PLoS ONE: E-cadherin destabilisering Regnskab for Patogenicitet af missense mutationer i Arvelig Diffuse Gastric Cancer

Abstrakt

E-cadherin er afgørende for opretholdelsen af ​​væv arkitektur på grund af sin rolle i celle-celle-adhæsion. E-cadherin mutationer er den genetiske årsag til arvelig Diffus Gastric Cancer (HDGC) og missense mutationer udgør et klinisk byrde, på grund af usikkerheden om deres patogene rolle. In vitro og in vivo, de fleste mutationer føre til tab af funktion, selvom den kausale faktor er ukendt for de fleste. Vi antager, at destabilisering kunne redegøre for patogeniciteten af ​​E-cadherin missense mutationer i HDGC, og afprøvet vores hypotese brug i silico og in vitro værktøjer. FoldX algoritme blev anvendt til at beregne effekten af ​​hver mutation i E-cadherin native-state stabilitet, og analysen blev suppleret med evolutionær bevarelse, ved SIFT. Interessant HDGC patienter huser kimlinie E-cadherin destabiliserende mutanter præsentere en yngre alder ved diagnose eller død, hvilket antyder, at tabet af native-state stabilitet E-cadherin regnskab for sygdomsfænotypen. For at belyse den biologiske relevans af E-cadherin destabilisering i HDGC, vi undersøgte en gruppe af nyligt identificerede HDGC-associerede mutationer (E185V, S232C og L583R), hvoraf L583R forventes at være destabiliserende. Vi viser, at denne mutation er ikke funktionelt in vitro, udviser kortere halveringstid og er ikke i stand til at modne, grund af for tidlig proteasom-afhængige nedbrydning, en fænotype reverterede ved stabilisering med den kunstige mutation L583I (strukturelt tolereres). Heri rapporterer vi E-cadherin strukturelle modeller er egnede til at forudsige effekten af ​​størstedelen af ​​cancer-associerede missense mutationer, og vi viser, at E-cadherin destabilisering fører til tab af funktion in vitro og øget patogenicitet in vivo.

Henvisning: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-cadherin destabilisering Regnskab for Patogenicitet af missense mutationer i Arvelig Diffuse Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: November 9, 2011; Accepteret: 17 februar 2012; Udgivet MT: 21. marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fundação para en Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104.017 /2008 SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (kortvarig stipendium ASTF 60- 2009) og EU-tilskud Udsigterne (SUNDHED-F4-2008-201648). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

E-cadherin er en celle-celle adhæsion glycoprotein bestående af fem ekstracellulære cadherin-type gentagelser, en transmembran region og en højt konserveret cytoplasmatiske hale [1], [2]. E-cadherin udtrykkes primært i epitelceller og er hovedkomponenten af ​​adherensovergange (AJ). Disse knudepunkter klynge, via homofil interaktioner, gennem de ekstracellulære domæner af calcium-afhængige E-cadherin-molekyler på overfladen af ​​homotypiske naboceller.

rolle E-cadherin i tumorudvikling er godt beskrevet, og dens tab af ekspression er et kendetegn i carcinomer [3]. Eksperimentel evidens understøtter en rolle for E-cadherin-kompleks både til undertrykkelse invasion og metastase-dannelse [4]. Tab af E-cadherin-ekspression er ofte associeret med genetiske begivenheder såsom splejsningssted og trunkering mutationer forårsaget af insertioner, deletioner og sense-mutationer, foruden missense-mutationer [5]. Sporadisk diffus gastrisk cancer, er ændringer i genet kodende E-cadherin (CDH1) findes fortrinsvis i exon 7 til 9 [5], mens i luftrør brystcancere er de spredes langs genet, med ikke favoriseres hotspot [6]. Missense mutationer findes i disse to typer af sporadisk cancer og også i synovial sarkomer [7].

Familiær sammenlægning af Diffus Gastric Cancer (DGC) udgør 10% af tilfældene af gastrisk kræft (GC), og kun 1-3% er arvelige [8]. Ud fra disse familiære tilfælde arvelig Diffus Gastric Cancer (HDGC) defineret ved strenge kriterier, der blev fastlagt af International Gastric Cancer Linkage Consortium (IGCLC) i 1999: (1) to eller flere dokumenterede tilfælde af diffuse mavekræft i første /anden grad pårørende, med mindst én diagnosticeret før en alder af 50; eller (2) tre eller flere tilfælde af dokumenteret diffus mavekræft i første /anden grads slægtninge uafhængigt af alder. Tidlig debut Diffus Gastric Cancer (EODGC) anses når en isoleret person er diagnosticeret med DGC med mindre end 45 år. Kimcellelinje CDH1 mutationer er fundet i 30% af HDGC tilfælde [9]. Foreningen af ​​CDH1 mutationer og familiær mavekræft blev først beskrevet af Guilford

et al

i 1998 [10], og siden da mange undersøgelser rapporteret forskellige typer CDH1 mutationer i HDGC [11], [12], [13 ]. Blandt alle indberettede

CDH1

kimlinie mutationer, 77,9% er noget vrøvl, splejse-site og læserammeforskydningsmutationer (forudsagt at producere præmature termineringskodoner) og 22,1% er missense mutationer [9]. Mutationer, der genererer PTC normalt skadelig, patienterne anses for høj risiko luftfartsselskaber, og rådes til at have profylaktisk total gastrektomi [14]. Den patogenicitet af missense mutationer er ikke ligetil, og disse ændringer er almindeligvis omtales som Unclassified Sequence Varianter (USVs) på grund af mangel på strenge kriterier for at vurdere deres effekt. Adskillige parametre er blevet taget i betragtning ved klassificeringen af ​​E-cadherin USVs i HDGC: 1) co-segregering af mutationen med DGC (inden stamtavler); 2) mutationsfrekvens i rask kontrolgruppe; 3) mutation tilbagefald (i uafhængige familier). Segregationsanalyse er ofte umuligt, med et lille antal berørte sager rådighed for molekylær diagnose [15], og fraværet af kliniske information er et begrænsende trin at udlede den patogene betydning af disse mutationer. For at omgå denne begrænsning vi tidligere har udviklet

in vitro

funktionelle assays til at vurdere den funktionelle effekt af E-cadherin germline missense mutationer [16], [17]. Men sådanne undersøgelser implicerer lab specifikke eksperimentelle betingelser, nemlig cellebiologiske assays, og de er tidskrævende at bruge i rutine.

I silico

forudsigelser er pålidelig og hurtig analyse, at man kan bruge til at forudsige effekten af ​​punktmutationer, især når strukturel information er tilgængelig [18], [19].

I dette arbejde, vi undersøgt potentialet i strukturen-baserede

i silico

forudsigelser til at evaluere effekten af ​​E-cadherin missense-mutationer, der findes i arvelig og sporadisk cancer. Vores analyse er baseret på beregningen af ​​indfødte-state stabilitet forandringer som følge af hver variant (AAG = AG

WT-AG

Mut), fremstillet ved protein design FoldX algoritme [20], [21]. Interessant, gruppen af ​​patienter huser destabiliserende mutationer (AAG 0,8 kcal /mol) er kendetegnet ved en yngre alder ved diagnose eller død ved DGC, hvilket tyder på, at tabet af E-cadherin native-state stabilitet bidrager til sygdommen fænotype. Ved hjælp af en cellulær model, analyserede vi fænotypen af ​​E-cadherin destabilisering, og fandt, at når en mutation inducerer faldt native-state stabilitet, er E-cadherin for tidligt nedbrydes af proteasomet, udviser kortere halveringstid, hvilket resulterer i tab af klæbemidlet fungere. Alt i alt, vores resultater tyder på, at destabilisering tegner sig for patogenicitet E-cadherin missense mutationer findes i HDGC.

Materialer og metoder

Indsamling af E-cadherin sekvens varianter og PDBs

E-cadherin varianter associeret med HDGC eller EODGC blev indsamlet fra litteraturen, og somatiske varianter blev indsamlet fra Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/kosmisk /). Tre nye E-cadherin sekvens varianter, hvor rapporteret til vores laboratorium til funktionel analyse: E185V, S232C og L583R. For nylig L583R blev rapporteret, med tilhørende funktionelle data [22].

E-cadherin-relaterede PDBs blev identificeret ved hjælp af automatisk søgning med Swiss Model Repository (https://swissmodel.expasy.org). Sekvens alignment af human E-cadherin og hver af sekvenserne, der anvendes til de forskellige modeller blev udført med M-kaffe [23], [24] (https://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Billeder blev forberedt med PyMOL. Efter at have analyseret sekvens og strukturel homologi blev tre PDBs udvalgt til at bruge som modeller:. Xenopus C-cadherin ektodomænet (FBF 1L3W), mus E-cadherin prodomænet (FBF 1OP4) og muse β-catenin interagerende domæne (FBF 1I7X)

FoldX beregninger og finkæmme analyse

Brug FoldX (https://foldx.crg.es/) kommandoen

Buildmodel

vi bygget tre forskellige modeller (prodomænet, ekstracellulært og cytoplasmatisk); De tre strukturer blev humaniseret ved substitution af hver forskellig aminosyre. Den resulterende struktur blev optimeret med kommandoen

RepairPDB

energierne hvor analyseret med

Stability

eller

AnalyseComplex

kommandoer. Sygdommen-associerede mutationer blev genereret med

Buildmodel

kommando, hver mutation gentaget i fem kørsler. Energierne er en automatisk output i FoldX, og den indfødte-state stabilitet forandring, AAG, mellem WT og mutant (AAG = AG

WT-AG

Mut) genereres også i en separat fil, med den tilsvarende standard afvigelser, og alle de energiske straffe forbundet til hver mutation. Kun mutationer med AAG 0,8 kcal /mol blev anset skadelig

Vi brugte SIFT (https://sift.jcvi.org/, Sortering Intolerant Fra Tolerant) til at vurdere bevaringen af ​​hver aminosyre substitution, som tidligere. beskrevet [25], ved hjælp af Blink træk ved GI:. 31073. Kun mutationer med en score under 0,05 blev anset for at være Intolerant

prop (https://www.cbs.dtu.dk/services /pROP /) [26] blev anvendt til at vurdere, om mutationer kunne have en effekt på prodomæne spaltning.

Cellekultur og transfektioner

E-cadherin WT cDNA blev klonet i pIRES2-EGFP vektor ifølge at fremstille instruktioner (Clontech, Takara Bio) og mutationer E185V, S232C, L583R og L583I He-cadherin blev induceret af mutagenese som tidligere [27] beskrevet. Den tomme vektor (Mock) blev anvendt som kontrol Salg

CHO (Chinese Hamster Ovary) -celler (ATCC nummer: CCL-61). Blev dyrket i Alfa-MEM-medium (Gibco, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen). Celler blev sporadisk evalueret for mykoplasma forurening med imunofluorescence med DAPI. Celler blev transficeret med 1 ug af hver af vektorerne der koder for de forskellige former af E-cadherin (WT, E185V, S232C, L583R og L583I) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ifølge producentens procedure. For stabil cellelinie etablering blev celler udvælges ved antibiotisk resistens til 5 ug /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Alle cellelinjer blev holdt i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C

Funktionelle assays

forbigående transficerede CHO (Chinese Hamster Ovary) -celler (ATCC nummer:. CCL -61) blev underkastet flow citometry ved anvendelse GFP fluorescensmåling, at evaluere transfektionseffektiviteten før hvert eksperiment. Til den langsomme aggregation assay blev brønde i 96-brønds-plade med 50 pi agar-opløsning (100 mg Bacto-agar i 15 ml sterilt PBS). Celler blev løsnet med trypsin og suspenderet i dyrkningsmedium. En suspension af 1 × 10

5 celler /ml blev fremstillet og 2 × 10

4-celler blev podet i hver brønd. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C i et fugtigt kammer med 5% CO

2 i 48 timer. Aggregering blev evalueret i et omvendt mikroskop (4 × forstørrelse) og fotograferet med et digitalt kamera.

Western blotting

Cellelysater blev opnået med Catenin lysepuffer (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 i PBS) suppleret med protease inhibitor cocktail (Roche) og phosphatase inhibitor cocktail (Sigma). Protein kvantificering blev udført ved en modificeret Bradford assay (Bio-Rad). For hver prøve blev 25 ug protein indlæst, adskilt i 7,5% SDS-PAGE, og elektroblottet til nitrocellulose membran (GE Healthcare Life Sciences). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk og 0,5% Tween-20 i PBS. Immunoblotting blev udført med antistoffer mod E-cadherin (1:1000; BD Biosciences), actin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), og α-tubulin (1:10000; Sigma). Får anti-mus (GE Healthcare Life Sciences) eller æsel anti-ged (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt som sekundære antistoffer, efterfulgt af ECL-detektion (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblots blev kvantificeret i Mængde One-software (Bio-Rad).

Fluorescens-cellesortering (FACS)

Celler blev dyrket til en sammenflydende monolag, fritliggende med Versene (Gibco, Invitrogen) og resuspenderet i iskold PBS med 0,05 mg /ml CaCl

2. En suspension af 5 x 10

5-celler blev centrifugeret i 5 minutter ved 1500 rpm 4 ° C og vasket i PBS med 0,05 mg /ml CaCl

2 3% BSA. Celler blev inkuberet i 60 minutter med et primært antistof mod E-cadherin, HECD1 (Zymed Laboratories) ved 1:100 fortynding. Celler blev vasket to gange og derefter inkuberet med anti-muse biotinyleret (Dako) ved 1:100 fortynding. Celler blev vasket to gange og derefter inkuberet med streptavidin PE-CY5 (BD Pharmingen) ved 1:40 fortynding. Endelig blev cellerne vasket, resuspenderet i 500 pi PBS, og 50000 celler blev analyseret i et flowcytometer (Coulter Epics XL-MCL). Dataene blev analyseret med WinMDI software.

immunfluorescensfarvning

I Immunofluorescens og mikroskopi blev celler podet på dækglas og dyrkes til ca. 80% konfluens, fikseret i iskold methanol i 15 minutter, vasket 2 gange med PBS og inkuberet med primært antistof, fortyndet i PBS 5% BSA, i 60 minutter ved stuetemperatur. Primære antistoffer anvendt: monoklonalt muse-anti-E-cadherin (BD Biosciences); kanin-anti-calnexin (StressGen). Sekundære antistoffer anvendes: Alexa Fluor 488 anti-muse (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-kanin (1:500; Invitrogen). Dækglassene blev monteret på objektglas under anvendelse af Vectashield med DAPI for nuklear detektion (Vector Laboratories). Billede købet blev udført på Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M Fluorescens mikroskop hjælp 40 × mål. Billeder blev erhvervet med Axiocam HRM kamera og behandlet af software Axiovison udgave 4.8.

Cell Behandlinger Salg

I den proteinsynteseinhibering, celler blev behandlet med 25 pM af cycloheximid i 8 timer og 16 timer, og mængden af ​​totalt E-cadherin blev analyseret ved WB som tidligere beskrevet. For proteasomhæmning assayet blev cellerne podet i plader med 6 brønde, dyrket til ca. 80% konfluens og inkuberet i 16 timer med 10 pM MG132 (Calbiochem). Cellelysater blev analyseret ved WB som tidligere beskrevet.

Resultater Salg

1. E-cadherin strukturelle modeller

Der er få menneskelig E-cadherin (HE-cad) strukturer til rådighed, og de kun dækker små portioner af proteinet (tabel S1). Brug automatisk søgning af schweizisk Model Repository, fandt vi, at FBF 1L3W, kommenteret for den fulde længde ekstracellulære domæne af Xenopus EP-cadherin (EP-cad), er meget homologe til det samme domæne i humant E-cadherin. Vi analyserede sekvenshomologi ved alignment ved hjælp af M-kaffe, en tilpasning multipel sekvens, der kombinerer produktionen af ​​adskillige flere sekvens alignment pakker (PCMA, POA, Mafft, Muskel, T-kaffe, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Figur 1A viser opstillingen af ​​de to ekstracellulære domænesekvenser. De røde mursten regioner repræsenterer perfekt enighed blandt de anvendte metoder, der repræsenterer meget lignende sekvenser. At opbygge den model, vi fjernede regioner med nogen lighed (figur 1A, stjerner), og begrænsede modellen til områder med pålidelig justering (sort pil, figur 1A). Xenopus struktur blev humaniseret som beskrevet i Materialer og Metoder og figur 1B viser den strukturelle tilpasning af HE-cad EC1-EC2 domæner (fra FBF 2O72) og EC1-EC2 domæner af Xenopus afledte strukturelle model. De to strukturer er næsten overlejret, hvilket viser, at ligheden mellem de ekstracellulære domæner af humant E-cadherin og Xenopus EP-cadherin er ikke kun på sekvensen, men også på det strukturelle niveau. Den model af menneskelig E-cad udviser kompatible energier med strukturen fra Xenopus, med et mindre fald på fri energi (AG) opnået i modellen (AG

real = 559,99 kcal /mol og AG

model = 531,77 kcal /mol), hvilket viser, at humanisering ikke indfører ekstra sammenstød. For nylig blev en struktur af muse ekstracellulære domæne frigivet (PDB 3Q2V, tabel S1), og vi brugte også denne struktur som en model, som en måde at forbedre de opnåede resultater med Xenopus model.

A) sekvens alignment af de ekstracellulære domæner af humant E-cad og Xenopus EP-cad. De ekstracellulære sekvenser blev opnået i UniProt med de tilsvarende referencer (human E-cadherin, P12830; Xenopus EP-cadherin, P33148). M-Coffee regelmæssig blev anvendt til at udføre justeringen, en pakke, der kombinerer forskellige alignment metoder. Røde mursten regioner er i perfekt aftale på tværs af alle de metoder, grønne og gule regioner er regioner i nogen aftale mellem de forskellige justering metoder. Den gennemsnitlige konsistens score opnåede 98, bekræfter pålideligheden af ​​linjeføringen. De blå stjerner identificerer de aminosyrer, der blev fjernet fra 1L3W struktur før humanisere. Den sorte pil angiver afslutningen af ​​den strukturelle model opnået. B) Det humane struktur domæner EC1-EC2 (PDB 2O72, blå) blev på linie med de samme domæner af det humane model genereres fra Xenopus struktur (PDB 1L3W, rød). Billede oprettet med PyMOL. C) Skematisk repræsentation af menneskelige E-cadherin domæner, fremhæver dækningen af ​​de tre forskellige strukturelle modeller opnået med FoldX (modeller af prodomænet, ekstracellulære domæne og Catenin bindende domæne).

Vi har etableret to andre modeller, der dækker prodomænet (PDB 1OP4, fra muse N-cadherin) og β-catenin cytoplasmatiske domæne (PDB 1I7X, fra muse E-cadherin) under anvendelse af samme metode. Alt i alt, de tre modeller dække det meste af proteinstruktur (Figur 1C): prodomænet model omfatter positioner 28-117, de ekstracellulære modeller positionerne 155-697 og β-catenin cytoplasmatiske domæne omfatter 782-838. På niveau med juxtamembrandomænet, er en struktur kommenteret, der omfatter det interagerende overflade mellem E-cadherin og p120 [28]. Denne struktur indeholder en lille, 18 aminosyrer langt peptid (dækker positionerne 756-773 om HE-cad), med meget lav strukturel indhold, faktorer, der mindsker pålideligheden af ​​energiberegninger, så vi kasseret denne struktur fra analysen.

2.

I silico

forudsigelse af virkningen af ​​cancer-associeret E-cadherin USVs

E-cadherin mutationer er ikke kun den genetiske årsag til HDGC, men de er også ofte findes i forskellige typer af sporadisk cancere. Vi analyserede

i silico

virkningen af ​​alle cancer-associeret E-cadherin missense mutationer, lokalisere til regioner omfattet af de strukturelle modeller genereret: 22 germlinie mutationer findes i indstillingerne for HDGC og EODGC, og 57 findes i sporadiske cancere. Kimlinie E-cadherin USVs blev indsamlet fra litteraturen, og nogle er personlig kommunikation i vores laboratorium. Nogle HDGC /EODGC mutationer er ikke muligt at modellere, på grund af manglende strukturel information (for eksempel dem, lokaliseret i juxtamembrandomænet af E-cadherin), og blev ikke medtaget i denne analyse. Somatiske mutationer blev indsamlet fra Cancer Genome Project database, og indeholder mutationer findes i mave- og luftrør brystkræft (de eneste to former for kræft forbundet til HDGC), men også andre former for kræft, såsom synovial sarkom eller galdegang carcinom (Tabel S2 ).

Brug de strukturelle modeller tidligere beskrevne, vi brugte FoldX at generere hver af kræft forbundet USVs, og evalueret deres native-state stabilitet, AG (almindeligvis benævnt som total energi til enkelhed) [20]. Den energiske forskel mellem WT reference og den tilsvarende mutant (AAG = AG

WT-AG

Mut) blev beregnet for de 22 HDGC /EODGC E-cadherin USVs lokaliseret til de regioner, der er omfattet af modellen strukturer, og resultaterne er anført i tabel 1. Når AAG er negativ, afspejler dette en gevinst på nativ-state stabilitet i mutante form; når den er positiv, betyder det, at mutanten er mindre stabil derefter WT reference. Tidligere undersøgelser i andre proteiner har vist, at stabilitet ændringer beregnet med FoldX algoritme under 0,8 kcal /mol er inden fejlen ændring af softwaren, og anses derfor for at være ikke-signifikant [21]. Følgelig vi kun betragtes mutationer for at være destabiliserende når de inducerer ændringer energi over 0,8 kcal /mol. I figur 2A, mutationer over ordningen er destabiliserende, mens de nederste dem er strukturelt tolereres. Det er klart, destabiliserende mutationer spead langs proteinet, med ikke favoriseres domæne påvirket.

A) Skematisk repræsentation af E-cadherin-domæner, kortlægning alle de modellerede kimlinie mutationer fundet i fastsættelsen af ​​HDGC eller EODGC. Over ordningen er de mutationer, der resulterede i destabilisering, som forudsagt af FoldX (AAG 0,8 kcal /mol) og under ordningen alle de ikke-destabiliserende mutationer (AAG 0,8 kcal /mol). De nyligt identificerede mutationer er understreget. B) FoldX og SIFT blev brugt til at evaluere virkningen af ​​mutationerne til stede i A) og forudsigelserne blev klassificeret som: sand positiv (TP), når softwaren forudsiger høj effekt og mutanterne udviser in vitro tab af funktion; Sand negativ (TN), når softwaren forudsiger nogen indvirkning og mutanten er funktionelt in vitro; Falsk positiv (FP), når softwaren forudsiger stor gennemslagskraft, men mutanterne er funktionel in vitro; og False Negative (FN), når softwaren forudsiger ingen indvirkning, og mutanterne udstiller in vitro tab af funktion. Resultaterne fra begge prædiktorer resulterer i 70% overlapning med E-cadherin testet in vitro (TP + TN) proteinfunktion. C) Box-plot repræsenterer medianen og interkvartile intervaller af de indfødte-state stabilitet ændringer (AAG) af de destabiliserende og ikke-destabilisere mutationer, som forudsagt af FoldX. D) Box-plot repræsenterer medianen og interkvartile intervaller af alderen mavekræft afsløring eller associeret dødsfald, svarende til de destabiliserende og ikke-destabilisere mutationer luftfartsselskaber. Alle data blev indsamlet fra litteraturen. Gruppen af ​​patienter huser destabiliserende mutationer er kendetegnet ved en klar yngre alder af diagnose eller død, tyder bidrag E-cadherin destabilisering for sygdommen fænotype.

prodomænet af HE-cad spaltes under modning, og hvis dette ikke sker, er E-cadherin klæbende funktion svækket [29], [30]. For mutationerne lokaliseret på dette område, vi evaluerede virkningerne i den samlede energi med FoldX, bevarelse med SIFT, og også vurderet, om indgrebet i prodomænet spaltningsstedet med prop (detaljer i materialer og metoder). Vi fandt, at både arvelig (G62V og T118R) og sporadisk (P30T, G62D, H92Y, H121R og H123Y) mutationer lokaliseret i E-cadherin prodomænet strukturelt tolereres, som forudsagt af FoldX (tabel S3). Når vi analyserer konsekvenserne baseret på bevarelse hjælp SIFT, vi fandt også, at ingen af ​​mutationerne blev betragtet skadelig, fordi deres grad af bevaring er lav (tabel S3). Disse resultater indikerer, at patogeniciteten af ​​E-cadherin USVs lokaliseret i prodomænet sandsynligvis ikke afhængig af destabilisering. Vi fandt heller ikke nogen virkning på spaltningen af ​​propeptidet, som forudsagt af PROP (data ikke vist). Mener vi derfor, at patogenicitet E-cadherin mutationer på dette område kan skyldes interferens med docking af proteiner involveret i prodomænet behandling, umuligt at forudsige

i silico

.

Arvelig E -cadherin USVs spænder den fulde længde af det ekstracellulære domæne, mens sporadiske mutationer findes i overvejende grad i EC2-EC3, som i overensstemmelse med den tidligere beskrevne i exoner hotspot 7-9 [5]. Fra de samlede 18 kimlinie HDGC /EODGC mutationer lokaliseret på dette område, fandt vi, at 10 har en betydelig strukturel indvirkning på protein (tabel 1). Cirka halvdelen af ​​de sporadiske mutationer også destabiliserer (tabel S3), uafhængigt af EF domæne, hvor de er lokaliseret, hvilket tyder på, at native-state destabilisering kan være forbundet til en væsentlig del af sporadiske kræftformer involverer E-cadherin tab for punkt mutation.

Kun tre mutationer er lokaliseret i området kortlagt af modellen for den cytoplasmatiske β-catenin bindende domæne (P799R, V832M, S838G): de to første identificeret i HDGC /EODGC indstilling og den anden sporadisk, fundet i æggestok carcinom [31]. For disse mutationer analyserede vi bindingsenergien mellem E-cadherin og β-catenin og fundet, at ingen af ​​dem i væsentlig grad ændrer bindingsaffinitet β-catenin, ifølge FoldX forudsigelse. Dette er i overensstemmelse med

in vitro

resultater, som viser, at den arvelige mutation V832M effektivt binder β-catenin, og dens patogenicitet synes at være afhængig af den manglende evne af E-cadherin /β-catenin-komplekset at binde α catenin [32], [33].

Vi indsamlede alle forudsigelser og funktionel

in vitro

data HDGC /EODGC mutationer og analyseret pålideligheden af ​​de anvendte indikatorer (tabel 1). Vi klassificeret resultaterne fra forudsigelserne som: sand positiv (TP), når mutationen er forudsagt som skadelig

i silico

(enten ved FoldX eller finkæmme) og udviser tab af funktion

In vitro

; Ægte Negative (TN), når mutationen er forudsagt som tolereres

i silico

og er funktionel

In vitro

; Falsk positiv (FP), når mutationen er forudsagt som skadelig

i silico

men er funktionel

In vitro

; og False Negative (FN), når mutationen er forudsagt som tolereres

i silico

men udstiller

in vitro

tab af funktion. TP og TN er positive resultater, hvilket betyder, at de prædiktorer er i stand til at detektere mutationen effekt i funktion; FP og FN repræsenterer deres grad af svigt. Vi fandt, at begge algoritmer er i stand til at forudsige den funktionelle virkning af op til 70% af kimlinie HDGC /EODGC mutationer (11 ud af 16 mutationer), med forudsigelser overlappende for halvdelen af ​​mutationerne (tabel 1, figur 2B).

vi analyserede data for de kimlinie HDGC /EODGC mutationer luftfartsselskaber og selv om oplysningerne er begrænset, fandt vi, at det mest komplette sæt af data er den alder debut eller død i forbindelse til DGC. Når vi box-plot disse data, gruppering “destabilisere” og “Ikke-destabilisere” mutation luftfartsselskaber, vi observerer en tydelig yngre alder af sygdommens debut (diagnose eller død) for den første gruppe (figur 2D), hvilket antyder, at native-state destabilisering regnskab for den tidligere udvikling af DGC.

3. Biologisk betydning af E-cadherin destabilisering

For at bestemme den biologiske betydning af E-cadherin destabilisering, vi brugte som modelsystem tre nyligt identificerede E-cadherin kimlinie missense mutationer indberettet til vores laboratorium til funktionel karakterisering: E185V, S232C og L583R, den senere nylig beskrevet i litteraturen [22].

in silico

analyse beskrevet tidligere blev udført for disse tre nye mutationer, og resultaterne er medtaget i tabel 1 (under mørk linie). Mutationer E185V og S232C er strukturelt tolereres, med AAG = 0,29 kcal /mol og -0,9 kcal /mol (Tabel 1), anses for ubetydelige om konsekvenserne i strukturen. Mutation S232C fremmer et fald i energi, stabilisere proteinet, og det er på grund af tabet af den høje energi af en serin begravet OH-gruppe, som ikke er involveret i en H-binding, og til indkvartering af sidekæden af ​​cystein. Mutation L583R inducerer destabilisering, med AAG = 2,72 kcal /mol, hvilket afspejler den dramatiske ændring fra en hydrofob og hydrofil aminosyre, som resulterer i en arginin ikke stand til at danne H-bindinger, idet ufordelagtigt begravet.

I

n vitro

funktionelle assays blev udført for de ovennævnte HDGC /EODGC mutationer, og vi fandt en perfekt sammenhæng mellem funktionalitet

in vitro

og tilstedeværelse /fravær af strukturelle virkninger: E185V og S232C bevarer den klæbende funktion af E-cadherin, og er i stand til at danne tætte cellulære aggregater, mens L583R udviser en klar spredt mønster, der ligner Mock celler (figur 3A), hvilket viser, at E185V og S232C er ikke-patogene og L583R er patogen.

CHO-celler blev forbigående (A) eller stabilt (B-C) transficeret med en tom vektor (Mock) eller WT, E185V, S232C, L583R E-cadherin cDNA. A) Funktionel aggregation assay blev udført som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. L583R celler viser E-cadherin tab af funktion, hvilket resulterer i et spredt mønster, der ligner Mock celler. AAG blev beregnet under anvendelse FoldX algoritme og er 0 for WT henvisning; B) Totale cellelysater blev fremstillet og E-cadherin blev påvist ved Western-blot under anvendelse af anti-E-cadherin antistof. Anti-α-tubulin-antistof blev anvendt som en loading kontrol. Ekspressionen af ​​L583R reduceres og lægges ind højere molekylvægt, der indikerer tilbageholdes som umodne (ca. 130 kDa). C) E-cadherin-ekspression i plasmamembranen (PM) blev evalueret under anvendelse af flowcytometri, efter farvning med et ekstracellulært anti-humant E-cadherin antistof. L583R er mindre udtrykt i PM.

Når vi analyserede E-cadherin udtryk i forskellige cellelinjer, fandt vi, at den samlede mængde af mutant L583R er lavere, at WT udtryk under de samme betingelser, mens mutationer E185V og S232C, fastholde normale niveauer (figur 3B). Interessant er båndet svarende til L583R tilbageholdes i gelen, hvilket viser, at L583R er ikke i stand til korrekt modne (umoden form af E-cadherin er 130 kDa, moden er 120 kDa) og flowcytometri resultater viser, at det er mindre udtrykt i plasmamembranen (figur 3C).

Når protein modning mislykkes, dette ofte resulterer i endoplasmatisk reticulum (ER) tilbageholdelse af umodne protein.