PLoS ONE: lektinlignende Oxideret LDL-receptor-1 er en enhancer af tumorangiogenese i human prostatacancer Cells

abstrakt

ændret ekspression og funktion af lectin-lignende oxideret low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) er blevet forbundet med adskillige sygdomme, såsom endotel dysfunktion, atherosklerose og fedme. I disse patologier, oxLDL /LOX-1 aktiverer signalveje, der fremmer celleproliferation, cellemotilitet og angiogenese. Nylige undersøgelser har vist, at

OLR

en mRNA overudtrykt i fase III og IV i menneskelige prostata adenokarcinomer. Men funktionen af ​​LOX-1 i prostatakræft angiogenese stadig, der skal fastlægges. Vores mål var at analysere bidrag oxLDL og LOX-1 til tumor angiogenese ved hjælp c4-2 prostata kræftceller. Vi analyserede ekspressionen af ​​pro-angiogene molekyler og angiogenese på prostatacancer tumorxenoplantater anvendelse prostatacancercellelinjer modeller med overekspression eller knockdown af LOX-1-receptor. Vores resultater viser, at aktiveringen af ​​LOX-1 under anvendelse oxLDL øger celleproliferation, og ekspressionen af ​​de pro-angiogene molekyler VEGF, MMP-2, og MMP-9 i en dosis-afhængig måde. Mærkbart blev disse virkninger forhindret i c4-2 prostatakræft model, når LOX-1-ekspression blev slået ned. Den angiogene virkning af LOX-1 aktiveret med oxLDL blev yderligere demonstreret under anvendelse aortaringen assayet og xenograft model for tumorvækst på chorioallantoiske membran af kyllingeembryoner. Derfor foreslår vi, at LOX-1 aktivering med oxLDL er en vigtig begivenhed, der forbedrer tumor angiogenese i humane prostata kræftceller

Henvisning:. González-Chavarría I, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, Zuñiga FA, Omazábal VA, et al. (2014) lektinlignende Oxideret LDL-receptor-1 er en enhancer af tumorangiogenese i Human prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10,1371 /journal.pone.0106219

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 7, 2014 Accepteret: 29 juli 2014; Udgivet: 29 August, 2014

Copyright: © 2014 González-Chavarría et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Fondecyt Grant 1121159, Conicyt, Chile. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lektinlignende oxideret low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) er et medlem af scavenger receptorfamilie [1], som medierer genkendelse og internalisering af oxideret LDL (ox-LDL) [2 ]. LOX-1 hovedsageligt udtrykkes i endotelceller, selv om denne receptor også kan findes i mange andre celletyper, såsom monocytter, cardiomiocytes, adipocytter, blodplader, makrofager og vaskulære glatte muskelceller [3]. Den ændret ekspression og funktion af LOX-1-receptor er blevet forbundet med sygdomme, såsom endotel dysfunktion, atherosklerose, fedme, og for nylig også med tumorudvikling [4] – [6]. Aktiveringen af ​​LOX-1 ved oxLDL i humane endotelceller inducerer ekspression af adhæsionsmolekyler; pro inflammatoriske signalveje; og pro-angiogene proteiner, såsom metalloproteinase-2 og 9 (MMP-2 og MMP-9), angiotensin II (Ang II) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [7] – [10]. Angiogenese er en fysiologisk proces, der bestemmer dannelsen af ​​nye blodkar fra allerede eksisterende skibe [11]. Det anses for et normalt fænomen under fosterudviklingen, vækst af organismen og sårheling [12]. Men angiogenese er også en grundlæggende fremgangsmåde til udvikling og progression af flere typer af tumorer [13]. Tumor angiogenese reguleres af balancen mellem pro- og anti-angiogene molekyler frigivet af tumorceller og stromale tumorceller såsom fibroblaster og makrofager, som er bestemmende for tænding tumor angiogenese [14], [15]. Genekspressionen i tumorangiogenese er yderligere reguleres som respons på adskillige stimuli, herunder hypoxi, oxidativt stress og inflammation. I denne forbindelse mellem stimuli og pro-angiogeniske proteinekspression har VEGF blevet identificeret som en væsentlig faktor i tumorangiogenese [16], [17]. Hypoxi, cytokinsekretion og oxidativt stress i tumorceller forøge ekspressionen af ​​VEGF, således at inducere tumorangiogenese [18].

LOX-1 er blevet foreslået som en mulig forbindelse mellem obesitas, dyslipidæmi og cancer [19] . Konsekvent har kliniske betingelser for fedme og atherosklerose blevet forbundet til tumorprogression og metastase i prostatacancer [20] – [22]. Patienter diagnosticeret med metabolisk syndrom, kroniske inflammatoriske sygdomme og autoimmune tilstande viste en høj forekomst og aggressivitet i tumorudvikling [23]. Faktisk har nyere undersøgelser vist en øget ekspression af LOX-1 i humane prostata adenocarcinomer på trin III og IV [5], som kræver ny vaskularisering og angiogenese til lokal invasion. Men den specifikke effekt af LOX-1 i tumorangiogenese er endnu ikke blevet beskrevet,.

Dette arbejde viser, at LOX-1 og dets aktivering ved hjælp oxLDL inducere tumorangiogenese og stimulere celleproliferation i prostatacancerceller. Specifikt viser vi, at aktiveringen af ​​LOX-1 under anvendelse oxLDL fremmer celleproliferation, og ekspressionen af ​​pro-angiogene molekyler VEGF, MMP-2, og MMP-9 i en dosis-afhængig måde. Især blev disse virkninger forhindret i c4-2 prostatakræft model, når LOX-1-ekspression blev slået ned. Desuden blev den angiogene virkning af LOX-1 aktiveret af oxLDL påvist under anvendelse aortaringen assayet og xenograft model for tumorvækst på fosterhinder (CAM) af kyllingeembryoner. Derfor foreslår vi, at LOX-1-aktivering af oxLDL er en relevant aktivering pathway nødvendig for angiogene forøgelse af tumor udvikling af menneskelige prostata kræftceller.

Resultater

Generering af prostatakræft-cellelinier overekspression LOX-1 og shRNA mod olr1

c4-2 prostatakræft-cellelinier transduceret med lentivirale ekspressionsvektor LvCW-LOX-1, der koder for

olr1

genet under kontrol af cytomegalovirus promotoren (CMVP), og isoleret ved anvendelse af begrænsende fortynding kloning metode. Overekspression af LOX-1 i c4-2 celler blev bestemt under anvendelse af real-time PCR, immunoblotting og immunofluorescens. Syv forskellige kloner med LOX-1 overekspression blev opnået, ud af disse blev 3 kloner udvalgt efter Western blot eksperimenter og analyseret ved hjælp af real-time PCR (fig. 1A og D). Den valgte celleklon c4-2 /​​LOX-1 (+) (klon 5) havde en 1,2 x 10

3 gange ekspression i forhold til basale LOX-1-mRNA-niveauer af det native c4-2 cellelinien eller c4-2 /GFP-overekspression kontrol. Derudover blev LOX-1 overekspression i denne klon immunolocalized i cellemembranen ved hjælp af konfokal mikroskopi (fig. 1F). For at bestemme, om overekspression medieret af lentivirale partikler havde en effekt på ekspressionen af ​​LOX-1, blev en overekspression kontrol (c4-2 /​​GFP celler), der genereres. Vi har ikke observeret væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​LOX-1 i denne kontrol i forhold til den indfødte c4-2 cellelinje (fig. 1C og F).

A) Western blot for LOX-1 (40 kDa ) ekspression i humane CaP-kloner med overekspression af LOX-1. B) Western blot for LOX-1 (40 kDa) ekspression i human prostatacancer cellekloner med LOX-1 knockdown C) Real-time PCR for LOX-1-ekspression i tre kloner med overekspression af LOX-1. D) Real-time PCR for LOX-1-ekspression blev bestemt i tre kloner, som udtrykker shRNA /LOX-1 (A), og tre kloner, som udtrykker shRNA /LOX-1 (B). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg udført tredobbelt, og statistisk analyseret ved anvendelse envejs variansanalyse og Dunnetts post-test; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

LOX- 1 knockdown i c4-2-celler blev opnået ved anvendelse af en shRNA mod mRNA’et kodet af

olr1

gen. C4-2 celler blev transduceret med lentivirusvektorer til ekspression af hver shRNA (LVW-U6 /

OLR

1) sekvens mod

olr1

under kontrol af U6 promotoren. De transducerede celler blev isoleret ved anvendelse af begrænsende fortynding kloning metode, og LOX-1 down-ekspression blev analyseret ved anvendelse real-time PCR, immunoblotting og immunofluorescens (fig. 1). To forskellige shRNA sekvenser, shRNA-A og shRNA-B, blev analyseret. Tre forskellige kloner af shRNA-A og shRNA-B LOX-1 knockdown opnået. Den valgte shRNA-B-klonen faldt LOX-1-ekspression med 98% sammenlignet med basale LOX-1 mRNA niveauer af den native c4-2 cellelinien eller c4-2 /​​LvEmpty knockdown kontrol-cellelinie (fig. 1B-E). Desuden blev ned-ekspressionen af ​​LOX-1 i denne klon verificeres ved immunhistokemi (fig. 1 F). For at afgøre, om knockdown medieret af lentivirale partikler havde en effekt på ekspressionen af ​​LOX-1 en knockdown kontrol (c4-2 /​​LvEmpty) blev genereret. Vi har ikke observere væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​LOX-1 i denne kontrol i forhold til den indfødte c4-2 cellelinje (fig. 1C og F).

De prostata kræft celle modeller opnået, nemlig c4-2 /LOX-1 (+) [klon 5], c4-2 /​​LOX-1 (-) [klon shRNA-B1] og nativ c4-2 cellelinie, blev anvendt som modeller i alle analyser udført i dette arbejde

oxLDL har ikke cytotoksiske virkninger i prostatacancercellelinjer modeller

start fra oxidationen af ​​nativt LDL fra normolipemic patient opnåede vi en fraktion af medium niveau oxideret LDL (oxLDL), der blev kontrolleret ved generering af konjugerede diener og natriumboratbuffer elektroforese i 1% agarose (fig. 2A). For at bestemme om den opnåede oxLDL havde nogle cytotoksiske virkning inkuberede vi prostata cancercellelinjer modeller med oxLDL (25 til 150 ug /ml) i løbet af 12 timer. Vores resultater viste ingen cytotoksiske virkninger af oxLDL på nogen af ​​prostata-celle modeller for det koncentrationsområde analyseret (fig. 2B). Imidlertid observerede vi en signifikant stigning i celleproliferation af c4-2, c4-2 /​​GFP, c4-2 /​​LvEmpty og c4-2 /​​LOX-1 (+) cellulære modeller for alle oxLDL anvendte koncentrationer, i forhold til samme ubehandlede prostatacancercellelinjer modeller. Desuden var der en signifikant stigning i celleproliferation observeret i c4-2 /​​LOX-1 (+) i forhold til c4-2 eller overekspressionen og knockdown styringer til alle oxLDL koncentrationer analyseres. Imidlertid blev den proliferative virkning forhindres fuldstændigt i c4-2 /​​LOX-1 (-) celle model over alle koncentrationer analyseret (figur 2B.)

A) oxLDL opnået fra humant plasma blev oxideret med 7. uM CuSO

4, overvåges ved spektrofotometri ved λ 243 nm og elektroforeret i 1% agarosegeler med natriumboratpuffer. B) Cytotoksicitetsassay af prostatacancer cellemodeller behandlet med 25, 50 og 100 ug /ml oxLDL løbet af 12 timer. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og statistisk analyseret ved hjælp af envejs ANOVA og Dunnetts post-test (* eller #

p ≤ 0,05

).

Den oxLDL ligand øger udtrykket af pro-angiogene markører

prostatacancer c4-2 cellelinje blev inkuberet med stigende koncentrationer af oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) i løbet af 12 timer, og ekspressionen af ​​pro-angiogene markører VEGF , MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved anvendelse real-time PCR. Vores resultater viste en signifikant stigning i ekspressionen af ​​VEGF, MMP-2 og MMP-9, i forhold til de oxLDL anvendte koncentrationer, med en respektiv 3,5-, 2,5-, og 3 gange stigning, når 100 ug /ml oxLDL var anvendes. Desuden blev LOX-1-ekspression også proportionalt forøget med koncentrationerne af oxLDL anvendte, viser en 3 gange stigning ved 100 ug /ml (fig. 3).

Relativ kvantificering af LOX-1, VEGF, MMP -2, og MMP-9-ekspression blev udført ved anvendelse realtids-PCR i human prostatacancer-cellelinie c4-2 inkuberet med stigende koncentration af oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) i 12 timer. Dataene repræsenterer gennemsnit ± S.D. af tre uafhængige forsøg udført tredobbelt, og statistisk analyseret ved anvendelse envejs variansanalyse og Dunnet post-test; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

Forøget udtryk for pro-angiogene markører i prostata kræftceller kræver aktivering af LOX-1 ved oxLDL

De prostatacancerceller modeller c4-2 /​​LOX-1 (-) og c4-2 /​​LOX-1 (+) blev inkuberet med 100 ug /ml oxLDL løbet af 12 timer, og ekspression af de pro-angiogene markører (VEGF, MMP-2 og MMP-9) blev analyseret. Ekspression af VEGF, MMP-2 og MMP-9 i c4-2 cellelinie inkuberet med oxLDL steget betydeligt (2-, 2- og 2,5 gange henholdsvis), sammenlignet med ubehandlede c4-2 celler (Fig. 4A ). Interessant ekspressionen af ​​pro-angiogeniske markører induceret af oxLDL, blev forhindret i c4-2 /​​LOX-1 (-) prostatacancer celle model. På den anden side, stimulering af c4-2 /​​LOX-1 (+) med oxLDL signifikant øget ekspression af alle pro-angiogene markører analyseres (VEGF og MMP-2, 2-fold; MMP-9 3 gange), sammenlignet med ubehandlede c4-2 celler. Ekspressionen af ​​VEGF, MMP-2, og MMP-9 i c4-2 /​​LOX-1 (+) celler var også signifikant forøget (1,6, 1,5- og 1,4-fold, henholdsvis), selv i fravær af oxLDL stimulering, og faldt med 20%, 50% og 20% ​​i c4-2 /​​LOX-1 (-) celler, sammenlignet med den endogene ekspression i c4-2 cellelinie uden oxLDL stimulering (figur 4A).

c4-2, c4-2 /​​LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) humane prostata cancer celle modeller blev inkuberet i med eller uden oxLDL [100 mikrogram /ml] til 12 timer. A) Relativ kvantificering af VEGF, MMP-2, og MMP-9-ekspression blev analyseret ved anvendelse real-time PCR. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg udført in triplo og analyseret statistisk ved anvendelse af envejs variansanalyse og Dunnet post-test; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

). B) Western blot for VEGF-ekspression (30 kDa). C) Zymogram for MMP-2 (72 kDa pro-form 64 kDa aktiv-form) og MMP-9 (92 kDa pro-form. 84 kDa aktiv-form) aktiviteter i konditioneret medium

De konditionerede medier fra prostatacancercellelinjer modeller inkuberet med oxLDL [100 ug /ml] blev opsamlet og opkoncentreret. Senere VEGF-ekspression blev vurderet ved immunoblotting, og aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved zymografi. Vores resultater tiltalt at VEGF-ekspression blev øget i c4-2 celler inkuberet med oxLDL, når man sammenligner med c4-2 celler uden oxLDL, mens ekspressionen af ​​VEGF blev forhindret i c4-2 /​​LOX-1 (-) celler inkuberet med oxLDL [ ,,,0],100 ug /ml]. Desuden blev VEGF-ekspression forhøjet i c4-2 /​​LOX-1 (+) celler med o uden oxLDL behandling (fig. 3B). Analyse af metalloproteinaseaktivitet viste en stigning i gelatinaseaktivitet af MMP-2 og MMP-9 i det konditionerede medium fra c4-2 celler inkuberet med oxLDL, og blev forhindret i konditioneret medium fra c4-2 /​​LOX-1 (-) celler inkuberet med oxLDL. Endvidere LOX-1 overekspression i c4-2 /​​LOX-1 (+) celler viste en forøget aktivitet af MMP-2 og MMP-9 med eller uden oxLDL stimulering (fig. 4C).

Aktivering af LOX -1 ved oxLDL fremmer frembringelsen af ​​spire i muse aortaringe Salg

Vi analyserede c4-2 model celler inkuberet med oxLDL at afgøre, om frembringelsen af ​​endotheliale spirer kunne stimuleres i aortaringen assayet ved den differentielle sekretion af pro-angiogene markører. The c4-2, c4-2 /​​LOX-1 (-) og c4-2 /​​LOX-1 (+) celler modeller blev inkuberet med 100 ug /ml oxLDL i løbet af 12 timer, og det konditionerede medium blev opsamlet, koncentreret og anvendes til behandling af mus aortaringe.

stimulering af aortaringe med konditionerede medier fra c4-2 og c4-2 /​​LOX-1 (+) celler behandlet med oxLDL signifikant forøget generering af spirer i forhold til den ubehandlede c4-2 cellelinie. Forskellene mellem aorta ring spire generation hjælp konditionerede medier fra c4-2 /​​LOX-1 (-) med eller uden oxLDL stimulering blev ikke signifikant. Således overekspression af LOX-1 fremmet spirer generation med eller uden oxLDL stimulering (fig. 5A).

A). Mikrofotografi af muse aortaringe og kvantificering af spirer pr ring inkuberet med konditioneret medium fra prostatacancer c4-2, c4-2 /​​LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) celler tidligere stimuleret med eller uden oxLDL [100 ug /ml]. B) LOX-1-aktivering af oxLDL fremmer tumor angiogenese i Cap xenograftmodeller på chorioallantois membran af kylling embryoner. Mikrofotografi og kvantificering af tumor blodkarrene i xenotransplantater af c4-2, c4-2 /​​LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) celler, som tidligere inkuberet med eller uden oxLDL [100 ug /ml], i fosterhinder fra 10-dage gamle kylling embryoner. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og blev statistisk analyseret ved hjælp af envejs variansanalyse med Dunnetts post-test (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

Aktivering af LOX-1 ved oxLDL fremmer angiogenese i prostata cancer celle implanteret på chorioallantois membran af kylling embryoner

til angiogenese undersøgelser på chorioallantoiske membran (CAM), i kyllingeembryoner, prostatacancer cellekloner c4-2, c4-2 /​​LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) blev præinkuberet med oxLDL 100 ug /ml for 2 timer. Ca. 1 × 10

6 celler blev derefter podet på CAM på 10-dage gamle kylling embryoner. Fem dage efter inokulering blev tumorer ekstraheret fra CAM’erne og omfanget af tumorvaskularisering blev analyseret. C4-2 celler præinkuberet med oxLDL viste en betydelig stigning af tumorvaskularisering sammenlignet med de ubehandlede c4-2 celler. Endvidere LOX-1 overekspression i c4-2 /​​LOX-1 (+) celler viste også en øget tumorvaskularisering når cellerne blev inkuberet med eller uden oxLDL sammenligning med de ubehandlede c4-2 celler. Især c4-2 /​​LOX-1 (-) celler behandlet med oxLDL viste ikke signifikante forskelle i tumor vaskularisering, sammenlignet med både c4-2 og c4-2 /​​LOX-1 (-) ubehandlede celler (. Figur 5B).

olr1

gen overudtrykt i offentlige array-datasæt fra metastatisk prostatacancer

med det formål at afgøre, om de observerede virkninger på tumor angiogenese medieret af oxLDL /LOX-1 i c4-2 prostatacancerceller havde nogen klinisk relevans for patienter, brugte vi NCBI Gene Expression Omnibus database (GEO) at bestemme ekspressionen af ​​

olr1

receptor i GDS2545 datasæt, som har forskellige stadier af prostatakræft progression . Disse data giver den sammenlignende analyse af humane metastatiske prostata tumorer, primære prostatatumorer og normal donor væv. I denne sammenhæng ekspressionen af ​​

OLR-1

fandtes at øges betydeligt i primære prostatatumorer og metastatiske prostatatumorer sammenlignet med normalt prostatavæv (fig. 6).

Ekspressionen af

olr1 dele på forskellige stadier af prostatakræft tumor progression blev bestemt ved hjælp af den offentlige database GDS2545 på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.E. humant normalt donorvæv n = 17, primære prostatatumorer n = 64 og metastatiske prostatatumorer n = 50, hvilket statistisk analyseret ved anvendelse af en

t

test (

* p ≤ 0,05

).

diskussion

i dette arbejde viser vi, for første gang, rolle LOX-1-receptoren, og dets aktivering ved hjælp oxLDL, om spredning og angiogenese af menneskelig C4 2 prostata kræftceller. Specifikt viser vi, at en stigning i oxLDL koncentrationer fremmet celleproliferation og betydeligt og proportionalt øger ekspressionen af ​​pro-angiogene markører VEGF, og MMP-2 og MMP-9. Desuden cellulær stimulering af LOX-1 med oxLDL også øget ekspression af LOX-1-receptoren, hvilket genererer en positiv feedback-sløjfe af LOX-1-ekspression.

Associeringen af ​​LOX-1 og oxLDL med sygdomme , såsom endotel dysfunktion, atherosklerose, akut myokardieinfarkt, slagtilfælde, diabetes, hypertension, metabolisk syndrom og fedme, er blevet grundigt undersøgt [3], [5], [24]. Fedme, selv, er også blevet forbundet som en vigtig risikofaktor for atherosklerose, type 2 diabetes mellitus og cancer, såvel som andre sygdomme [25]. Kliniske studier tyder på en forbindelse mellem høje serum oxLDL koncentrationer og en øget risiko for at udvikle tyktarmskræft [26]. Endvidere oxLDL koncentrationer er også blevet vist, at stige hos overvægtige patienter [27].

I overensstemmelse med disse resultater, havde tidligere rapporter vist, at fedme er forbundet med en øget risiko for at udvikle stærkt malign og metastatisk prostatacancer [21 ], [28]. Desuden er der i den transgene Adenokarcinom i Mouse Prostate (TRAMP) musemodel, fodring af musene med en hyperkalorieholdige kost, øger den histologiske grad af prostatatumorer, antallet af metastaser, tumormasse, og graden af ​​vaskularisering sammenlignet til TRAMP mus fodret med normal kost [29].

Der er en særlig relevans i forholdet mellem kolesterol og prostatakræft, fordi androgen og andre steroidhormoner syntetiseres fra kolesterol, og er grundlæggende i udviklingen og vedligeholdelse af prostatacancer [30]. Under fysiologiske betingelser androgener er involveret i køb af sekundære kønskarakterer, vækst og normal udvikling af prostata. De har imidlertid også været forbundet med tumorprogression i prostatacancer [31]. Således er mange af de prostatakræft refraktære over for androgen deprivation, stigning cholesterol optagelse, som er den primære substrat for androgen syntese [31], [32]. I denne henseende den største kilde til kolesterol for tumorceller er LDL, som hovedsageligt endocyted af LDL-receptorer (LDLR) [33], [34]. Men vi mener, at oxidant og pro-inflammatorisk tumor mikromiljø rig på ROS [35] kunne være fremme LDL modifikation af lipoperoxidering [36], undgå anerkendelse af LDLR og favorisere sin optagelse i scavenger receptorer af oxLDL. Ifølge denne, vi analyserede udtryk for skraldemanden receptorer for modificerede lipoproteiner og ekspression af LDL-receptoren i GDS2545 datasæt, opnået fra den offentlige database (GEO profil) [37]. Deri, observerede vi en markant stigning i ekspressionen af ​​scavenger receptorer

olr1, halstørklæde

og

scarb1

i primære tumorer og metastaser af prostatakræft, og en signifikant stigning i ekspressionen af ​​

CD36

olr1

receptor i prostatakræft metastaser i forhold til normal prostata væv. Interessant ekspressionen af ​​LDLR viste et signifikant fald i dets ekspression i tumormetastase og blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem primære prostatatumorer og normal prostata væv (data ikke vist).

I betragtning af dette høje koncentrationer af cirkulerende LDL hos overvægtige patienter med prostatacancer kunne bidrage til tumorudvikling gennem LOX-1-aktivering ved oxidation modificeret LDL (oxLDL) genereret i oxidant mikromiljø, til stede i prostata tumor stroma. I denne forbindelse genereres vi et medium niveau oxideret LDL, som bør være repræsentative for oxLDL stede i tumormikromiljøet. Vores resultater viste, at oxLDL anvendt i denne undersøgelse ikke har nogen cytotoksisk virkning i nogen af ​​c4-2 prostatacancerceller modeller analyseret. I denne henseende er det blevet rapporteret, at oxLDL har en differentiel cytotoksisk virkning afhængigt af celletype. Kræftceller linjer K562 /AO2 (leukæmi) og EC9706 (esophageal carcinoma) behandlet med oxLDL præsentere en højere cellelevedygtighed sammenlignet pinsemandag ikke-tumorceller, såsom HUVEC (human navleveneendotelceller) [38].

Interessant, observerede vi en markant stigning i celle proliferation af c4-2, c4-2 /​​GFP, c4-2 /​​LvEmpty og c4-2 /​​LOX-1 (+) cellulære modeller, over hele spektret af oxLDL koncentrationer analyseres sammenlignet med de ubehandlede cellelinier. Også viste c4-2 /​​LOX-1 (+) celle model en højere spredning i forhold til kontrol celler modeller c4-2, c4-2 /​​GFP, og c4-2 /​​LvEmpty, for alle koncentrationer analyseret. Imidlertid blev den proliferative effekt af oxLDL forhindret i c4-2 /​​LOX-1 (-) celle model, hvilket indikerer, at denne virkning er nært beslægtet med aktiveringen af ​​LOX-1-receptoren ved oxLDL. I den forstand har den proliferative effekt fremmes ved oxLDL /LOX-1 blevet beskrevet i muskelceller, endotelceller og for nylig i brystcancerceller gennem aktivering veje, der involverer p38 (MAPK), p44 /42 MAPK, og NF- kB [6 ], [39]. Men de proliferative virkninger på prostatacancerceller endnu ikke beskrevet.

In vitro Salg undersøgelser har vist, at oxLDL stimulering af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC’er) aktiverer ekspressionen af ​​LOX -1 receptor, generering af en overekspression af adhæsionsmolekyler, inflammatoriske proteiner, og MMP-2 og MMP-9 metalloproteinaser, [8], [40], [41]. Endvidere endotelceller fra bovin aorta behandles med ox-LDL fremme kapillærdannelse reguleret af LOX-1, og aktiveringen af ​​NADPH oxidase /MAPKinase /NF-kappa B, med en stigning i VEGF-ekspression [9], [42]. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​VEGF, og aktiveringen af ​​MMP-2 og MMP-9, er nært medieret af oxLDL /LOX-1 i c4-2 prostatacancer-cellelinie.

Vi bekræfter også, ved hjælp af aortaringen assay og kylling embryo CAM xenograftmodel, at stigningen af ​​VEGF, MMP-2 og MMP-9-ekspression medieres af LOX-1 /oxLDL har en tumoral angiogen virkning både

in vivo

ex vivo

på c4-2 prostatacancerceller modeller. Dette er i overensstemmelse med tidligere

ex vivo

studier, hvor pro-angiogene faktorer som angiotensin II ikke inducerer kapillær spire dannelse i aorta ringe isoleret fra

OLR-1 KO

mus [10]. Ligeledes ablation af

OLR-1

genet markant nedsat den choriodeaneovaskularisering i murine modeller af laser-induceret beskadigelse [43]. Signalering induceret af oxLDL /LOX-1 kunne have en kritisk rolle i processen med tumorangiogenese fordi mikrokardannelse tæthed er en vigtig prognostisk indikator i prostatacancer, og er forbundet med kliniske stadium, progression, metastase, og prostatakræft overlevelse [44], [45].

Afslutningsvis demonstrerer vi en direkte sammenhæng mellem fedme faktorer, såsom LOX-1 /oxLDL og styrkelse af ekspressionen af ​​spredning og pro-angiogene markører, som har en biologisk virkning i tumor angiogenese

ex vivo

in vivo

i c4-2 prostatacancerceller modeller. Derfor foreslår vi, at LOX-1 kunne være en væsentlig regulator i prostata kræftceller, med evnen til at øge tumor angiogenese mod malignitet og metastase hos overvægtige patienter.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humant c4-2 prostatacancer [46], [47] og HEK-293 FT-celler blev dyrket i RPMI 1640 og DMEM-medium henholdsvis suppleret med 2 mM L-glutamin (Hyclone), 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (GIBCO).

Dyr

Male BALB /c mus blev opnået fra Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Tyskland) og holdt under kontrollerede og sterile omgivelser betingelser. Fire mus (8-12 uger gamle) blev anvendt til forsøgene.

Æg af

Gallus gallus domesticus

blev opnået fra ISP (Instituto de Salud Pública, Chile), blev vasket med en 7 pM kobbersulfatopløsning at forhindre svampeangreb og blev inkuberet ved 37,5 ° C og 80% relativ fugtighed i 10 dage. Æggene blev vendt med jævne mellemrum med en automatisk dobbelt turner (GQF Hova-Bator Manufacturing Co. USA) for at forhindre vedhæftning og sprængning af CAM fra æggeskallen. Embryoner podet med c4-2 celler modeller blev inkuberet ved 37,5 ° C, 80% fugtighed og 5% CO

2 i 5 dage.

Alle de undersøgelser med eksperimenter med dyr var i overensstemmelse med de retningslinjer og anbefalinger fra NIH guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (nuværende udgave) og fulgte de politikker, der er angivet i den chilenske biosikkerhed Manual of Conicyt (nationale agentur for videnskab og teknologi). De eksperimentelle protokoller blev udarbejdet af forfatterne og godkendt af Institutional etiske komité. I alle tilfælde, overvågning af veterinære myndigheder fra School of Biological Sciences, Universidad de Concepción, Chile, var sikret. Når mus blev brugt til eksperimenter, blev de anbragt i enkelte rum og passende fodring, vandforsyning og sundhedsovervågning blev permanent forudsat. Dyr aflivet blev menneskeligt håndteres. De blev udsat for indledende bedøvelse og kaliumklorid injektion intravenøst ​​for at undgå lidelse.

ox-LDL forberedelse

Blodprøver (20 ml) blev indhentet fra fire frivillige, der har underskrevet en skriftlig tilladelse. Denne protokol blev godkendt af Etisk Komité Universidad de Concepción, Chile. Humant LDL (1,019-1,063 g /ml) blev isoleret fra blodplasmaet af sunde forsøgspersoner ved sekventiel ultracentrifugering ved 4 ° C. LDL blev dialyseret mod filtreret (0,45 um) LDL-buffer (150 mmol /l NaCI; 0,24 mmol /l EDTA; pH 7,4), ændret tre gange, i 36 timer ved 4 ° C. Efter omfattende dialyse mod PBS, med 3 ændringer, i 36 timer ved 4 ° C, blev oxideret LDL fremstilledes ved inkubering oprenset LDL med 7 um CuSO

4 i 3 timer ved 37 ° C. Modifikation af LDL blev overvåget ved spektrofotometri ved produktion af konjugerede diener ved λ 243 nm, og derefter en elektroforese i 1% agarosegel i natriumboratpuffer blev realiseret for at bestemme ændringen i den elektroforetiske vandring af oxLDL forhold til LDL. Gelen blev farvet med 0,25% Coomassie blue R-250, i løbet af 2 timer, og affarvet i 4 timer under anvendelse af 5% MeOH, 7,5% HOAc 87,5% H

2O. Båndene af LDL og oxLDL blev analyseret med Odyssey CLX instrument (LI-COR, EEUU).

cytotoksicitet evaluering

prostatakræft celle modeller blev inkuberet med 25, 50 og 100 mg /mL oxLDL løbet af 12 timer. Efter dette, blev mediet fjernet, kulturerne blev vasket med phosphatbufret saltvand, og cellelevedygtigheden blev målt inkubere kulturerne med 10 mg /ml 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) ved 37 ° C i 30 minutter, og måling af absorbans ved 570 nm i solubiliserede celler under anvendelse af et UV-synligt SPECTROstar

Nano

spektrometer (BMG LABTECH, Tyskland).

lentivirusvektorer der udtrykker ORL-1 eller shRNA mod olr1

den humane LOX-1-sekvensen blev sub-klonet ind i lentivirale pLCW vektoren, genererer pLCW-LOX-1-konstruktionen.