PLoS ONE: Gene Expression fra Bronkoskopi Opnåede Tumorprøver som Predictor af Outcome i Advanced Inoperabel Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Flere undersøgelser har vist den prognostiske og prædiktive potentiale molekylære markører i kombineret behandling for lungekræft. De fleste af dem er nævnt imidlertid at operabel tidligt stadium NSCLC. Formålet med denne undersøgelse er at korrelere udtryk for flere mRNA markører i bronkoskopi opnået kræft prøver med kliniske resultater af avancerede lungekræft.

Metoder

Bronkoskopi kræft prøver blev taget fra 123 patienter med radiologisk diagnose af avancerede lungetumor. Ud af 123 patienter 50 blev diagnosticeret med pladecellekræft, 17 med adenocarcinom, 12 med NOS, 32 med SCLC og en med stor celle neuroendocrinal kræft. I 11 patienter andre tumorer blev diagnosticeret. Gruppen var heterogene med hensyn til kliniske stadium, udførelsen af ​​patienter og behandling. Kvantitativ real time PCR blev udført af ABI 7900 HT maskine, med Universal Probe Library (Roche) fluorescerende prober. De valgte til analyse gener var ERCC1, EGFR, BRCA1, CSF1, CA9, DUSP6, STAT1, ErbB3, MMD, FN1, og CDKN1B.

Resultater

Mere end 50 ng RNA ( det beløb, anses for tilstrækkelig for analysen) blev isoleret i 82 ud af 112 lungekræft prøver (73%), herunder 60/80 (75,0%) af NSCLC prøver og 22/32 (68,7%) af SCLC prøver. Den højeste Cohens κ koefficient for forskelsbehandling mellem småcellet, planocellulært og adenocarcinom blev fundet for CDKN1B, CSF og EGFR1 (κ = 0,177, p = 0,0041). En multivariat Cox regression model har vist en signifikant effekt af klinisk fase (p 0,001, RR = 4,19), ERCC1 (p = 0,01, RR = 0,43) og CA9 (p = 0,03, RR = 2,11) udtryk på den samlede overlevelse i en gruppe på 60 patienter med NSCLC.

Konklusion

Disse resultater viser muligheden for multiple genekspression analyse i bronkoskopi opnået kræft prøver som prognostiske markører i strålebehandling og kemoterapi til avanceret lungekræft. En begrænsende faktor var relativt høj andel af prøver, hvorfra tilstrækkelig mængde RNA ikke kunne isoleres

Henvisning:. Suwinski R, Klusek A, Tyszkiewicz T, Kowalska M, Szczesniak-Klusek B, Gawkowska-Suwinska M, et al. (2012) Gene Expression fra Bronkoskopi Opnået Tumorprøver som Predictor af Outcome i Advanced Inoperabel Lung Cancer. PLoS ONE 7 (7): e41379. doi: 10,1371 /journal.pone.0041379

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: 20 juni 2012; Publiceret: 27 juli, 2012 |

Copyright: © Suwinski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev sponsoreret af en forskningsbevilling NN 403 290636 fra ministeriet for videnskab og videregående uddannelse i Republikken Polen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Flere undersøgelser vist potentiale af genekspressionsprofiler til forudsigelse af resultatet i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1] – [8]. De fleste af disse undersøgelser, der er nævnt, men til kirurgisk behandles tidligt stadie sygdommen. Tilgængeligheden og kvaliteten af ​​tumorprøver opnået ved kirurgi gør denne fremgangsmåde blev foreslået muligt, således forskellige prognostiske underskrifter for tidligt stadie sygdommen.

Desværre er lungetumorer ofte diagnosticeret i avanceret klinisk fase, hvor strålebehandling og /eller kemoterapi er chef behandlingsmuligheder. Også den patologisk diagnose af småcellet lungecancer (SCLC) udelukker anvendelsen af ​​kirurgi i de fleste tilfælde. Derfor kan de prognostiske signaturer, der refererer til de patienter, der behandles med kirurgi har begrænset, hvis nogen, anvendelighed til enkeltpersoner og datasæt, hvor kemoterapi og /eller kemoterapi er den vigtigste behandlingsmulighed. Man kan forvente, at de samme gener, der disponerer tumorceller til dårlig differentiering, således at tilbøjeligheden til formidling efter operationen, kan medfører bedre radiosensitivitet og /eller kemosensitivitet grundet kort celle omsætning. Sådanne forskelle understreger behovet for de analyser, som vurderer genekspression fra bronkoskopi opnåede tumor prøver, og relatere udtrykket til det kliniske resultat. Udviklingen af ​​prognostiske underskrifter for avancerede inoperable tumorer har haltet, men bag lignende forsøg med kirurgisk opnåede prøver [9]. Dette skabte grundlaget for den nuværende undersøgelse.

Metoder

Patienter

Udvælgelseskriterier omfattede patienter med radiologisk diagnosticeret lunge tumor, der var mistænkt for malignitet. Kun patienter med bronkoskopi tilgængelige avancerede tumorer, anses ubrugeligt ved første diagnose, blev overvejet. En informeret samtykke var påkrævet for optagelse til studiet. En protokol af denne forskning blev godkendt af den lokale bioetiske komité i henhold til nationale regler.

Mellem november 2006 og april 2009 tumor prøver blev opnået under rutinemæssig bronkoskopi i 123 patienter. Prøver blev vurderet umiddelbart efter biopsi og en del af prøven blev anvendt til patologisk undersøgelse, mens den resterende del blev opbevaret i genekspression analyse.

Ud af 123 patienter 50 (40,6%) blev diagnosticeret med pladecellekræft , 17 (13,8%) med adenocarcinom, 12 (9,7%) med NOS (ikke andet er angivet) NSCLC, 32 (26,0%) med småcellet lungekræft og en med stor celle neuroendocrinal kræft. I 7 patienter blev diagnosticeret med andre typer tumorer, herunder 2 tilfælde af lymfom og 5 metastatiske tumorer. I 2 patienter havde tumor ikke at være ondartet, og i 3 tilfælde ikke kunne fastslås den endelige patologisk diagnose.

Sammenfattende 112 ud af 123 prøver (91,1%) blev anvendt i undersøgelsen. Dette omfattede 80 prøver af ikke-småcellet lungekræft, og 32 småcellet lungekræft.

Gene Expression Analysis

Tumor prøver blev anbragt i 5 ml RNA senere og opbevares i -20 ° C før analysen. Isolering af RNA blev udført med RNeasy Midi Kit (Qiagen) ved at følge standardprocedurer. Oprenset RNA blev opbevaret i -70 ° C. Koncentrationen af ​​RNA blev bedømt ved spektrofotometri (260 nm absorption) under anvendelse NanoDrop ND-1000. Kvaliteten af ​​RNA blev vurderet ved kapillarelektroforese i Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) under anvendelse af RNA 6000 Nano Assay. En vis grad af RNA-nedbrydning blev vurderet ved estimering af RNA Integrity Number (RIN). cDNA blev syntetiseret på RNA-matrix ved revers transkription under anvendelse Omniscript Kit (Qiagen).

Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved ABI 7900 HT maskine, med Universal probebibliotek (Roche). Udtrykket af målgener blev normaliseret i forhold til seks referencepunkter gener (UBE2D2, PGK1, HADHA, EIF3S10, CCT7 og B2M)

Elleve gener blev udvalgt til analyse:. ERCC1, EGFR, BRCA1, CSF1, CA9, DUSP6, STAT1, ErbB3, MMD, FN1, og CDKN1B. En sådan udvælgelse var baseret på de offentliggjorte prognostiske underskrifter, hvoraf de fleste er nævnt kirurgisk serie af patienter med NSCLC. Tabel 1 opsummerer den sandsynlige virkningsmekanisme af disse gener, såvel som det forventede udfald relateret til overekspression af genet. Vi bemærker, at det forventede resultat henviser overvejende, at fase tumorer tidlige, og ikke til de patienter med fremskreden inoperabel sygdom.

Statistisk analyse

Det vigtigste mål med analysen var at kategorisere tumorerne overensstemmelse med klinisk prognose, udnytte data på genekspression. Gruppen var imidlertid heterogene med hensyn til tumor patologi, kliniske karakteristika og behandling, der kan påvirke det kliniske resultat betydeligt, uanset genekspression. Derfor er de statistiske metoder tilladt justering for confounding kliniske faktorer.

indflydelse genekspression på overlevelse blev analyseret ved hjælp af univariate og multivariate Cox regressionsmodellen. Normaliseret genekspression blev dikotomiseret, således at det blev kodet som 0 (lav) eller 1 (høj) under anvendelse median udtryk værdi som en cut-off [2] .Samlet overlevelse blev beregnet som tiden fra diagnosen til døden (ucensureret) eller som tiden fra diagnosen til den sidste opfølgning (censureret). I betragtning sonderende Formålet med denne forskning og relativt lille stikprøve, blev Cox f test, der anvendes til at vurdere betydningen af ​​forskelle i overlevelse mellem to grupper. Denne test er udviklet til analyse af små grupper, i modsætning log-rank test, som bruges til analyse af store kliniske datasæt.

En univariate Cox model af overlevelse blev anvendt til at beregne relative risiko (RR) for død i dikotomiseret grupper. Kun de variabler, der syntes betydelig, eller som viste en tendens til signifikans (RR 0,7 eller RR 1,3 og p 0,15) blev behandlet i en multivariat model. Udvælgelse baseret på statistiske tendenser er begrundet i klinisk heterogenitet i gruppen, at når forsvundet, kunne forvirre den mulige prognostiske effekt af genekspression. En multivariat Cox proportional hazard regressionsmodel identificeret de variabler, der væsentligt og uafhængigt påvirket overlevelse. Modellen blev optimeret ved hjælp baglæns trinvis regression. De variabler, der væsentligt og uafhængigt påvirket samlet overlevelse blev brugt til at konstruere et prognostisk signatur baseret på resultaterne af en multivariat undersøgelse.

Da den kliniske prognose og forvaltning af SCLC afviger helt fra NSCLC overlevelse i disse to grupper blev analyseret separat.

for at identificere gener, der kan skelne mellem 3 store patologiske undergrupper (pladecellekræft, adenocarcinom og småcellet lungekræft) t-test blev anvendt ved begyndelsen. For yderligere at undersøge mulige forbindelser mellem genekspression og patologisk type af den tumor k-midler blev anvendt. Denne fremgangsmåde repræsenterer klyngeanalysen som tager sigte på opdeling af n observationer i k klynger, hvor hver observation tilhører klyngen med den nærmeste middelværdi [10]. Den bedste sammenhæng mellem udtryk for gener og patologiske type tumoren blev etableret ved hjælp af Cohens κ koefficient, som er et statistisk mål for inter-rater aftale om kategoriske elementer [11]. Vi bemærker, at de analyserede i denne undersøgelse gener blev udvalgt som potentielle prognostiske faktorer i cytotoksisk behandling og ikke som de potentielle diskriminatorer mellem tumortyper.

Resultater

Kvaliteten af ​​RNA

Mere end 50 ng RNA (mængden anses for tilstrækkelig for analysen) blev isoleret i 82 ud af 112 lungekræft prøver (73%), herunder 60/80 (75,0%) af NSCLC prøver og 22/32 (68,7%) af SCLC prøver. Blandt patienterne med pladecellekræft en tilstrækkelig mængde RNA blev opnået i 38/50 (76,0%) sammenlignet med 12/17 (70,6%) med adenocarcinom og til 10/12 (83,3%) med NOS NSCLC. Meget god RNA integritet (RIN 8-10) blev opnået i kun 12,3% af prøverne. Disse viser, at analysen af ​​bronkoskopi opnåede tumor prøver stiller krav om yderligere optimering før klinisk implementering. Analysen, som vist, var baseret på genekspression status evalueret i 82 prøver fra hvem tilstrækkelig mængde RNA blev isoleret (60 NSCLC og 22 SCLC).

Gene Expression Ifølge Patologi af tumoren

t-test viste, at BRCA1, CDKN1B og CSF-ekspression varierede signifikant mellem småcellet og ikke-småcellet lungecancer (p-værdier 0,01, 0,02, og 0,02 henholdsvis). To andre gener (EGFR1, STAT1) har vist en tendens. (P-værdier 0,07 og 0,09 henholdsvis). Derimod fandtes ingen signifikante forskelle i genekspression mellem pladecellekræft og adenocarcinom, selv om der var en tendens til, BRCA1, CDKN1B og ERCC1. Den højeste Cohens κ koefficient for forskelsbehandling mellem småcellet, planocellulært og adenocarcinom blev fundet for CDKN1B, CSF og EGFR1 (κ = 0,177, p = 0,0041). En sådan vurdering indikerer en relativt lille, men signifikant sammenhæng mellem udtryk for disse gener og patologiske type tumoren.

kliniske faktorer vs. overlevelse i målgruppen

Tabel 2 illustrerer kliniske karakteristika af 60 patienter med NSCLC, som havde kendt genekspression status. Gruppen var heterogene med hensyn til kliniske stadium, udførelsen af ​​patienter og behandling. Som forventet, at størstedelen af ​​patienterne var i fremskredne kliniske stadier, herunder 48% med stadie IV sygdom. Kun 2 personer (3%) var i fase I-II-sygdom (begge blev anset ubrugeligt på grund af co-morbiditet). Tres procent af patienterne havde kemoterapi (cisplatin baseret dubletter), 57% havde strålebehandling med samlede doser fra 20-70 Gy (median på 30 Gy). Median opfølgning er 3,6 år).

Stage, performance status og køn væsentligt påvirket overlevelse i en univariat model, men i en multivariat analyse kun klinisk fase syntes at have og selvstændig prognostisk betydning (RR = 3,56, 95% CI = 1,95-6,45, p = 0,00003). Derfor blev klinisk fase yderligere betragtes som den vigtigste faktor, der kan forvirre den mulige prognostiske betydning af genekspression.

univariat Indflydelse af Gene Expression på overlevelse

Tabel 3 viser indflydelse af 11 udvalgte gener på samlet overlevelse i en gruppe på 60 patienter med NSCLC. Ud af 11 gener kun udtryk for ERCC1 haft en betydelig indflydelse på overlevelse, mens de udtryk for fire andre gener (CA9, ErbB3, fn1 og STAT1) viste en tendens (RR 0,7 eller RR 1,3 og p 0,015). Høj ekspression af 3 i disse gener (CA9, fn1 og STAT1) var relateret til forøget risiko for død, mens overekspression af ERCC1 og ErbB3 havde en beskyttende virkning. Vigtigst (som det vil blive yderligere diskuteret) sådant resultat har en rationel forklaring på biologisk funktion af disse gener, og i resultatet af de offentliggjorte undersøgelser. Svaghed af betydning af individuel genekspression for overlevelse er ikke overraskende i betragtning af klinisk heterogenitet og lille udsnit af gruppen.

For de sonderende formål bygget vi en prognostisk score, hvor overekspression af hver risiko gener (CA9 , FN1 eller STAT1) blev kodet som +1, mens overekspression af hver af den beskyttende gen (ERCC1 eller ErbB3) blev kodet som -1. Scorerne blev tilsat. Summen under nul betegnes lav risiko, mens summen af ​​nul eller flere betegnes høj risiko. Figur 1A viser samlet overlevelse efter sådan fem-gen-signatur. Forskellen i overlevelse mellem høj og lav risikogrupper var signifikant (RR = 1,89, p = 0,02). Når analysen var begrænset til 31 patienter med lokaliseret sygdom forskellen mellem høje og lave risikogrupper forblev signifikant (RR = 2,3, p = 0,03, figur 1b). Det forblev også signifikant i 29 patienter med metastatisk sygdom (RR = 2,3, p = 0,03, figur 1c).

A) 60 patienter med NSCLC. B) 31 patienter med lokaliseret sygdom (fase I-III). C) 29 patienter med metastaserende sygdomme (stadie IV).

Multivariate Analysis

Fem gener, der optrådte signifikant eller demonstreret tendens i en univariat model indgik i en multivariat analyse (ERCC1, ErbB3, CA9, FN1 og STAT1). Sådan analyse viste, at 3 ud af 5 gener (ErbB3, fn1 og STAT1) ikke kan betragtes som uafhængige prognostiske faktorer. Den overekspression af ErbB3 var mere almindelig hos kvinder, og blev således relateret til stadium af sygdommen (fremskredent stadium var mere almindelig hos mænd). Ligeledes overekspression af FN1 var mere almindelig i de mest avancerede kliniske stadier. Overekspressionen af ​​STAT1 blev korreleret med overekspression af CA9. To gener fortsat betydelig i variant af en multivariat model, der ikke højde for tumor fase: ERCC1 (RR = 0,53, 95% CI 0,30-0,96, p = 0,03) og CA9 (RR = 1,79, 95% CI 1,00-3,21, p = 0,05).

Multivariate model, der tegnede sig også for den fase af sygdommen bekræftede en væsentlig og uafhængig prognostisk værdi ERCC1 og CA9 ekspression (tabel 4). Den prognostiske score bygget baseret på resultater af den multivariate analyse var som følger:

hvor klinisk fase, samt CA9 og ECCC1 udtryk blev dikotomiseret og kodet som 0 eller 1. Værdier over medianen på 2,5 betegnes høj risiko . Figur 2 illustrerer overlevelse kurver i henhold til risikogrupper. Forskellen i overlevelse mellem grupperne var stærkt signifikant (RR = 4,40, 95% CI 2,35-8,17, p = 0,00003), og forskellen overgået univariate indflydelse etape (RR = 3,56).

småcellet lungekræft

Ud af 22 patienter med SCLC 7 havde begrænset og 15 omfattende sygdom. Sygdommens omfang syntes ikke at væsentlig indflydelse overlevelse (RR-0,95, p = 0,93). Derimod overekspression af 2-gener viste sig at signifikant nedsætter overlevelse (CA9: RR = 1,6, p = 0,04 og MMD, RR = 1,8, p = 0,03). Den kliniske implikation af dette fund er ikke desto mindre tvivlsom på grund af meget lille størrelse og klinisk heterogenitet i gruppen.

Diskussion

Genekspression held har været anvendt til klassificering og prognose af ikke-small celle lungekræft, selvom nylig gennemgang af de offentliggjorte data antyder, at denne tilgang er endnu ikke klar til klinisk anvendelse [6]. De fleste af de relevante undersøgelser, der er nævnt kirurgisk serie [1] – [8], [12] – [17], med kun få, der har forsøgt at analysere genekspression profiler baseret på bronkoskopi opnåede prøver [9]. Derimod blev evaluering af EGFR-mutationer som prædiktiv analyse for tyrosinkinasehæmmere i avanceret adenocarcinom i lungerne betragtes et stort gennembrud, og opstod som et nyt diagnostisk værktøj [18]. Dette viser, at på trods af vanskeligheder og begrænsninger, vil molekylære markører sandsynligvis spille en stigende rolle i diagnostik, prognose og forudsigelse for avanceret ikke-småcellet lungekræft.

Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viser, at analysen af genekspression profiler baseret på bronkoskopi opnåede prøver er muligt, men de metoder, der blev brugt efterspørgsel optimering. Den største begrænsende faktor var relativt høj andel af prøver, hvorfra tilstrækkelig mængde RNA ikke kunne isoleres. En anden faktor, der bidrog til uønsket frafald af tilfældene var den patologisk diagnose, som ikke havde været til rådighed før bronkoskopi. En del af patienterne havde dermed forskellig diagnose fra at forventede baseret på symptomer, klinisk undersøgelse og billedbehandling.

Ud af elleve gener undersøgt høj ekspression af 3 gener (CA9, fn1 og STAT1) var relateret til øget fare for død, mens overekspression af ERCC1 og ErbB3 havde en beskyttende virkning. Sådant udfald har en rationel støtte i biologisk funktion af disse gener, og i resultatet af udvalgte offentliggjorte undersøgelser.

ERCC1 syntes at være stærkest forbundet med prognosen i den foreliggende undersøgelse. Den er ansvarlig for nukleotid excision reparation af beskadiget DNA. Over-ekspression af dette gen kan forøge beskadigelse af tumorceller fra stråling eller narkotika og bidrage til bedre prognose [16]. En sådan slutning blev støttet af de nuværende data.

CA9 anses for at være et surrogat markør for tumor hypoxi. Radioterapi eller cytotoksiske lægemidler er mindre effektive i hypoksisk miljø, således en forøget ekspression af CA9 kan bidrage til dårligere prognose. Sådan slutning understøttes af den foreliggende undersøgelse. Derimod en forøget ekspression af CA9 havde en beskyttende virkning for operabel planocellulært lungecancer [2], som kan illustrere eventuelle forskelle i prognostisk betydning af et givet gen i kirurgisk og ikke-kirurgisk serie.

ErbB3 koder for et medlem af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) familien af ​​receptortyrosinkinaser. Høj ekspression af dette gen optrådte korreleret med specifikke klinik-patologiske træk ved japansk lungecancer [15]. Vigtigst ErbB3 var overudtrykt i ikke-ryger kvinder med muteret EGFR, det vil sige i en gruppe med gunstige prognostiske funktioner. Mens ingen data om EGFR mutationer var tilgængelige i den nuværende serie, overekspression af ErbB3 var mere almindelig hos kvinder med adenocarcinom, støtte, således resultaterne af den japanske undersøgelse. Fordi prognosen hos hunner var bedre, over-ekspression af ErbB3 havde en beskyttende (men ikke uafhængige) virkning på overlevelse i den foreliggende serie. Interessant nok en modsat virkning af ErbB3 overekspression (forøget risiko for død) blev afsløret i den kirurgiske undersøgelse [1]. Dette kan, igen, illustrerer mulige forskelle i prognostisk betydning af et givet gen i kirurgisk og ikke-kirurgisk serie.

STAT1 er involveret i opregulering gener, der fører til en forøget ekspression af Interferon stimulerede gener. Over-ekspression af STAT1 var relateret til bedre prognose i kirurgisk serie [1], men ikke i den foreliggende undersøgelse. Nærværende analyse bekræftede, ja, at STAT1 overekspression var relateret til overekspression af de andre gener (herunder alle 6 referencepunkter gener), men netto-effekten af ​​et sådant forhold var en tendens til en beskyttende effekt af STAT1. Dette resultat kan forklares med en stærk korrelation af STAT1 og CA9 synlige i de nuværende data.

Endelig er FN1 kendt for sin rolle i celle adhæsion, vækst, migration og differentiering. Dets overekspression var relateret til stimulering af ikke-småcellet cancervækst gennem aktivering af Akt /mTOR /S6 kinase og inaktivering af LKB1 /AMP-aktiveret protein kinase signalvej [17]. Over-ekspressionen af ​​FN1 var relateret til dårligere prognose i den nuværende serie, men det så ikke ud som en nyttig markør i nærværende analyse på grund af korrelation med klinisk fase.

prognostisk score foreslåede kræver validering ved hjælp af en uafhængig datasæt. Vi bemærker dog, at i modsætning til de undersøgelser, der søger for de nye markører, vi kun udforsket markørerne er kendt for at have en mulig prognostisk værdi i postoperativ omgivelser. Man kan overveje, således, at det var den nuværende undersøgelse, valideret markørerne fra de andre forfattere i et datasæt, der omfattede patienter i fremskredent stadium af sygdommen. Test af prognostisk score fremadrettet i mere homogene patientgrupper er vores fremtid mål. Også teste de andre gener vil, sandsynligvis bidrage til forbedring af den foreslåede forsimplede score.

Sammenfattende konkluderer vi, at analysen af ​​genekspression profiler baseret på bronkoskopi opnåede prøver optrådte muligt, men den metode, der var brugte krav yderligere optimering. To-gen signatur foreslås til avanceret ubrugeligt NSCLC kan være nyttigt, især i klinisk homogene grupper.