket fører til produktion af cyklisk AMP (cAMP). Både R201C og R201H mutationer resulterer i konstitutiv aktivering af Gsα og autonom cAMP produktion [9], [10].

I IPMNs er Gnas mutationer ofte ledsaget af mutationer af KRAS, med 51% af Gnas mutant tilfælde også bærer mutationer i KRAS [8]. Aktiverende mutationer i KRAS, og i mindre omfang, dens nedstrømseffektor BRAF, er hyppige begivenheder i tyktarmskræft. Desuden fuld exome sekventering af prøver kolorektal cancer ved vores gruppe og samarbejdspartnere afslørede sammenfaldende Gnas og KRAS mutationer i en lille gruppe af kolon tumorer, indikerer Gnas mutationer i tyktarmskræft kan også ofte være ledsaget af mutationer i KRAS og /eller BRAF [2] .

Rapporterede frekvenser af Gnas aktiverende mutationer i CRC har forskellig mellem forskellige grupper, der spænder fra så lidt som 0,5% til 9% [2], [11] – [13]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi et følsomt pyrosekventering platform at sekventere kodonet R201 mutational hotspot i en kohorte af 428 sporadiske colontumorer at fastslå en mere præcis frekvens i CRC. Vi har også analyseret for mutationer i KRAS og BRAF at bestemme forekomsten af ​​sammenfaldende Gnas /KRAS eller Gnas /BRAF-mutationer i vores tumor kohorte. Klinisk og patologisk data blev gennemgået for at afgøre, om Gnas mutant tumorer er forbundet med eventuelle unikke kliniske eller morfologiske fænotyper. Her viser vi, at Gnas mutant kolon tumorer havnen tilbagevendende KRAS eller BRAF-mutationer, målrette anatomiske proksimal “højre-sidet” kolon, og udviser en villøs morfologi.

Materialer og metoder

Etik Statement

tumoren prøve periodisering protokol med titlen, “CWRU 7296: Colon epitelvæv Bank”, blev godkendt af University Hospitals Case Board Medical center Institutional Review for menneskelig Undersøgelse med den tildelte UH IRB nummer 03-94-105. Under denne protokol, blev kasseret væv opnået gennem skriftligt informeret samtykke fra patienter til forskningsbrug.

Tumor Prøver

Tumor prøver blev indhentet fra en frossen arkiv, der bestod af 428-valgte kolorektal kræft uden rapporterede familie historie (i det følgende benævnt sporadiske kolorektale adenokarcinomer) påløbne under ovennævnte protokol. Kliniske data blev opnået og samlet gennem individuelle patologi case rapporter for hvert tumor. Mikroskopisk undersøgelse af tumor morfologi for udvalgte prøver blev udført af en anatomisk patolog (J. W). Alle prøver blev analyseret for mutationer i Gnas codon 201, KRAS kodoner 12, 13, 61, og 146, og BRAF codon 600 ved hjælp af både Sanger sekventering og pyrosekventering.

DNA-ekstraktion og MSI test

genomisk DNA-ekstraktion fra tumorprøver blev udført under anvendelse af enten en standard guanidinthiocyanat-protokol [14] eller DNeasy blod og væv Kit (QIAGEN). Testning for MSI status på genomisk loci BAT26 og BAT40 blev udført som tidligere beskrevet [15].

Pyrosequencing

Pyrosequencing analyse af Gnas codon 201 blev udført på alle prøver. Pyrosekventering assays blev konstrueret under anvendelse af PSQ Assay Design software (QIAGEN, Chatsworth, CA), som omfattede Gnas codon 201, KRAS kodoner 12 og 13, KRAS codon 61, KRAS codon 146, og BRAF codon 600. For hvert assay, en af ​​PCR primere blev biotinyleret i 5′-enden og oprenset ved anvendelse af højtydende væskekromatografi. Primersekvenser er som følger. Gnas: Til: 5′-biotin-TTGGCTTTGGTGAGATCCATTG-3 ‘, Rev 5’CACCTGGAACTTGGTCTCAAAGAT-3’, Seq 5’TTCCAGAAGTCAGGACA-3 ‘; KRAS codon 12 og 13: For 5’TCGATGGAGGAGTTTGTAAATGA-3 ‘, Rev 5’biotin-TTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3′, Seq 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGC-3 ‘; KRAS codon 61: Til 5’- CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA-3 ‘, Rev 5’biotin-TCCTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’, Seq 5’ATATTCTCGACACAGCAG-3 ‘; KRAS codon 146: For 5’-AGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTT-3 ‘, Rev 5′-biotin-GCCCTCTCAAGAGACAAAAACAT-3′, Seq 5’-AATTCCTTTTATTGAAACAT-3 ‘. BRAF codon 600: For 5’TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA-3 ‘, Rev 5′- biotin-CCACAAAATGGATCCAGACA-3’, Seq 5’TGATTTTGGTCTAGCTACA-3 ‘. Alle PCR-reaktioner blev udført under anvendelse FastStart Taq (Roche) og primerkoncentrationer på 0,2 uM. Cyklingsbetingelser omfattede en indledende denatureringstrin ved 95 C i 4 min, og 49 cykler af 95 ° C for 15 s, 54 C i 30 s, og 72 C i 20 s. Efter PCR blev amplifikationsprodukter sekventeret på en PyroMark MD pyrosekventering instrument (QIAGEN) og blev udført mutation analyse som tidligere beskrevet [16].

Sanger sekventering

Sanger-sekventering blev anvendt til at bekræfte alle mutationer påvist ved pyrosekventering analyse. Isoleret genomisk DNA fra tumorprøver blev anvendt til PCR-amplifikation af regioner der omfatter codon 201 i Gnas, codonerne 12, 13, 61, og 146 af KRAS, og kodon 600 af BRAF. Forward og reverse primere anvendt til PCR-amplifikation blev tagget med en 5’M13 fremad (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘) og 5′ M13 revers (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ‘) universel primersekvens hhv. Primersekvenser var som følger. Gnas: For 5’GTTGGCAAATTGATGTGAGC-3 ‘, Rev 5’CCCTGATCCCTAACAACACAG-3′; KRAS codonerne 12 og 13: I 5’-TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 ‘, Rev 5’CATGAAAATGGTCAGAGAA-3′; KRAS codon 61: Til 5’- TCCAGACTGTGTTTCTCCCT-3 ‘, Rev 5’AACCCACCTATAATGGTGAATATCT-3′; KRAS codon 146: For 5’-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3 ‘, Rev 5′-GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’ BRAF codon 600: For 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3 ‘, Rev 5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’. Alle reaktioner blev udført ved anvendelse af 0,4 uM koncentration af hver primer og FastStart Taq polymerase (Roche, Indianapolis, IN). Cykling for alle primerpar bestod af en initial denaturering ved 95 C i 4 minutter efterfulgt af 39 cykler ved 95 C i 30 s, 58 C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 3 min .

Statistisk analyse

Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere forskelle i andelen af ​​Gnas mutant tumorer mellem klasser af køn, etnicitet, KRAS /BRAF status mikrosatellit stabilitet status, klinisk fase, og tumor placering. En to-tailed P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Hyppigheden af ​​Gnas Hotspot Mutationer i kolorektal cancer

Pyrosequencing detekteret aktiverende mutationer af Gnas codon 201 i ti af de 428 (2,3%) colorectale adenocarcinomer (tabel 1). Hver af disse mutationer blev også valideret ved anvendelse Sanger-sekventering (fig. 1). Af de ti Gnas codon 201 mutationer detekteres, vi identificeret syv p.R201H og tre p.R201C aminosyresubstitutioner, som alle var gensidigt udelukkende (tabel 2). Syv af disse mutationer detekterede opstod blandt de 377 mikrosatellit stabile tumorer afprøvet (1,9%), og tre opstod blandt de 41 tumorer med mikrosatellit instabilitet (7,7%). Den øgede hyppighed af Gnas mutationer i mikrosatellitmarkørerne ustabile tumorer var borderline statistisk signifikans (P = 0,065). Mutationen frekvens i codon 201 af 0,0063 pr diploide basepar er signifikant højere end baggrunden mutation på 1,2 × 10

-6 mutationer per basepar, som kendetegner mikrosatellit stabil coloncancerformer (P = 3E (-36)) [3 ].

Repræsentative kromatogrammer (til venstre) og pyrograms (højre) af Gnas vildtype, Gnas R201C, og Gnas R201H mutationer påvist i tyktarmskræft. Pile i kromatogrammer viser mutante, heterozygote toppe. Boxed toppe i pyrograms fremhæve mutant alleler. Procenter angiver allelfrekvenserne beregnet ud fra pyrogram topintensiteter. Vejviser

Gnas mutationer er associeret med en villøs morfologi

Patologi gennemgang af Gnas mutant tumorer afslørede en fremtrædende villus morfologi i syv af otte (88%) tilfælde, til rådighed til gennemgang. I fem af disse tilfælde opstod de Gnas mutant kræftformer i en sammenhængende villus adenom. I to af disse tilfælde cancere selv viste en yderst usædvanlig villus arkitektur (figur 2). Villøs adenomer er en undertype af adenomatøs polyp, der tegner sig for ca. 5-15% af adenomer [17]. Villøs kræftformer, er dog på nuværende tidspunkt ikke er anerkendt som en bestemt sub-klassificering af CRC, selv om undersøgelser tyder på, at villøse adenokarcinomer kan tegne sig for ca. 9% af CRC sager [18], [19]. Vores resultater viser, at Gnas mutante tumorer nær udelukkende opstår i forbindelse med villøs morfologi stede i enten kræft eller forgængeren adenom

H 0,0305, Fishers eksakte test). Den samlede hyppighed af KRAS og BRAF mutationer i vores tumor befolkning var ca. 56% (44% KRAS, 12% BRAF), hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [20]. Når undersøgt for anatomiske placering i colon, fandtes alle ti Gnas mutantprøverne at være afledt fra primære cancere, der stammer fra den proksimale colon, mellem coecum og milten bøjning, læsioner almindeligvis omtales som højresidig (P 0,007, Fishers eksakte test). Inkluderet i vores tumor kohorte var begge mikrosatellit stabile (MSS) og mikrosatellitmarkørerne ustabile (MSI) kolon tumorer, med MSI sager opstår overvejende på højre side. Fordi tre Gnas mutant tumorer var også MSI tumorer, er det muligt, at herunder MSI kræftformer forvrænger sammenslutningen af ​​Gnas mutationer med den proksimale colon. når alle MSI kræftformer er udelukket fra analysen, sammenslutningen af ​​Gnas positive kræftformer med den proksimale colon dog fortsat signifikant (P 0,044)

Det er interessant at bemærke, at mens alle Gnas mutant kræftformer var højresidig , Gnas mutante adenomer blev fundet i hele tyktarmen (tabel 4). Ingen signifikante forskelle blev observeret i Gnas mutant tumorer når analyseret for køn, etnicitet, klinisk fase, eller mikrosatellit status.

Diskussion

I denne undersøgelse finder vi, at Gnas mutationer forbinder med en særskilt underklasse af coloncancerformer der er kendetegnet ved placering i den proximale colon, ved at have sammenfaldende KRAS eller BRAF mutation og ved association med villus morfologi. Selvom hyppigheden af ​​Gnas mutant coloncancerformer er 2,3%, finder vi disse tumorer udgør en særskilt molekylær-patologiske underklasse af tyktarmskræft. Til vores viden, denne analyse af 428 kolon tuomrs er den mest omfattende analyse af disse mutationer, der er blevet gjort. Frekvensen 2,3% af Gnas mutationer i denne kohorte, er højere end rapporteret senest af Idziaszczyk og kolleger i 2010, om end mindre end oprindeligt observeret i en tidligere mindre undersøgelse af vi og samarbejdspartnere [2]. Interessant nok Gnas mutante cancere findes ikke i den distale colon, hvorimod opstår Gnas mutante villøse adenomer hele tyktarmen, øge muligheden der Gnas mutante adenomer udvikle sig hurtigere til cancer i den proksimale colon eller er mere tilbøjelige til at blive symptomatisk og detekteres, når placeret i den distale colon. Disse spørgsmål skal være yderligere rettet eksperimentelt at skelne mellem disse to muligheder.