PLoS ONE: Overekspression af CD151 forudser Prognose i patienter med resektion Gastric Cancer

Abstrakt

Formål

tetraspanin CD151 fungerer som en promotor af metastase og invasion i flere tumorer. Men rollen som CD151 i human gastrisk cancer (HGC) forbliver uklart.

Metoder

Tyve HGC prøver og matches nontumor prøver, humane gastriske epitelceller (HGEC), og fire mavekræft celle linjer blev anvendt til at analysere CD151 ekspression. Short hårnål RNA-medieret nedregulering af CD151-ekspression i HGC celler blev udført for at undersøge, hvilken rolle CD151 i proliferation og metastase /invasion af HGC celler

in vivo

in vitro

. Forholdet af CD151 med integrin α3 i HGC-celler blev undersøgt ved silencing integrin α3 efterfulgt af co-immunpræcipitering og immunfluorescensfarvning. Endelig blev den prognostiske værdi af CD151 og integrin α3 evalueret af immunhistokemi i væv microarrays af 76 HGC patienter.

Resultater

CD151 blev udtrykt ved højere niveauer i HGC væv og HGC celler end i nontumor væv og HGEC celler. Nedregulering af CD151 som vshRNA-CD151 forringet metastaser og invasion af HGC-27 celler, men påvirkede ikke celleproliferation. CD151 dannet et kompleks med integrin α3 i HGC-celler. CD151-cDNA transfektion reddet metastatiske potentiale og invasivitet af HGC-27-vshCD151 celler, men ikke dem af HGC-27-vshintegrin a3 celler

in vitro

. Klinisk blev CD151 overekspression signifikant korreleret med høj TNM stadie, dybde af invasion og positive lymfeknuder (

s Restaurant 0,05), og høje niveauer af integrin α3 var forbundet med store tumorstørrelse, høj TNM fase, dybde af invasion og lymfeknude involvering (

s

0,05). Vigtigt er det, den postoperative 5 års samlet overlevelse af patienter med CD151

lav og /eller integrin α3

lav var højere end for patienter med CD151

høj og /eller integrin α3

højt.

Konklusion

CD151 er positivt associeret med invasiv af HGC, og CD151 eller kombinationen af ​​CD151 og integrin α3 er en ny markør til at forudsige prognosen for HGC patienter og kan være potentielle terapeutiske mål.

Henvisning: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) Overekspression af CD151 forudser Prognose i patienter med resektion mavekræft. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10,1371 /journal.pone.0058990

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada

Modtaget: 7. oktober, 2012; Accepteret: 8. februar 2013; Udgivet: 22 Mar 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af akademiker Workstation Fund af Shaoxing Second Folkets Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Menneskelig mavekræft (HGC) er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Forekomsten af ​​HGC blev anslået til 934,000 tilfælde om året med 56% af nye tilfælde forekommer i Østasien, herunder 41% i Kina og 11% i Japan [2]. Selv om den globale forekomst af GC er faldet i de seneste år, dets dødelighed i Kina er den højeste blandt alle tumorer og repræsenterer 25% af GC dødelighed på verdensplan [3]. Trods de seneste fremskridt inden for kemoterapi og kirurgiske teknikker, den 5-årige samlet overlevelse (OS) sats i Kina er lav ved 40%. De fleste HGC’erne er diagnosticeret på stadium III eller IV, og satsen for lymfeknude metastaser fra GC er høj (50-75%) [4]. Patogenesen af ​​HGC er multifaktoriel, herunder genetisk disposition og miljømæssige faktorer. Adskillige genetiske ændringer er forbundet med prædisposition for HGC, herunder dem, der involverer tumorsuppressorgener, onkogener, celleadhæsionsmolekyler, vækstfaktorer, og genetisk ustabilitet [5]. Derfor opnå en bedre forståelse for de molekylære mekanismer, der er involveret i HGC og identificere værdifulde diagnostiske markører og nye terapeutiske strategier er af stor klinisk betydning.

Tetraspanins er celleoverfladeproteiner, der spænder over membranen fire gange, og er fundet i flere celletyper i mange organismer. De udviser mange egenskaber indikerer deres fysiologiske betydning i celleadhæsion, motilitet, aktivering og spredning, samt deres bidrag til patologiske tilstande, såsom metastaser og patologisk angiogenese [6], [7], [8]. CD151 er et celleoverfladeglycoprotein tilhører tetraspanin superfamilien, der først blev vist at fremme metastase i en undersøgelse, hvor en ukendt antistof, der specifikt inhiberede metastase-dannelse i en human epidermoid carcinom

in vivo

[

9

]. Antistoffet anerkendte CD151 og inhiberede cellevandring uden at påvirke adhæsion eller proliferation. Små interfererende RNA (siRNA) medieret nedregulering af CD151-ekspression i primære melanocytter resulterede i tab af motilitet, mens det havde ringe effekt på steady-state niveauer af integriner. Desuden kunne disse ændringer vendes når CD151 blev re-udtrykt [10]. Overekspression af CD151 blev vist at aktivere integrin og vækstfaktor receptor afhængige signalveje, hvilket resulterede i øget motilitet og invasionsevne af kræftceller [11]. Denne fremgangsmåde blev også foreslået at bidrage til aktivering af veje medieret af små GTPaser, hvilket øger GTP-binding til Cdc42 og Rac, organisatorer af cellecytoskelettet. Adhæsionen-afhængig aktivering af Ras, ERK /MAPK1 /2 og protein kinase B (PKB) /Akt har vist sig at blive moduleret af CD151 [7], [12]. Den brede vifte af funktioner af CD151, og især dets engagement i invasiv og metastase af kræftceller, tyder på, at en bedre forståelse af dens udtryk og rolle i HGC kan være vigtigt.

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte ekspressionen af ​​CD151 i humane gastriske epitelceller (HGEC), HGC cellelinjer, HGC prøver, og tilstødende nontumorous væv. Desuden har vi undersøgt effekten af ​​siRNA dæmpning af CD151 på spredning, invasionsevne og metastatisk evne HGC-27 celler, og undersøgt forholdet mellem CD151 og integrin α3. Endelig blev ekspressionen af ​​CD151 og integrin α3 undersøgt ved immunhistokemi i et væv microarray bestående af 76 tilfælde af HGC, og den prognostiske rolle CD151 og /eller integrin α3 i HGC blev undersøgt.

Materialer og metoder

cellelinier

HGEC og HGC cellelinjer, herunder HGC-27, AGS, MKN28, og MGC803, blev opnået fra American Type Culture Collection og holdes i vores laboratorium. Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C i en befugtet inkubator under 5% CO

2.

Patienter og Opfølgende

Tyve friske tumor prøver fra områder tæt på tumoren margin og matchede ikke-tumorvæv (mere end 3 cm fra tumoren) blev blindt opnået fra konsekutive patienter med HGC, som gennemgik helbredende resektion mellem februar 2009 og november 2010 på Shaoxing Second Folkets Hospital (Shaoxing, Kina). Yderligere 76 patienter med mavekræft, som gennemgik R0 resektioner med udvidet lymfeknude dissektion (D2) fra september 2005 og september 2008 kl Shaoxing Second Folkets Hospital blev indrulleret i denne undersøgelse. Evalueringen af ​​resektion prøver blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den japanske gastrisk Cancer Association (1998). Hver standard resektion involveret fjernelse af gruppe 1 og 2 lymfeknuder (interval 36-60, mener 47,6). Stage klassificering blev udført i overensstemmelse med TNM klassifikationen for HGC (UICC). Prøver blev udvalgt på baggrund af tilgængeligheden af ​​egnede formalinfikserede, paraffinindlejrede væv og komplet clinicopathologic og opfølgende data fra patienterne. Kendetegnene for forsøgspersonerne blev opsummeret i tabel 1. Denne undersøgelse blev godkendt af Shaoxing Second Folkets Hospital Research etiske komité og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle personer. Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi eller strålebehandling før eller efter kirurgi i forbindelse med en adjuvans program. Opfølgning dataindsamling blev afsluttet september 2012. median opfølgning var 43,0 måneder (interval 6-78 måneder). Opfølgende procedurer bestod af foreløbige historie, fysisk undersøgelse, vurdering af tumormarkører (CEA, CA-199), abdominal ultralyd og røntgen af ​​thorax hver 2-3 måned eller CT hver 6. måned. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som intervallet mellem kirurgi og død eller mellem kirurgi og den sidste observation i overlevende patienter. Dataene blev censureret i sidste opfølgning for at leve patienter.

RNA Extraction og Reverse Transcription-polymerase kædereaktion (RT-PCR)

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp af TRI reagens (Sigma) ifølge fabrikantens protokol. RNA blev derefter behandlet med DNasel (Roche Diagnostics), oprenset gennem en RNeasy-søjle (Qiagen) og elektroforese for at bestemme integriteten af ​​RNA før anvendelse i 5′-RACE eksperimenter. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA under anvendelse vilkårlige hexamerer (Proligo) og SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). RT-PCR blev udført på et panel af cellelinier og tumorprøver. Primere anvendt til PCR var som følger: CD151, 5′-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 ‘og 5′-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3′; integrin α3, 5’-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 ‘og 5′-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3′; Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), 5’-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 ‘og 5′-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’. RT-PCR-betingelser var som følger: 10 min ved 94 ° C, denaturering ved 94 ° C i 20 s, annealing ved 59 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 60 s. Ekspressionen af ​​CD151 og integrin α3 forhold til husholdning genet GAPDH blev analyseret ved densitet-analyse under anvendelse Band Scan v5.0 software. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

immunblotting og immunofluorescensassay

Samlet celleekstrakt-protein (30 ug) blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese, overført til polyvinylidendifluorid-membraner og inkuberet med tilsvarende antistoffer. Membranerne blev fremkaldt med den forøget kemiluminescens-metoden (Pierce, Rockford, IL, USA). Muse anti-human CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og anti-integrin a3 monoklonale antistoffer (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​CD151 og integrin α3 henholdsvis . GAPDH (1:5,000, Chemicon, USA) blev anvendt som en intern kontrol. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

HGC-27 celler blev anvendt til at detektere placeringen af ​​CD151 og integrin α3 som tidligere beskrevet [13]. Muse-anti-humant CD151 monoklonalt antistof (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og muse-anti-humant integrin α3 antistof (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) blev anvendt. Skiverne blev analyseret ved fluorescensmikroskopi (Leica Microsystems Imaging Solutions).

Transfektion af lentivirusvektorer med lille Hårnål RNA Against CD151 og Integrin α3

pGMLV /Neo-shRNA-CD151 vektor blev konstrueret ifølge producentens instruktioner (pGMLV, et lille hårnåle-RNA (shRNA) i Vector, Shanghai Genomeditch Co. Ltd). Tre shRNA-CD151 lentivirusvektorer (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) blev genereret at lukke munden udtryk for CD151 i HGC-27-celler (shRNA-CD151-HGC-27). De shRNA targetingsekvenser for CD151 var som følger: # 1, 5′-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 ‘; # 2, 5’-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 ‘; # 3, 5’-CATACAGGTGCTCAA TAAA-3 ‘. Den shRNA målretning sekvens for integrin α3 var som følger: 5’CCTCTATATTGGGTACACGAT-3 ‘(Shanghai Genomeditech, Shanghai, Kina). Stabilt transficerede kloner blev karakteriseret ved RT-PCR og analyseret ved immunoblotting for ekspressionsniveauerne af CD151 og integrin a3 proteiner.

MTT-assay, cellemigrering, og Matrigel Invasion assays Salg

Celler blev podet i 96-brønds plader (2.000 pr 200 pi-brønd) og inkuberet i 24, 48 og 72 timer. En 20 pi volumen MTT-opløsning blev tilsat ved de angivne tidspunkter og inkuberet i 4 timer. Mediet (200 pi DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum) blev derefter erstattet med 150 pi DMSO, blev pladerne rystet i 10 min, og absorbansen ved 490 nm blev målt for at bestemme antallet af levedygtige celler i hver brønd. Alle eksperimenter blev udført tre gange.

Cellemigrering evalueret under anvendelse af en sårhelende assay. Cellerne blev dyrket til 80-90% konfluens i 24-brønds plader. Et sår blev fremstillet ved at trække en plastik pipettespids tværs celleoverfladen. De resterende celler blev vasket tre gange for at fjerne cellerester og inkuberet ved 37 ° C med serum-frit medium. Ved de angivne tidspunkter blev migrerende celler i såret foran fotograferet og sammenlignet. Der blev udført tre separate forsøg

celleinvasion assays blev udført under anvendelse af 24-brønds transbrøndene (8 um porestørrelse; Millipore). belagt med Matrigel (Falcon 354.480; BD Biosciences). I alt 1 × 10

5-celler blev derefter suspenderet i 500 pi DMEM indeholdende 1% FBS og tilsat til det øvre kammer, mens 750 pi DMEM indeholdende 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer. Efter 48 timers inkubation blev Matrigel og cellerne forbliver i det øverste kammer fjernet ved vatpinde. Celler på den nedre overflade af membranen blev fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med Giemsa. Celler i 5 mikroskopiske felter (forstørrelse, × 200) blev talt og fotograferet. Alle forsøg blev udført tre gange.

In Vivo Metastase Analyser

For in vivo metastase analyser, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 og MGC-803-vshRNA CD151-cDNA- CD151-celler blev transplanteret i nøgne mus (5 uger gamle BALB /c-nu /nu, 5 pr gruppe, 1 x 10

6 celler for hver mus) gennem den laterale halevene [14]. Efter 7 uger blev musene aflivet. Deres lunger blev fjernet og udsat for hematoxylin og eosin (H eosin-farvning, og repræsentative områder blev Beskrevne i paraffinblokke, væk fra nekrotiske og hæmoragiske materialer. Dubletter af cylindre 1-mm-diameter fra to forskellige områder, tumoren centrum og den nærmeste noncancerous margin (betegnet som intratumor og peritumor henholdsvis; i alt fire slag) blev indbefattet i hvert tilfælde, sammen med forskellige kontroller, for at sikre reproducerbarhed og homogen farvning af dias (Shanghai Biochip Co Ltd, Shanghai). Således blev fire forskellige væv microarray blokke konstrueret, som hver indeholder 140 cylindre. Afsnit 4 um tyk blev placeret på objektglas belagt med 3-aminopropyltriethoxysilan. Monoklonale muse-anti-humant CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og muse-anti-humant integrin α3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) antistoffer blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​CD151 og integrin α3 . Billeder blev taget til fange af Leica QWin Plus v3 software. Intensiteten af ​​positiv farvning blev målt som beskrevet. Intensiteten af ​​CD151 og integrin α3 blev klassificeret i to niveauer af ekspression på middelværdien område med positiv farvning som cutoff-værdien som følger: CD151

høj, 50% af sektionen tumor; og integrin α3

høj, 25% af sektionen tumor; CD151

lav, 50%, og integrin α3

lav, 25% [15]

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS 16,0 software (. SPSS). Værdier blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. For immunhistokemiske markører, cutoff for definitionen af ​​undergrupper var median intensitet værdi. Den χ

2-test og t-test blev anvendt til sammenligninger mellem grupper. OS blev defineret som tidligere [15] beskrevne. Prognostisk signifikans blev vurderet ved hjælp Kaplan-Meier-overlevelse skøn og log-rank test. Cox ‘proportional hazards regression model blev anvendt til at analysere de uafhængige prognostiske faktorer. Alle tests var to-sidede og

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

CD151 er overudtrykt i HGC

CD151 ekspressionen blev analyseret. ved RT-PCR og immunoblotting i HGC tumor og matchede nontumor væv. CD151 blev udtrykt ved lave niveauer i nontumor væv sammenlignet med HGC væv. Som vist i fig. 1A, B og C, den relative ekspression af CD151-proteinet i HGC prøver var 2,95 ± 0,21 (interval, 1,13 – 3,59) sammenlignet med 1,30 ± 0,09 (interval, 1,00-1,81) i nontumor prøver, og forskellen var statistisk signifikant (

s

0,01). Endvidere CD151 ekspressionsniveauer var signifikant lavere i HGEC end i HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05). Der blev ikke påvist forskelle i CD151 ekspressionsniveauerne blandt HGC celler (Fig. 1D, E og F). Immunohistochemstry (IHC) analyser bekræftede, at CD151 protein blev udtrykt ved højere niveauer i HGC væv end i matchede nontumor væv (fig. 1G).

(A) Udtrykket af CD151 mRNA og protein i GC prøver og matchede nontumorous prøver; (B og C) et histogram viste CD151 mRNA i GC prøver og de matchede nontumorous prøver (p 0,05); (D) RT-PCR og immunoblotting analyseret ekspressionen af ​​CD151 i HGEC og HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05); (E og F) Et histogram viste CD151 mRNA og protein i HGEC og HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05).

CD151 fremmet invasion og metastase af HGC Cells

in vitro og in vivo

for at undersøge, hvilken rolle CD151 i HGC celler, vi ændrede udtryk for CD151 i HGC-27 celler ved RNA-interferens og cDNA-CD151 transfektion (fig. 2A) . Resultaterne af sårheling assay viste en forsinkelse i sårlukning på shRNA-CD151-HGC-27 celler ved 48 timer sammenlignet med HGC-27-Mock celler, der blev udvundet ved cDNA-CD151 transfektion (fig. 2B). Nedregulering af CD151 havde ingen signifikant effekt på celleproliferation (

s

0,05, figur 2C.). Men den nedregulering af CD151 ekspressionen forringet invasiviteten af ​​HGC-27 celler (Fig 2D, E.)

(A) Udtrykket af CD151 i HGC-27 celler ved RNA-interferens og cDNA-CD151 transfektion.; (B) Den ned /eller opregulering af CD151 har ingen indflydelse på celleproliferation (

s

0,05); (C) Den sårhelende assay viste, at en tydelig forsinkelse i sårlukning på HGC-27-vshRNA-CD151-celler blev fundet ved 24 og 48 timer, sammenlignet med HGC-27-Mock celler, mens det var nyttiggørelse af cDNA- CD151 transfektion; (D og E) Matrigel invasion assays viste, at ned /eller opregulering af CD151 ekspressionen blev ledsaget af en nedstigning /eller stige op invasion af HGC-celler in vitro; (F og G) Serial sektioner fra mus lunge viste metastaser evne cancerceller udtrykker forskellige CD151 (Scale bar: 50 pm).

For yderligere at undersøge den rolle, CD151 i tumormetastaser in vivo, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 og MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151 celler blev transplanteret ind nøgne mus gennem den laterale halevene. Histologisk analyse af lungerne af mus bekræftede, at nedregulering af CD151 undertrykt lunge metastase-dannelse. Tallene og størrelse lunge metastase knuder blev signifikant reduceret i MGC-803-vshRNACD151 gruppe sammenlignet med MGC-803-Mock og MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151-celler (fig. 2 F, G). Tilsammen vores resultater tyder på, at CD151 er en positiv regulator af mavekræft metastaser.

CD151 danner et kompleks med Integrin α3 og Silencing af Integrin α3 Forringer HGC Cell Invasion induceret af CD151 Overekspression

er blevet påvist inddragelse af tetraspanins i integrin-medieret regulering af cancermetastase, og α3β1 integrin har vist sig at fremme GC invasion og metastase [16]. Derfor undersøgte vi forholdet mellem integrin α3 og CD151 i HGC-celler. Som vist i fig. 3A, integrin α3 blev udtrykt ved højere niveauer i HGC celler end i HGEC celler. Co-immunopræcipitationsforsøg viste, at CD151 dannet et kompleks med integrin α3 i HGC-27-celler (fig. 3B, C). Desuden CD151 og integrin α3 co-lokaliseret på plasmamembran HGC-27-celler som vist ved immunfluorescens (fig. 3D).

(A) Ekspressionen af ​​integrin α3 var meget højere i HGEC og HGC celler ; (B og C) Den co-IP identificeret, at integrin α3 danne et kompleks med integrin α3; (D) Dobbelt farvning indikerede CD151 og integrinα3 co-lokaliseret på membranen af ​​HGC-27 celler; (E) Den nedregulering af integrin α3 i HGC celler; (F) Matrigel invasion analyser viste, at nedregulering af integrin α3 var ledsaget af en nedstigning invasion af HGC celler, integrin α3 interferens og integrin a3 antistoffer hæmmede celler invasion begavet af CD151.

Til yderligere at undersøge involveringen af ​​CD151 i integrin α3 funktion blev celler underkastet RNA-interferens eller cDNA-transfektion og analyseret ved Transwell eksperimenter efter udskiftning matrixgelen med laminin-332 [17]. Resultaterne viste, at silencing af integrin α3 markant inhiberede invasionen af ​​HGC-27 celler, og CD151 cDNA transfektion reddet den invasive evne HGC-27-vshRNACD151, men ikke den af ​​HGC-27-vshRNA integrin a3 celler. Endvidere integrin a3 antistoffer inhiberede invasionen af ​​HGC-27-vshRNACD151-cDNA-CD151-celler (fig. 3E, F). Disse resultater foreslog den koordinerede funktion af CD151-integrin α3 kompleks, og oplyste, at høje niveauer af CD151 og integrin α3 er forbundet med den øgede metastatiske potentiale GC celler.

Angivelse af CD151 eller Integrin α3 er positivt associeret med Ondartede fænotyper af HGC ved immunhistokemi

udtryk for CD151 og integrin α3 protein blev undersøgt i 76 primære HGC patienter ved hjælp af væv microarrays (TMA). CD151-protein immunreaktivitet lokaliseret til cellemembranen (fig. 4A). I tumorvæv, viste CD151 udtryk betydelig heterogenitet i de forskellige prøver (fig. 4A1, B1, C1 og D1). CD151

høj tegnede sig for 50% (38/76) af hele kohorten. Som vist i tabel 1, CD151

høj var signifikant korreleret med tumorstørrelse (

s =

0,021), dybde invasion (

s =

0,004), lymfeknude involvering (

s =

0,028) og høj tumor fase (

s =

0,002). Imidlertid er andre kliniske karakteristika, herunder alder, køn og tumor differentiering, blev ikke signifikant relateret til ekspressionen af ​​CD151.

(A) immunreaktivitet CD151 og integrinα3 protein blev placeret i cellemembranerne. I tumorvæv, viste CD151 udtryk betydelig heterogenitet i de forskellige prøver (Fig.4a1, B1, C1 og D1). Positiv farvning af Integrinα3 blev observeret i membranen af ​​carcinomaceller (fig. 4 a2, b2, c2, og d2). (B, C og D) Prognostisk betydning vurderes af Kaplan-Meier-overlevelse skøn og log-rank test. Sammenligninger af OS ved CD151 (B), Integrinα3 (C), og Co-overekspression af CD151 og integrinα3 (D).

De membraner af tumorceller farvet positive for integrin α3 (fig. 4a2, b2, c2, og d2). I alle de analyserede væv, blev høje niveauer af integrin α3 ekspression påvist i 27 HGC vævsprøver (35.52%). I overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser [16], [18], patienter med forhøjet integrin α3 udtryk var mere tilbøjelige til at udvise aggressiv funktioner. Integrin α3

høje patienter viste større tumorer (

s =

3.46E-4), større dybde af invasion (

s =

0,001), højere tumor stadie (

s =

0,005), og mere lymfeknude involvering (

s =

0,040) end patienter med lav integrin α3 udtryk (tabel 1).

Overekspression af CD151 og /eller integrin α3 er uafhængige Faktorer forudsigelse prognosen for HGC Patienter

indtil den sidste opfølgning, 3- og 5-årige OS satser i hele befolkningen var 53,0 og 40,78%, 5-års OS i CD151

lav gruppe var signifikant højere end i CD151

høj gruppe (68,42%

vs.

23,68%, henholdsvis

s

= 0,007, fig. 4B), og den postoperative 5-års OS af HGC patienter var højere i integrin α3

lavt end i integrin α3

høj gruppe (66,67%

vs.

13,51%,

s

= 6,67 E-6). Evaluering af den samlede virkning af CD151 og integrin α3 om prognosen for HGC viste, at 5-års OS af CD151

høj /integrin α3

høje patienter (gruppe III, n = 23) var 17,40%, hvilket var væsentligt lavere end for CD151

lav /integrin α3

lave patienter (77,78% gruppe i, n = 27) og enten lave patienter (patienter med enten lav CD151 eller lav integrin α3 alene) (23,08%, gruppe II , n = 26, fig. 4C og D).

univariat analyse viste, at tumorstørrelse, dybde af invasion, lymfeknudeinvolvering, høj tumor fase, høj CD151 ekspression, højt niveau af integrin α3 og co-ekspression af CD151 og integrin α3 var prædiktorer for OS. Andre karakteristika, herunder alder, køn og differentiering havde nogen prognostisk betydning for OS (tabel 2). Multivariate Cox proportionel risiko model viste, at dybden af ​​invasionen var en uafhængig prognostisk indikator for OS (tabel. 2).

Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse viste, at CD151 blev udtrykt på højere niveauer i GC celler og tumorvæv end i HGEC celler og nontumor væv, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om CD151 ekspressionen i en række tumorer, herunder intrahepatisk cholangiocarcinoma, HCC, bryst-, lunge-, tyktarms- og prostatakræft [15], [19], [20], [21]. Endvidere vores undersøgelse viste, at CD151 danner et funktionelt kompleks med integrin α3, og nedregulering af CD151 eller integrin α3 ekspression markant inhiberede invasion og metastase af HGC-celler in vitro. Klinisk vores resultater viste, at højt niveau af CD151-ekspression eller co-overekspression af CD151 og integrin α3 kan have ugunstig prognostiske konsekvenser for patienter med GC.

Den første bevis på, at CD151 fremmer metastase kom fra en undersøgelse, der viser, at et antistof med ukendt specificitet hæmmede metastase dannelse af en menneskelig epidermoid carcinom linje

in vivo

. Antistoffet anerkendte CD151 og inhiberede cellevandring uden at påvirke adhæsion eller proliferation [22]. Overekspression af CD151 er blevet påvist i mange tumortyper, og øget CD151 ekspression er blevet associeret med en dårlig prognose i bryst-, pankreas-, og ikke-småcellet cancere samt HCC. Endvidere CD151 er blevet vist, at være en bedre indikator for prognosen hos patienter med prostatacancer end histologisk klassificering [23]. I den foreliggende undersøgelse, to linjer af beviser viste, at overekspression af CD151 er af klinisk betydning for HGC. Først blev CD151 overekspression observeret hyppigere i HGC patienter med dårlig prognose. For det andet, forøget ekspression af CD151 forbedret invasionen og metastase af HGC-celler. Desuden afslørede kliniske data, som forhøjet CD151 ekspressionen udkonkurrerede andre almindeligt anvendte kliniske parametre såsom øget tumor størrelse og dårlig differentiering til at forudsige HGC prognose. Tilsammen disse resultater tyder på, at CD151 spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​HGC. I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at CD151 interagerer med integrin α3 i HGC celler. Modulering af ekspressionsniveauerne af integrin α3 i HGC-27-vshCD151-cDNA-CD151-celler afslørede dannelsen af ​​et funktionelt CD151-integrin α3 kompleks og viste, at co-overekspression af CD151 og integrin α3 var forbundet med øget metastatiske potentiale HGC celler . I betragtning af den etablerede rolle integrin α3 i HGC [16], er det rimeligt at antage, at CD151 overekspression kan fremme metastase /invasion i GC.

På grund af deres hydrofobe natur, tetraspanins associeret med hinanden og med andre membran proteiner [24]. Faktisk er det velkendt, at tetraspanins tilvejebringe en signalering platform i plasmamembranen gennem dannelsen af ​​tetraspanin beriget mikrodomæner (mer) [6], [7]. Til dato har forskellige typer af membranproteiner, herunder vækstfaktorreceptorer, integriner, immunglobulindomæner og EWI-F (en underfamilie af Ig-proteiner) er fundet i tering [25]. Desuden er der rapporteret funktionerne af disse membranproteiner skal intimt forbundet med mer. For eksempel blev forskellige kombinationer af tetraspanins danner mer sig at påvirke funktionen af ​​vækstfaktorreceptorer og integrin. Vigtigere, ekspressionsniveauet af individuelle tetraspanins i tering har også en betydelig indvirkning på de associerede proteiner [26], [27]. I de seneste undersøgelser, knock-down af CD151 blev vist at hæmme dannelsen af ​​mer og CD151 deletion inhiberede funktion af adskillige membranproteiner, hvilket indikerer, at CD151 spiller en kritisk rolle i TEM-dannelse og funktion [7], [26]. Desuden blokering af CD151 markant forringet invasiviteten og metastatisk potentiale af tumorceller, og målretning af CD151 protein eller mer er blevet en lovende terapeutisk strategi [23]. I nærværende undersøgelse blev ekspressionen af ​​CD151 vist sig at være en uafhængig prædiktor for OS. Men den kombinerede ekspression af CD151 og integrin α3 var en mere pålidelig prædiktor for OS end CD151 eller integrin α3 ekspression alene, støtter opfattelsen af, at både CD151 og integrin α3 spille en vigtig rolle i HGC. Derfor er vores resultater er signifikante og antyder, at CD151 eller CD151-integrin α3 komplekset kan være vigtige mål i behandlingen af ​​patienter med GC.

Afslutningsvis CD151 overekspression er en prædiktor for dårligt resultat hos patienter med HGC