PLoS ONE: Den Novel ubiquitinligase Complex, SCFFbxw4, interagerer med COP9 signalosom i en F-Box afhængig måde, er muteret, Lost og Under-Udtrykt i Human Cancers

Abstrakt

Identificering af nye proteiner, der kan potentielt bidrage til carcinogenese er en forudsætning venture. Heri rapporterer vi den første biokemiske karakterisering af romanen F-box og WD40 indeholder protein, FBXW4. Vi har identificeret interagerende protein partnere og viste, at FBXW4 er en del af et ubiquitin ligase kompleks. Endvidere Fbxw4 locus er en fælles lokalitet af proviral indsættelse i en række forskellige retrovirale insertionsmutagenese murine kræftmodeller og Fbxw4 mRNA udtrykkes stærkt i involuting murine mælkekirtel. Til at begynde at karakterisere den biokemiske funktion af Fbxw4, brugte vi proteomisk analyse at vise, at Fbxw4 interagerer med Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), Ring-box1 (RBX1) og alle komponenter i COP9 signalosom. Alle disse interaktioner er afhængige af et intakt F-box-domænet af Fbxw4. Endvidere Fbxw4 er stand til at interagere med ubiquitinerede proteiner i celler i en F-box afhængig måde. Endelig viser vi, at FBXW4 er muteret, tabt, og under-udtrykt i en række humane cancercellelinier og prøver kliniske patientprøver. Vigtigere, ekspression af FBXW4 korrelerer med overlevelse af patienter med ikke-småcellet lungekræft. Tilsammen foreslår vi, at FBXW4 kan være en roman tumor suppressor, der regulerer vigtige cellulære processer

Henvisning:. Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage H, Beverly LJ (2013) Romanen ubiquitinligase Kompleks, SCF

Fbxw4, interagerer med COP9 signalosom i en F-Box afhængig måde, er muteret, Lost og Under-Udtrykt i Human kræftformer. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10,1371 /journal.pone.0063610

Redaktør: Deanna M. Koepp, University of Minnesota, USA

Modtaget: Februar 21, 2013; Accepteret: April 5, 2013; Udgivet: Maj 2, 2013 |

Copyright: © 2013 Lockwood et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH), Molecular Mål COBRE, 8P20GM103482-10 (til LJB), Wendy Will Case Cancer Fund, GB220413 (til LJB), Kosair Pediatric Cancer Research Program award (til LJB). Dette arbejde blev også støttet af NCI Cancer Center support tilskud P30 CA08748 til Microchemistry og Proteomics Core Laboratory (til HEB), Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Dette arbejde blev også støttet, delvist af NIH Grant P01 CA94060 og PA1 CA129243-01 (til Harold Varmus) og NIH murene NCI og NHGRI midler (til Harold Varmus). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ubiquitinligase komplekser katalyserer konjugeringen af ​​ubiquitin på substratproteiner [1]. Ubiquitinering af proteiner kan have en række virkninger på proteinfunktion med den bedste velundersøgte er reguleringen af ​​proteinstabilitet [2]. Ubiquitinligase komplekser (også kaldet E3 ubiquitin ligaser) interagerer med en E1 (ubiquitinaktiverende enzym), og et E2 (ubiquitin-konjugerende enzym) [1]. De E1 og E2-enzymer er generelt deles mellem mange E3 ligaser og E3 komponent er specificiteten faktor, der interagerer direkte med substrat proteiner. En type E3 ubiquitin ligase kompleks, SCF ubiquitin ligase kompleks, indeholder Skp1, Cullin1, ring-box1 og hvis et af mere end halvfjerds F-box-holdige proteiner kodet i genomerne af højere eukaryoter [3], [4]. F-box-domænet er ansvarlig for direkte interaktion med Skp1, hvorimod de andre områder, der er indeholdt i proteinet er ansvarlige for at interagere med og bringe substratproteiner i nærhed af ubiquitin ligase [5]. Vigtigere, er flere F-boksens indeholdende proteiner godt karakteriseret til at spille direkte roller i tilblivelsen af ​​menneskelige kræftformer [6], [7], [8], [9], [10]. For eksempel mutationer, der fører til et tab af funktion af FBXW7 eller BTRCP føre til stabilisering af deres beslægtede substratproteiner, Notch, MYC og cyclin eller Beta Catenin, henholdsvis, som alle er velkendte onkogener [6], [9] [11], [12], [13], [14], [15].

COP9 signalosom er en mega-dalton størrelse kompleks bestående af mindst otte proteiner oprindeligt identificeret gennem en genetisk skærm i Arabidopsis [16], [17]. Den COP9 komplekset er kendt for at regulere en række ubiquitinligase komplekser. Den nøjagtige mekanisme, ved hvilken COP9 regulerer funktionen af ​​ubiquitinligase komplekser er ikke fuldstændig forstået, men er blevet foreslået at regulere interaktionen mellem f-box-proteiner og Skp1 ved at regulere konjugation af lille protein nedd8 til Cullin1 [18], [19 ]. Denne cyklus af neddylation /de-neddylation letter ubiquitinligase-substrat interaktion og efterfølgende omsætning på substratet. Således har aktiviteten af ​​mange af disse ubiquitinligase komplekser vist sig at kræve interaktion med COP9 signalosom for korrekt funktion. Interessant er multiple komponenter af COP9 signalosom vides at have COP9-uafhængige funktioner og er blevet vist at bidrage til kræft [20], [21], [22].

FBXW4 locus blev oprindeligt kortlagt som region på human kromosom 10, som var den kausale locus i benet misdannelse uorden split hånd og fod 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 er en defekt i udviklingen af ​​den apikale ectodermale højderyg under dannelsen lemmer, der forårsager aplasia af de centrale cifre fører til, i de mest alvorlige tilfælde, kun to cifre pr lemmer [27], [28]. Efterfølgende blev det også konstateret, at Fbxw4 var også locus ansvarlig for en spontan mus udviklingsmæssig defekt, der lignede SHFM3 hos mennesker [29]. En vifte af publikationer, der hævder, at ændring af FBXW4 er ansvarlig for defekter, efterfulgt af publikationer, der tyder på opstrøms locus koder FGF8 kan være synderen [30], [31]. Til dato har nogen tilfredsstillende data unclouded problemet.

Uanset om FBXW4 kausalt bidrager til SHFM3, der endnu ikke molekylære eller biokemisk funktion er blevet tilskrevet FBXW4. Ved at kombinere data mining, udtryk undersøgelser, proteomics og biokemi er vi begyndt at udvide vores viden om FBXW4. Vi viser, at Fbxw4 er en del af en ubiquitinligase kompleks indeholdende Skp1, Cullin1, Rbx1 og COP9 signalosom. Samling af dette kompleks er afhængig af F-box-domænet af Fbxw4. Vigtigt er det, viser vi, at FBXW4 locus almindeligt slettes, under-udtrykt og somatisk muteret i humane kræftformer. Desuden faldt FBXW4 udtryk korrelerer med dårlig overlevelse af ikke-små patienter celle lungekræft. Taget sammen, vi hypotesen, at FBXW4 kan være en unappreciated tumorsuppressor i humane maligniteter i kraft af dets evne til at regulere funktionen af ​​kritiske signalveje.

Materialer og metoder Salg

rt-PCR-analyse af Fbxw4 udtryk

QRT-PCR blev udført på den ‘mus normale væv qPCR panel jeg fra Origene kat. # MNRT101 (Rockville, MD, USA) ved hjælp Sybr Green fra Applied Biosystmes (Foster City, CA, USA) med de medfølgende GAPDH oligoerne og »3 mus Fbxw4 rt ‘5’-GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3′ med ‘5 mus Fbxw4 ATG” 5 ‘-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3 “eller” 5 mus Fbxw4 rt’ 5’GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3 ‘og’ 3 mus Fbxw4 ingen stop “5′-TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3 ‘.

plasmidkonstrukter

Fbxw4 og Fbxo46 konstruktioner blev indkøbt fra Origene (Rockville, MD, USA) og anvendt som PCR-templates. (. Fbxw4 cat # MMM1013-7512491; Fbxo46 cat # MMM98477851.). Fbxo46 blev amplificeret med følgende oligoer anvendelse af Vent-DNA-polymerase (NEBL, Ipswich, MA, USA): MUS Fbxo46 ATG RI, 5’GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 ‘; MUS Fbxo46 ingen stoppe Sall, 5’GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 ‘. PCR amplificerede fragmenter blev klonet ind i TOPO stumpe kloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Fuldlængde Fbxo46 blev derefter spaltet med EcoRI og Sall og klonet ind pBABE-FLAG vektor, spaltet EcoRI og Xhol, som indeholder en 3’-FLAG-epitopmærke nedstrøms og i ramme fra XhoI-stedet, er FLAG-epitopen derefter efterfulgt af stopkodoner og et Sall-sted. Fbxo46 med en 3’i ramme FLAG-mærke blev derefter spaltet fra pBABE med EcoRI og Sall og klonet i EcoRI og Xhol-stedet i retrovirusvektoren MIGRX.

Fbxw4 blev amplificeret fra origene klon med Vent DNA polymerase med følgende oligoer: MUS Fbxw4 ATG RI, 5’GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 ‘; MUS Fbxw4 flag stoppe XhoI, 5’GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 ‘. PCR amplificerede fragmenter blev klonet ind i TOPO stumpe. Fuld længde Fbxw4 indeholdende en i-ramme 3 ‘FLAG tag blev derefter isoleret ved fordøjelse EcoRI og Xhol. Dette fragment blev derefter klonet ind i EcoRI- og Xhol-stederne i MIGRX

Fbxw4

-fbox blev amplificeret fra fuldlængde Fbxw4 TOPO klon under anvendelse af følgende oligoer:. Fbxw4 flag stoppe Xhol, 5’GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 ‘, mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3’. Det PCR-amplificerede fragment blev klonet ind i EcoRI- og Xhol-stederne i MIGRX.

pRK5-HA-Ubiquitin Addgene # 17608 deponeret af Ted Dawson [32].

Cellekultur

293 T-celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS. DNA transfektioner i 293 T-celler blev udført ved anvendelse af PEI, i et forhold på 2,5 mikrogram PEI /mikrogram DNA. Alle celleekstrakter blev fremstillet ved at følge skraber høst af 293 T-celler ved anvendelse CHAPS lysepuffer (1% CHAPS detergent, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7, 5 mM EDTA). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse BCA proteinassay reagens fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) cat # 23225. 30 ug totalt protein blev anvendt til standard Western blot procedure. Kemiluminescerende påvisning blev udført ved anvendelse SuperSignal WestFemto fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.

Immunopræcipitationer

200 ug protein blev inkuberet i 400 ul af totale CHAPS puffer og inkuberet med 15 ul af angivne affinitetsmatrix i en time ved 4 grader Celsius. Efter inkubering blev matrixen vasket tre gange i CHAPS-buffer og derefter SDS loading buffer blev tilsat direkte til vaskede matrix, kogt og påført direkte i brøndene på en PAGE-gel. Drug behandlinger blev udført som beskrevet i teksten ved hjælp 25 uM MG132.

Antistoffer

tubulin # B512, FLAG M2 konjugerede agaroseperler, FLAG poly-klonal # F7425 (Sigma, St. Louis, MO, USA); HA affinitetsmatrix og HA # 3F10 (Roche, Indianapolis, IN); Ubiquitin # 3933 (cellesignalering Technologies, Beverly, MA, USA); SKP1 kat. # Ab10546 og COPS2 /TRIP15 kat. # Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, USA); COPS5 /JAB1 kat. # Sc-9074 (Santa Cruz bioteknologi, Santa Cruz, Californien, USA).

Immunopræcipitation og Protein Identifikation af nano-Liquid kromatografi par til Tandem-massespektrometri (LC-MS /M)

10-150 mm plader af 293-t-celler blev transient transficeret under anvendelse Fugene6, jævnfør producentens protokol (Roche, Indianapolis, IN). 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet ved skrabning i kulden. CHAPS lysater blev fremstillet og kvantificeret som beskrevet ovenfor. 50 mg totalt lysat blev inkuberet med FLAG konjugeret agaroseperler (Sigma, St. Louis, MO, USA) natten over ved 4 grader med blid vuggende. Agaroseperler blev sat til en søjle og vasket med 10 gange søjlevolumenet af tyngdekraften flow. Kolonnen blev dækket og 1 perle lejevolumen FLAG-peptid (opløst i PBS ved en koncentration på 5 mg /ml og derefter fortyndet 1:10 i CHAPS buffer) blev tilsat til søjlen og inkuberes i 30 minutter ved 4 grader. Hætten blev fjernet, og -100 ul fraktioner blev opsamlet som elueringen strømmede igennem ved hjælp af tyngdekraften. 50% af hver fraktion (-5 fraktioner) blev western blottet med anti-FLAG-antistof. Typisk den første fraktion var blottet for målproteinet og enten fraktion 2 eller 3 havde hovedparten af ​​målproteinet. ~ 40% af fraktionen indeholdende størstedelen af ​​FLAG-mærke oprensede protein blev delvist løst ved hjælp af SDS-polyacrylamidgelelektroforese; blandingerne blev koncentreret i en enkelt, 3-mm bred “stak” ved elektroforese gennem en SDS “stacking gel ‘indtil indtaste” adskillelse gel «, efterfulgt af kort farvning med Coomassie Blå og udtagelse af stablede protein band. Prøveforberedelse og massespektrometri blev udført nøjagtigt som beskrevet tidligere [33].

Scaffold (Proteome Software Inc., Portland, OR), udgave 3_6_1 blev anvendt til yderligere at validere og på tværs af tabulate MS /MS-baseret peptid- og protein-identifikationer. Protein og peptid sandsynlighed blev fastsat til 95% med et krav om en peptid minimum.

Resultater

Fbxw4 er en fælles hjemmeside for provirale indsættelse og udtrykkes variabelt i normale murine væv

identifikation og karakterisering af nye gener og genprodukter har ført til en overvældende mængde af offentligt tilgængelige data og datasæt. Vi spekulerede på, om minedrift disse tilgængelige datasæt kunne producere hypotese-generering observationer omkring potentielt interessante gener. En sådan database er “retroviral mærkede kræft-gen-database«, som er en samling af provirale indsættelse sites kloner fra forskellige forskere søger efter nye gener, der kan bidrage til leukemogenesis (og for nylig transposon-medieret mutagenese studier i hæmatopoietisk og solide maligniteter). Almindelige steder af proviral integration loci, der giver en selektiv fordel til cellerne ved disregulating ekspression af cellulære gener. Som støtte, de fleste af de mest almindelige steder for provirale indsættelse er bona fide onkogener eller tumor undertrykkere. Vi forespørges denne database og fandt, at Fbxw4 genlocus var den eneste locus i 30 hyppigst identificerede insertion loci, der ikke er foreslået at spille en rolle i cancer eller blevet biokemisk karakteriseret. Der har været til dato 13 insertionssteder klonet fra inden det kodede Fbxw4 genet og insertioner er blevet klonet i både fremad og revers orientering (figur 1A). Disse data kan antyde, at proviral indsættelse i locus kan føre til tab af Fbxw4 funktion.

A. Undersøgelse af UCSC genom browser (genome.ucsc.edu) og Retroviral Tagged Cancer Gene Database (https://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) viser, at flere retrovirale insertioner er blevet klonet fra det indre af transkriberet Fbxw4 locus. Pile indikerer retningen af ​​de indsatte provirus. Exonerne er vist ved bunden og positionen og omfanget af murint kromosom 19 er vist på toppen. Navne givet til de klonede provirale indsættelser er angivet til venstre. Indsættelsessteder begynder med “MMT ‘blev klonet fra musebrysttumorvirus inducerede brystcarcinomer. Indsættelsessteder begynder med ‘DKM’, ‘248’ og ‘B5’ blev klonet fra leukæmier fra murine leukæmi virus accelererede bloddannende kræftformer. B. FBXW4 er variabelt udtrykt i normal murine væv. Oligoer specifikke for murint Fbxw4 blev anvendt til at udføre kvantitativ RT-PCR på “muse normale cDNA TissueScan matrix ‘. Værdier blev normaliseret til kvantitativ RT-PCR for GAPDH. C. Skematisk af Fbxw4 protein. Tal repræsenterer aminosyrerne i proteinet. Domæner indeholdt i Fbxw4 er vist.

Det faktum, at Fbxw4 aldrig er blevet karakteriseret fået os til at undersøge ekspressionen af ​​dette locus i flere detaljer. Først skal vi bestemt, hvad udtrykket mønster af Fbxw4 mRNA er på tværs normale murine væv. Anvendelse af cDNA fremstillet fra forskellige musevæv vi observeret en slående grad af ekspression specifikt i involuting mælkekirtlen (figur 1B). Dette antyder muligheden for, at Fbxw4 udtryk øges og kan bidrage under en apoptotisk proces.

Fbxw4 interagerer med komponenter af en E3 ubiquitinligase og COP9 signalosom

Et protein motiv algoritme viser, at Fbxw4 proteinet indeholder en F-box-domænet, et motiv, der normalt er impliceret i interaktionen med en E3 ubiquitin ligase kompleks og fem WD-40 motiver, som er ved protein-protein-interaktion moduler (figur 1C). På trods af den genetiske arbejde udføres på Fbxw4 locus, har der ikke været nogen undersøgelser der undersøger den biokemiske funktion af Fbxw4. Som et første forsøg på at forstå den mulige funktion af Fbxw4 vi udførte immunopræcipitation på FLAG-mærket Fbxw4 efterfulgt af massespektrometri til at identificere, i en saglig måde, Fbxw4 interagerende proteiner (figur 2A). To kontroller blev udført for at hjælpe med fortolkning af data; immunopræcipitation af cellelysater kun udtrykker FLAG-epitopmærke (CONT.) eller immunpræcipitering af cellelysater udtrykker et FLAG-mærket F-box “kun” indeholder protein (Fbxo46) blev udført. Data fra disse forsøg viste, at Fbxw4, og ikke styre, immunopræcipiterede komponenter i en E3 ubiquitinligase (SKP1 og CUL1) og komponenter af COP9 signalosom, hvorimod både F-boks med proteiner interageret med SKP1. Interessant nok blev en peptid svarende til RBX1 også identificeret i FLAG-immunopræcipitering fra Fbxw4 udtrykker lysater og ikke fra de andre lysaterne (ikke vist)

A. Tabel repræsenterer antallet af unikke peptider identificeret af en enkelt repræsentant massespektrometri eksperiment følgende FLAG immunpræcipitering fra lysater af kontrolceller kun udtrykker FLAG “contr.”, Eller celler, som udtrykker FLAG-Fbxw4 eller FLAG-Fbxo46. Kolonne på venstre angiver størrelsen af ​​det interagerende protein, i kilo-dalton (kDa). Gene navne på proteiner, der indeholder de identificerede peptider er vist i den højre kolonne. Komponenter i en E3 ubiquitinligase kompleks er skygge i lysegrå; komponenter i COP9 signalosom er skraveret mørkegrå. B. Validering af data massespektrometri data efter immunopræcipitation efterfulgt af western blot. 293 T-celler blev transficeret med plasmider indeholdende flag- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 48 timer efter transfektion cellelysater blev fremstillet og immunopræcipitationer blev udført med mono-klonale anti-FLAG-antistoffer (M2) (til at immunpræcipitere Fbxw4- eller Fbxo46-interagerende komplekser). Western blots blev udført for at opdage Fbxw4 eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistof; øverste panel), SKP1, COPS5 eller COPS2. C. Ekspression af Fbxw4 ændrer migration af endogene SKP1 ved gelfiltreringskromatografi. 293 T-celler blev transficeret med en tom vektor (venstre paneler) eller en cplasmid indeholdende FLAG-Fbxw4 (højre paneler). 48 timer efter transfektion cellelysater blev fremstillet og separeret på en superpose6 gelfiltreringssøjle. Western blots blev udført på hver fraktion til påvisning Fbxw4 (toppaneler) eller SKP1 (bundpaneler). I mangel af Fbxw4 SKP1 elueres med en top på fraktion 23, hvorimod når Fbxw4 udtrykkes der er co-eluering af Fbxw4 med toppe ved fraktion 15 og i det tomme volumen. Størrelse standarder, der elueres fra givne fraktioner vist.

For at validere data fra massespektrometri vi udførte immunoudfældninger efterfulgt af western blots med antistoffer specifikke for de identificerede proteiner. Nye lysater blev forberedt som udtrykt enten FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46 eller FLAG kun kontrol (figur 2B). Data viser, at både Fbxw4 og Fbxo46 interagere med SKP1, men kun Fbxw4 interagerer med komponenter af COP9 signalosom.

For yderligere at styrke den konstatering, at Fbxw4 kan interagere med endogen SKP1 vi udførte gelfiltreringschromatografi på cellelysater transficeret med en tom vecotor eller en vektor ekspression FLAG-Fbxw4 (figur 2C). Fraktioner opnået fra kromatografi blev western blottet med anti-SKP1 antistof. Celler, som ikke udtrykker exogent Fbxw4 indeholder SKP1 der eluerer i en fraktion, der svarer til mindre end 67 kDa, hvorimod ekspression af Fbxw4 fører til co-eluering af SKP1 med Fbxw4 i to nye komplekser af over 200 kDa og et kompleks, der eluerer i hulrummet . Den ændrede migration af SKP1 i to nye fraktioner, co-elueres med Fbxw4 understøtter finde Fbxw4 interagerer med komponenter af en E3 ligase kompleks.

Fbxw4 interagerer med SKP1 og COP9 signalosom i en F-box afhængig måde

til at begynde at fastlægge den nøjagtige biokemiske funktion af Fbxw4, vi ønskede at vide, hvilke interaktioner afhang af F-box-domænet. Til dette formål har vi udviklet en FBXW4 konstruktion, der mangler de første 71 aminosyrer, betegnet Fbxw4

-fbox (figur 3A). Igen blev immunpræcipitation efterfulgt af massespektrometri udføres fra cellelysater udtrykker FLAG-Fbxw4, kun flag- Fbxw4

-fbox eller FLAG, at bestemme, hvad proteiner interagerer med de respektive proteiner. Ingen peptider svarende til dele af E3 ubiquitinligase eller komponenter af COP9 signalosom blev identificeret med Fbxw4

-fbox, disse proteiner blev igen fundet at interagere med Fbxw4 (figur 3B). For at validere data fra massespektrometri vi udførte immunoudfældninger efterfulgt af western blots med antistoffer specifikke for de identificerede Fbxw4 interagerende proteiner. Lysater blev forberedt som udtrykt enten FLAG-FBXW4, flag- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 eller FLAG kun kontrol. Data viser, at Fbxw4 og Fbxo46, men ikke Fbxw4

-fbox interagere med SKP1 (figur 3C).

A. Skematisk af Fbxw4

-fbox protein. Tal repræsenterer aminosyrerne i proteinet. Domæner indeholdt i Fbxw4

-fbox er angivet. B. Tabel repræsenterer antallet af unikke peptider identificeret fra et repræsentativt massespektrometri eksperiment følgende FLAG immunpræcipitering fra lysater af kontrol celler, der udtrykker FLAG kun “contr.”, Eller celler, der udtrykker flag- Fbxw4 eller flag- Fbxw4

-fbox. Kolonne på venstre angiver størrelsen af ​​det interagerende protein, i kilo-dalton (kDa). Gene navne på proteiner, der indeholder de identificerede peptider er vist i den højre kolonne. Komponenter i en E3 ubiquitinligase kompleks er skygge i lysegrå; komponenter i COP9 signalosom er skraveret mørkegrå. C. Validering af data massespektrometri data efter immunopræcipitation efterfulgt af western blot. 293 T-celler blev transficeret med plasmider indeholdende FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 48 timer efter transfektion cellelysater blev fremstillet og immunopræcipitationer blev udført med mono-klonale anti-FLAG-antistoffer (M2) (til at immunpræcipitere Fbxw4-, Fbxw4

-fbox- eller Fbxo46-vekselvirkende komplekser). Western blots blev udført for at opdage Fbxw4, Fbxw4

-fbox eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistof; top panel). Eller SKP1

FBXW4 interagerer med ubiquitinerede cellulære proteiner

Vi har endegyldigt vist, at Fbxw4 interagerer med en E3 ubiquitinligase kompleks og COP9 signalosom. Vi postulerede, at Fbxw4 ville interagere med ubqiuitinated proteiner i cellen. Det er kendt, at for mange substrater af E3 ubiquitin ligaser, ubiquitinering af substratproteinet fører til hurtig frigivelse fra komplekset. Vores hypotese derfor, at inhibering af proteasomet ville føre til en ophobning af disse cellulære proteiner ubiquitinerede af Fbxw4 ligase kompleks. Således ophobning af ubiquitinerede proteiner vil til gengæld føre til berigelse af samspillet mellem Fbxw4 og ubiquitinerede substrater. Celler blev transficeret med en tom vektor (v), HA-ubiquitin, eller HA-ubiquitin og FLAG-Fbxw4. 36 timer efter transfektion blev celler behandlet med proteasominhibitor, MG132, i seks timer. Celleekstrakter blev fremstillet og immunudfældet med anti-HA-antistof efterfulgt af western blot for Fbxw4 (figur 4A, øvre panel). En forøget mængde Fbxw4 fandtes at vekselvirke med ubiquitinerede proteiner efter MG132 behandling. Dette Fbxw4 syntes at være den normale molekylvægt antyder en øget sammenslutning af FBXW4 med ubiquitinerede proteiner og ikke en stigning i ubiquitated Fbxw4. Endvidere forøgede mængde Fbxw4 der immunopræcipiteret med anti-HA antiobody ikke skyldtes en stigning i den samlede mængde Fbxw4 da der var et mindre fald i den totale mængde af Fbxw4 følgende MG132 behandling (figur 4A, nedre panel). Som yderligere støtte for denne opfattelse, var der en stigning i de samlede niveauer af ubiquitinerede proteiner og en stigning i mængden af ​​ubiquitinerede proteiner, immunpræcipiteret med Fbxw4 efter immunopræcipitation af Fbxw4 fra de samme lysater følgende MG132 behandling (figur 4A, midterste paneler).

A. Fbxw4 kan immunpræcipiteret ved ubiquitinerede proteiner og Fbxw4 kan immunpræcipitere ubiquitinerede proteiner. 293 T-celler blev transficeret med tom vektor (v), HA-ubiquitin, eller HA-ubiquitin og FLAG-Fbxw4. 36 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med MG132 (+) eller lades ubehandlet (-) i seks timer. Cellelysater blev fremstillet og immunopræcipitationer blev udført med enten anti-HA-antistoffer (top to paneler) eller mono-klonale anti-FLAG-antistoffer (M2) (to paneler). Western blots blev udført på begge sæt immunfældninger med anti-FLAG og anti-HA-antistoffer. B. FBXW4 forbinder med cellulære proteiner, som endogent ubiquitinerede. 293 T-celler blev transficeret med plasmider indeholdende FLAG-Fbxw4, flag- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 36 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med MG132 (+) eller lades ubehandlet (-) i seks timer. Cellelysater blev forberedt og immunopræcipitationer blev udført med mono-klonale anti-FLAG-antistoffer (M2) (til at immunpræcipitere Fbxw4-, Fbxw4

-fbox- eller FBXO46-vekselvirkende komplekser). Western blots blev udført for at opdage Fbxw4, Fbxw4

-fbox eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistof; top panel). Eller Ubiquitin

Vi ønskede at vide, om det ville blive opnået lignende resultater ser ved endogen ubiquitin, i modsætning til overudtrykt HA-ubiquitin. Derudover ønskede vi at bestemme, om de tidligere observerede resultater var afhængige af et intakt F-box-domænet. Til dette formål blev celler transficeret med FLAG-Fbxw4, flag- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 eller FLAG kontrollerer kun vektor (v). Celler blev enten behandlet med vehikel eller MG132 i seks timer og cellelysater blev fremstillet. Immunopræcipitation med anti-FLAG-antistoffer blev udført, og Western blots blev udført for at detektere endogen ubiquitin eller FLAG-mærkede proteiner. Vi observerede en dramatisk stigning i mængden af ​​ubiquitin, der er forbundet med Fbxw4. Dette resultat var ikke blot på grund af overekspression af Fbxw4 da hverken Fbxw4

-fbox eller Fbxo46, der blev udtrykt på højere niveauer, viste en øget interaktion med ubiquitinerede proteiner følgende MG132-induceret hæmning af proteasomet. Disse data viser, at en intakt F-box-domænet er påkrævet for associering Fbxw4 med ubiquitinerede proteiner og ikke alle F-box-holdige proteiner er i stand til så dramatiske øgede interaktioner med ubiquitinerede cellulære proteiner efter inhibering af proteasomet. Selvom interaktionen mellem Fbxw4 og cellulære ubiquitinerede proteiner er afhængig af en intakt f-box-domænet mere arbejde er nødvendigt for at afgøre, om disse proteiner er bona fide substrater af SCFFbxw4 ubiquitinligase kompleks eller blot proteiner, der interagerer med det komplekse gennem alternative mekanismer.

FBXW4 er muteret, fortabt og under-udtrykt i humane kræftformer

for at begynde at løse den mulighed, at FBXW4 er vigtig i human cancer vi undersøgt, om genet er muteret i humane kræftformer. Ved at forespørge tilgængelige offentlige databaser (The Cancer Genome Atlas (TCGA) projekt- og Katalog af somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) fra Sanger Institute) fandt vi, at FBXW4 somatisk er muteret i syv af ~470 tumorer, der har været sekvens, indtil videre (figur 5A). To af mutationerne er tavse og ikke fører til ændringer i aminosyresekvensen af ​​proteinet, men interessant er de fire missense mutationer (R96, G106, R145 og R 367) evolutionært konserverede hele vejen ned til nogle arter af Drosophila. Faktisk blev R96L, G106W og R367C forudsiges at forstyrre proteinfunktion med en meget høj signifikans (p = 0,0003) under anvendelse ProPhylER algoritme. Ud over disse forudsagte skadelige mutationer, en rammeskiftmutation, E245fs *, blev observeret i en brystcarcinoma patient, der ville føre til produktion af en FBXW4 protein, der mangler de sidste tre WD-40 motiver (figur 5A). Konstateringen af, at somatiske mutationer findes i humane kræftformer forventes at forstyrre kritiske aspekter af FBXW4 funktion styrker muligheden for, at FBXW4 regulerer vigtige homøostatiske processer.

A. FBXW4 er somatisk muteret i humane kræftformer. Den Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet og Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) fra Sanger Institute blev forespurgt til somatiske mutationer i FBXW4. Af ~470 tumorer, der blev analyseret for mutation i FBXW4 blev fem somatiske mutationer observeret ved aminosyrerne angivet på skematisk. Interessant er de fire enkelte aminosyrer, der er mål for mutationer (R96, G106, R145 og R 367) evolutionært konserveret i Drosophila. R96L, G106W og R367C forventes at forstyrre protein funktion (signifikans p = 0,0003, hjælp ProPhylER algoritme) og E245fs * mutation producerer et protein, der mangler de sidste to og et halvt WD-49 motiver. B. FBXW4 ofte tabt i humane cancere. Hyppigheden af ​​DNA-kopi nummer tab /sletning tværs 719 menneskelige kræftceller, der repræsenterer forskellige væv af oprindelse fra Sanger Institutes Cancer Genome Project bliver præsenteret sammen med frekvensen i de enkelte typer kræft med n ≥ 5. C. FBXW4 er underexpressed i kræft cellelinier med kopital tab. Box plots illustrerer mRNA ekspressionsniveauer for cellelinier med tab /sletning og dem uden tab /sletning for alle cancercellelinier fra B. med tilsvarende gen ekspression microarray profiler er præsenteret sammen med ekspression i de fire individuelle cancertyper med den højeste frekvens af tab /deletion (hud, bryst, centralnervesystem (CNS) og lungecancer). Ekspressionsniveauer blev sammenlignet mellem de to grupper under anvendelse af Mann-Whitney U-test og en p 0,01 blev betragtet som signifikant. Whiskers repræsenterer 10-90 percentiler med prikker vise outliers. D. FBXW4 går tabt og under-udtrykt i kliniske lunge-adenocarcinom-tumorer fra TCGA projekt.