PLoS ONE: En integreret Expression Profiling afslører målgener af TGF-β og TNF-α Muligvis medieret af MikroRNA’er i Lung Cancer Cells

Abstrakt

EMT (epitelial-mesenkymale overgang) er afgørende for kræftceller til at erhverve invasive fænotyper. I A549 lungeadenocarcinom celler, TGF-β fremkaldte EMT i Smad-afhængig måde og TNF-α fremskyndet denne proces, hvilket bekræftes af cellemorfologi, ekspression af EMT markører, kapacitet af gelatine lysis og celleinvasion. TNF-α stimulerede phosphorylering af Smad2 linker region, og denne virkning var svækket ved inhibering MEK eller JNK. Omfattende ekspressionsanalyse bragt i orden gener differentielt reguleret af TGF-β og TNF-α, såsom cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer og ECM (ekstracellulære matrixer), hvilket tyder på drastisk ændring i autokrin /parakrine signaler samt celle-til-ECM-interaktioner. Integreret analyse af microRNA signatur muligt for os at identificere en undergruppe af gener, potentielt reguleret af microRNA. Blandt dem, bekræftede vi TGF-β-medieret induktion af MIR-23a i lunge epiteliale cellelinjer, målgener hvoraf blev yderligere identificeret ved genekspression profilering. Kombineret med i silico tilgange, vi bestemt HMGN2 som en downstream mål for miR-23a. Disse resultater giver en linje af beviser for, at virkningerne af TGF-β og TNF-α var delvist medieret af microRNA, og belyse kompleksiteten af ​​molekylære begivenheder fremkaldt af TGF-β og TNF-α.

Henvisning : Saito A, Suzuki HI, Horie M, Ohshima M, Morishita Y, Abiko Y, et al. (2013) En integreret Expression Profiling afslører målgener af TGF-β og TNF-α Muligvis medieret af MikroRNA’er i lungecancerceller. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10,1371 /journal.pone.0056587

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: 30 august, 2012; Accepteret: 11 januar 2013; Udgivet: 20 Februar 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI (tilskud-i-Aid for videnskabelig forskning) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi og tilskud fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste kræfttype, der forårsager dødsfald på mere end en million mennesker hvert år. Forståelse af molekylære begivenheder, der styrer invasive /metastatisk spredning af cancerceller er afgørende for udviklingen af ​​nye lægemidler på lungekræft. Epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er differentieringen switch dirigere epitelceller til at erhverve mesenchymale fænotyper, som spiller nøgleroller under embryonisk udvikling samt cancer invasion /metastase. Kendetegnende for EMT er E-cadherin nedregulering og efterfølgende tab af celle-celle sammenvoksninger, som er koblet med forøget ekspression af mesenchymale markører herunder N-cadherin og vimentin. Derudover EMT er ledsaget med celle morfologiske ændringer fra ‘terningformet’ til ‘spindel-lignende’ optrædener, som svarer til actin reorganisering og cytoskeltal ændringer, der fører til erhvervelse af fibroblast-lignende vandrende fænotype [1], [2].

transformerende vækstfaktor (TGF) -β spiller en central rolle i reguleringen af ​​EMT og udviser sine pleiotropiske virkninger gennem binding til receptorer type i (TβR-i) og type II (TβR-II). Ved ligand-induceret heteromer kompleksdannelse mellem TβR-I og TβR-II, TβR-I phosphoryleres med TβR-II og medierer specifik intracellulær signalering gennem phosphorylering af receptor-regulerede Smads (R-Smads: Smad2 og Smad3 for TGF-β) . Phosphoryleret R-Smads interagere med Smad4 og translokere ind i kernen, hvor de regulerer transskription af målgener [3], [4]. TGF-β er ofte overudtrykkes i tumorvæv, og letter cancer progression gennem en forskelligartet repertoire af tumor-celle-selvstændige og vært-tumor-interaktioner, herunder forøgelse af cellemotilitet og invasion, som indebærer processen med EMT [5].

akkumulerende beviser optrevler de molekylære mekanismer, som inflammatoriske responser fremmer tumor progression [6]. Tumornekrosefaktor (TNF) -α er en af ​​de mest potente pro-inflammatoriske cytokiner produceret i tumormikromiljøet. Ved stimulering, aktiveret IKK (IKB kinase) phosphorylerer NFKB inhibitor (IKB) og udløser dets hurtige nedbrydning gennem proteasom proteolyse, hvilket resulterer i frigørelse af NFKB, som derefter translokerer til kernen og inducerer et utal af genekspression involveret i immunrespons [7 ]. Bidrag NFKB signalering til initiering og progression af kræft er klart dokumenteret, og flere linjer af beviser demonstrerer, at TNF-α og /eller NFKB signalering spiller en central rolle i reguleringen af ​​EMT [8], [9], [10 ].

kodende microRNA (miRNA) tiltrække stigende opmærksomhed som centrale elementer i cellesignalering, som regulerer ekspressionsniveauer for flere proteiner, primært ved at binde til den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af mål. Vigtige roller for miRNA har vist i tumor progression ved modulering af celledifferentiering, proliferation, invasion, og metastase. MicroRNA-200 (MIR-200) og MIR-205 er kritisk involveret i opretholdelse af epitelcelle fænotype og undertrykkes af TGF-β [11]. Det er også rapporteret, at MIR-21 og MIR-31 synergisk induceres af TGF-β og TNF-α, som letter cancercelleinvasion [12].

Nylige undersøgelser har vist, at TNF-α forøger TGF β-medieret EMT i lungekræft /epitelceller [13], [14], [15], hvilket tyder på de potentielle crosstalks mellem disse signaler. Men lidt om de molekylære begivenheder, hvordan disse signaler orkestreret at modulere EMT. Vi har tidligere vist, at TGF-β inducerer EMT i A549 lung adenocarcinomceller [16], som huser et aktiverende K-ras-mutation og danne en tumor med veldifferentieret adenocarcinom histologi når subkutant injiceret i immunokompromitterede mus [17], [18] . I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de underliggende mekanismer af EMT medieret af TGF-β og TNF-α i A549-celler. På jagt efter målet gener og miRNA, vi udførte omfattende udtryk analyser i kombination med in silico screening. Disse data afgrænset delmængder af gener differentielt eller samvirkende reguleres af TGF-β og TNF-α, og identificeret MIR-23a som miRNA mål af TGF-β. Disse analyser yderligere indebar muligheden for, at en delmængde af TGF-beta målgener kunne reguleres af miRNA, belyse kompleksiteten af ​​molekylære begivenheder fremkaldt af TGF-β og TNF-α i lunge kræftceller.

Materialer og Methods

Reagenser og antistoffer

TGF-β1 og TNF-α blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og R 0,05 (t-test)

Næste undersøgte vi effekten af ​​TβR-I-hæmmer, LY-364.947. Blokade af endogen TGF-β-signalering af LY-364.947 resulterede i ensartet terningformet cellemorfologi, og virkningen af ​​exogent TGF-β blev klart ophævet i nærvær af LY-364.947. På den anden side blev TNF-α-medieret celle morfologisk ændring stadig observeret, omend i mindre grad, i cellerne forbehandlet med LY-364.947, der indikerer effekten af ​​TNF-α alene udøves i fravær af endogen TGF-β signalering (figur 1A, underpanel).

Disse morfologiske ændringer blev kvantificeret ved måling af cellen cirkulariteten (figur 1B). I cellerne costimulated med TGF-β og TNF-α blev celler cirkularitet markant reduceret, hvilket tyder på synergieffekt på cellemorfologi. I nærvær af LY-364.947, deres virkninger var hovedsagelig inhiberet, hvilket indebærer den kritiske bidrag af TGF-β til den observerede synergieffekt.

Processen med EMT ledsages af nedregulering af E-cadherin og opregulering af N -cadherin, som betegnes som cadherin switch [1], [2]. I de følgende eksperimenter undersøgte vi ekspressionen af ​​E-cadherin og N-cadherin, som epitel- og mesenchymale markører hhv. E-cadherin ekspression blev det meste ophævet ved TGF-β behandling mens TNF-α alene viste en marginal effekt på E-cadherin nedregulering på proteinniveau (figur 1C). Overensstemmelse med ændringen i E-cadherin ekspression, N-cadherin opreguleret ved behandling med TGF-β eller TNF-α. Endvidere i overensstemmelse med den dramatiske ændring i cellemorfologi, TNF-α forstærkede virkningen af ​​TGF-β på epitel /mesenkym markører. Virkningen af ​​TGF-β på ekspressionen af ​​E-cadherin /N-cadherin blev inhiberet af LY-364.947 henviser TNF-α-medieret opregulering af N-cadherin også blev observeret uanset LY-364.947 behandling.

EMT er ledsaget med forbedring af protease aktiviteter, som letter nedbrydning af basalmembran og ekstracellulære matrixer (ECM) omgivende tumorceller, hvilket er kritisk for tumor invasion /metastase. For at analysere proteolytiske aktiviteter af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) i cellerne behandlet med TGF-β og /eller TNF-α, udførte vi gelatinezymografi (figur 1D). TGF-β forstærkede aktiviteten af ​​MMP-2, mens TNF-α forbedret den for MMP-9. Især costimulation med TGF-β og TNF-α drastisk fremmet aktiviteter både MMP-2 og MMP-9, hvilket tyder på synergieffekt kan forbedre MMP aktiviteter. I nærvær af LY-364.947, blev virkningen af ​​TGF-β tydeligt inhiberet, mens effekten af ​​TNF-α kan forbedre MMP-9-aktivitet blev stadig observeret omend i mindre grad, i fravær af endogen TGF-β-signalering.

for at undersøge den funktionelle aspekt af EMT, vi udførte invasion assay, der udnytter kamre belagt med Matrigel, efterligner basalmembranen. TGF-β eller TNF-α behandling resulterede i let øget antal invaderende celler på undersiden af ​​kamrene, hvorimod costimulation med TGF-β og TNF-α førte til øget invasive kapacitet, efter aftale med de ovenfor observerede ændringer (figur 1E). TGF-β behandling undladt at forbedre invasive kapacitet så robust som ændringerne i EMT markører, hvilket tyder på, at ændringer i markører ikke er direkte knyttet til celle invasiv. Processen for invasion indbefatter forøget cellemotilitet og proteolytiske aktiviteter. Sammen med resultaterne af gelatinezymografi, øget invasive kapacitet i cellerne costimulated med TGF-β og TNF-α viste sig at være relateret til forbedrede MMP aktiviteter.

Tilsammen blev TGF-β-medieret EMT klart forbedret af TNF-α som bedømt ved cellemorfologi, EMT markører, gelatine lysis og celleinvasion. TNF-α alene kunne også inducere en del af disse ændringer, selv i nærvær af LY-364.947, såsom N-cadherin opregulering og MMP-9-aktivering. Disse observationer fik os til at udforske de mulige crosstalks mellem TGF-β og TNF-α, og molekylære begivenheder, der regulerer EMT i A549 celler.

TGF-β-medieret EMT er Smad-afhængig

Smads er den største transducer af TGF-β-signalering; Smad2 og Smad3 fosforyleres af TβR-I, og danner komplekser med Smad4. Disse komplekser akkumuleres i kernen og regulere transkription af målgener [20]. Udover Smad-medieret transkription, TGF-β aktiverer andre signalering kaskader, herunder MAPK (mitogenaktiveret proteinkinase) veje [21].

For at undersøge om Smad-medieret signalering er involveret i reguleringen af ​​EMT i A549 celler, vi bankede ned endogen Smad4, som er almindeligt kræves til Smad transkriptionel regulering. Transfektion af siRNA effektivt tavshed Smad4 ekspression (figur 2A, venstre), og undertrykkes yderligere ekspressionen af ​​Smad-regulerede målgener af TGF-β, såsom Smad7 og PAI-1 (plasminogenaktivator-inhibitor-1, også kendt som

SERPINE1

) (figur 2B). I denne indstilling, TGF-β undladt at nedregulere E-cadherin som vurderet ved kvantitativ RT-PCR (figur 2A, højre), hvilket antyder, at TGF-β-medieret EMT hovedsageligt reguleret ved Smad pathway. Disse virkninger blev yderligere bekræftet ved immunoblotting. TGF-β undladt at nedregulere E-cadherin eller opregulere N-cadherin effektivt som kontrol siRNA transficerede celler, når endogene Smad4 blev stille (figur 2C).

(A-B) A549-celler blev transficeret med siRNA’er for Smad4 ( si Smad4), eller negativ kontrol-siRNA’er (si NTC) og dyrket i 48 timer. Cellerne blev yderligere dyrket med 5 ng /ml TGF-β1 og /eller 10 ng /ml TNF-α i 2 timer (B) eller 24 timer (A), og RNA blev opsamlet. Kvantitativ PCR blev udført for Smad4, E-cadherin, Smad7 og PAI-1 ved det angivne tidspunkt. Ekspression blev normaliseret med den for GAPDH. Fejllinjer: SD. (C) Cellelysater blev opsamlet 48 timer efter TGF-β1 og /eller TNF-α behandling. Immunoblotting blev udført for E-cadherin, N-cadherin og Smad4. α-tubulin blev anvendt som lastning kontrol.

TNF-α phosphorylerer Smad2 Linker Region

R-Smad og Smad4 indeholder bevaret N-terminale MH1 og C-terminale MH2 domæner, flankerende linker-segmentet. Ligand-induceret interaktion af R- Smads med aktiverede TβR-I resulterer i direkte fosforylering af C-terminal SSXS motiv [20], som er den vigtigste begivenhed af Smad aktivering. Desuden andre kinase veje yderligere at regulere Smad signalering via fosforylering af linker-regionen af ​​R- Smads [21], [22]. Udover NFKB-signalering, er TNF-α vides at fremkalde MAPK pathways, som bestod af tre underfamilier, dvs. ekstracellulært signal-reguleret kinase (Erk) 1 og 2, p38 MAPK og c-Jun N-terminal kinase (JNK).

for at udforske potentialet graduering af Smad signalering af TNF-α, vi undersøgte phosphorylering af de C-terminale eller linker regioner i R-Smads. TGF-β stærkt fremkaldte phosphorylering af Smad2 og Smad3 C-terminale regioner hvorimod TNF-α viste ikke nogen virkning. På den anden side, TNF-α stimulering førte til phosphorylering af linker-regionen af ​​Smad2, uanset TGF-β stimulering (figur 3A).

(A) A549-celler blev stimuleret med TGF-β1 og /eller TNF-α i 60 minutter og immunoblotting blev udført i alt Smad2, phosphoryleret Smad2 (linker region: Ser 245/250/255), phosphoryleret Smad2 (C-terminale region: Ser 465/467), total Smad3, phosphoryleret Smad3 (C- terminale region: Ser 423/425). (B) A549-celler blev forbehandlet med DMSO eller kemiske inhibitorer (LY-364.947, U0126, SP600125 og SB203580) i 60 minutter, efterfulgt af TNF-α-stimulering. Cellelysaterne blev opsamlet ved angivne tidspunkter, og immunoblotting blev udført i Smad2, phosphoryleret Smad2 (linker region: Ser 245/250/255), Erk, phosphoryleret Erk, p38, phosphoryleret p38 og phosphoryleret c-Jun. α-tubulin blev anvendt som lastning kontrol.

Næste vi yderligere søgt at belyse hvilke kinase er involveret i TNF-α-medieret fosforylering af Smad2 linker region, ved hjælp af kemiske inhibitorer såsom LY-364.947, U0126 , SP600125 og SB203580 (figur 3B). TNF-α-stimulering førte til phosphorylering af Erk, p38 og c-Jun, et substrat af JNK. TNF-α stimulation fremkaldte også fosforylering af linker af Smad2 i 30-120 min, nåede et højdepunkt på 60 min. LY-364.947 undladt at afskaffe denne retning viser virkningen af ​​TNF-α uafhængig af TβR-I kinaseaktivitet. Af de testede inhibitorer, blev TNF-α-medieret Smad2 linker phosphorylering ophævet ved U0126, en MEK-inhibitor som også kunne afskaffe phosphorylering af Erk, en nedstrøms substrat af MEK. JNK-inhibitor, SP600125 afskaffet phosphorylering af c-Jun, en nedstrøms substrat af JNK, og inhiberede delvist Smad2 linker phosphorylering. P38 MAPK inhibitor, SB203580 undladt at påvirke Smad2 linker phosphorylering ved den viste koncentration at være effektiv i tidligere rapporter.

Disse resultater antydede, at TNF-α fremkalder phosphorylering af Smad2 linker region, som kan modulere Smad-reguleret gen transkription [22]. Denne virkning syntes at være overvejende medieret af MEK-Erk-vejen og sandsynligvis JNK kan også spille en rolle, om end i mindre grad (figur 3B).

microarray analyse Viser Differential genregulering af TGF-β og TNF α

for at opnå omfattende indsigt i de transkriptionelle forandringer på TGF-β og /eller TNF-α behandling, genekspression profilering blev udført. Total RNA blev fremstillet fra A549-celler behandlet med TGF-β og /eller TNF-α i 2 timer eller 24 timer, og blev yderligere analyseret ved microarray analyse (figur 4A). De udskrifter induceret 1,5-fold eller undertrykt. 0,67 gange, herunder dem, der ikke kommenteret, blev opført i File S1 og File S2 (data på 2 timer og 24 timer, henholdsvis)

(A ) Scatter plot repræsentation af transkripterne i prøverne behandlet med TGF-β1 og /eller TNF-α i 2 timer eller 24 timer (Y-akse), sammenlignet med dem af ustimuleret kontrol (X-aksen). Transkripterne er plottet ved anvendelse log2 normaliserede data. Tærsklen på transkriptniveauer blev indstillet som induceret 2,0-fold eller undertrykt 0,5-fold, og er angivet i hver punktdiagram. (B) Venn diagram, der viser overlapningen mellem gener opreguleres (Op) eller nedreguleret (Ned) af TGF-β1 og /eller TNF-α behandling i 2 timer eller 24 timer. Tærsklen på transkriptniveauer blev indstillet som induceret 2,0-fold eller undertrykt 0,5-fold. Tallene angiver antallet af kommenterede gener. (C) Scatter plot repræsentation af modne miRNA i prøverne behandlet med TGF-β1 og /eller TNF-α i 24 timer (X-akse), sammenlignet med dem af ustimuleret kontrol (Y-aksen). Tærsklen på miRNA niveauer blev fastsat som induceret 2,0-fold eller undertrykt 0,5-fold, og er angivet i hver punktdiagram. (D) Kvantitativ RT-PCR for moden MIR-23a. A549, blev H441 og BEAS2B celler behandlet med TGF-β1 i 24 timer. Ekspression blev normaliseret til den for U6. . Fejllinjer: SD

For yderligere analyse, vi har sat grænsen for transkriptniveauer som induceret 2,0-fold eller undertrykt 0,5-fold, og udelukkede fremavlet udskrifter. Således identificerede vi gener med ændret ekspression sammenlignet med ustimuleret kontrol, i 3 sammenlignende sæt, dvs. TGF-β-stimulerede TNF-α-stimulerede og TGF-β /TNF-a-stimulerede grupper (figur 4B).

Som en generel tendens, TGF-β-reguleret og TNF-a-regulerede gener var stort set eksklusiv, viser differentiel regulering af gentranskription. Desuden blev opreguleres gener identificeret meget mere end de nedreguleres. Generne induceret af TNF-α var mere fremtrædende end TGF-β på 2 timer, mens antallet af gener opregulerede af TGF-β var meget større ved 24 h sammenlignet med dem på 2 timer, eller dem af TNF-α. Efter 24 timer var der en fraktion af gener, der var op- eller nedreguleret af TGF-β og TNF-α co-stimulering, men ikke nogen af ​​dem.

Næste anvendte vi de offentliggjorte datasæt af microarray, der var udført i A549 celler stimuleret med TGF-β [23], [24]. I betragtning af induktion . 2.0 gange så stor, vi udvindes potentielle TGF-β målgener almindeligt induceret i tre uafhængige undersøgelser, dvs. 17 gener på 2h og 129 gener på 24 timer, som er vist i File S3

undergrupper af Genes Differentielt eller samvirkende Reguleret af TGF-β og TNF-α

Adskillige transkriptionsfaktorer er impliceret i den transkriptionelle repression af E-cadherin, herunder

SNAI1

(Snail),

SNAI2

(Slug),

ZEB1

,

ZEB2

og

TWIST1

[25], [26]. Af disse

SNAI1

blev hurtigt induceret af TGF-β på 2 h mens TNF-α snarere undertrykt det, hvilket indebærer den differentierede mekanismer til regulering af EMT. Efter 24 timer blev E-cadherin (

CDH1

) klart nedreguleret af TGF-β (0,27 gange), mens den undertrykkende virkning af TNF-α var beskeden (0,78 gange). I overensstemmelse, TGF-β og TNF-α opreguleres ekspressionen af ​​N-cadherin (

CDH2

) op til 2,32 gange og 1,47 gange, respektivt. Den synergistiske virkning af TGF-β og TNF-α blev også observeret med hensyn til transkriptionel regulering af

CDH1

og

CDH2

, i overensstemmelse med resultaterne i figur 1.

Endvidere er de gener opreguleres mere end 3,0 gange ved 2 timer eller 24 timer blev underklassificeres og anført i tabel 1 og 2, ifølge de kendte funktioner. Som et akut respons ved 2 timer, TNF-α kraftigt inducerede en række cytokiner /chemokiner såsom

CCL2

(MCP-1),

CCL5

(RANTES),

CCL20

,

CXCL1

,

CXCL8

(IL8),

IL1A

,

IL1B

IL6

. Signaling komponenter af TNF-α-NFKB sti blev også opreguleret herunder

TNF

,

TRAF1

,

NFKB1

,

NFKBIA

og

NFKBIE

. Desuden celleadhæsionsmolekyler såsom

VCAM1

og

ICAM1

blev induceret. På 2 timer efter stimulering, TGF-β inducerede begrænset antal gener, herunder de kendte direkte mål som

SMAD7

HEY1

. Ved 24 timer, TGF-β stimulering førte til forøget ekspression af forskellige gener, der kategoriseres som (i) regulator af små GTPase, (ii) celleadhæsionsmolekyle, og (iii) ECM, hvorimod TNF-α stimulation kun gav mindre indvirkning på dem.

Regulatorer af små GTPase inkluderet guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) såsom

RASGRP1

,

RASGRP3

,

RASGRF2

,

DOCK2

og

DOCK4

, som aktiverer Ras, Rac og Rap1, samt medlemmerne af Rho familie GTPaser såsom

RND1

RHOU

. Cellemotilitet og morfologiske ændringer reguleres af små GTPaser såsom Ras, Rac, Cdc42 og Rho familier, hvilket kan moduleres nedstrøms for TGF-β signalering [27].